Sel DH5-Alpha

Sel DH5-Alpha adalah strain bakteri E. coli yang direkayasa untuk efisiensi transformasi dan kualitas DNA yang tinggi. Strain ini banyak digunakan dalam biologi molekuler untuk kloning dan perbayakan plasmid. DH5-Alpha adalah turunan dari galur E. coli K-12 yang memiliki mutasi spesifik membuatnya lebih efisien dalam menerima dan memelihara plasmid. Mutasi spesifik pada sel DH5-Alpha, diantaranya recA1, endA1, dan lacZΔM15, yang meningkatkan kemampuan plasmid untuk terserap oleh sel, mencegah degradasi plasmid, dan memungkinkan seleksi biru-putih untuk keberhasilan kloning.

Dalam sistem kloning, daerah multiple cloning site (MCS) biasanya ditempatkan di dalam sekuens lacZ pada plasmid. Jika fragmen DNA target disisipkan ke dalam daerah MCS tersebut, maka sekuens lacZ akan terputus, sehingga sintesis β-galaktosidase tidak berlangsung sempurna dan koloni bakteri akan tampak berwarna putih. Sebaliknya, apabila tidak ada DNA yang disisipkan ke dalam MCS, gen lacZ tetap utuh dan mampu menghasilkan enzim β-galaktosidase yang aktif, sehingga koloni akan berwarna biru.

 Mutasi E. coli DH5-Alpha 
 Mutasi recA1 biasanya terlibat dalam perbaikan DNA dan rekombinasi homolog. Dengan adanya mutasi ini, kemampuan sel untuk melakukan rekombinasi DNA homolog menjadi terganggu. Gannguan ini meningkatkan stabilitas plasmid selama proliferasi sel, karena plasmid tidak mengalami rekombinasi dengan kromosom inang atau plasmid lain. Hal Ini juga mengurangi degradasi DNA plasmid selama proses isolasi, menghasilkan DNA plasmid berkualitas tinggi yang cocok untuk kloning.
 Mutasi endA1 mencegah sel memecah DNA yang disisipkan, sehingga menghasilkan plasmid yang lebih stabil. Mutasi endA1 menonaktifkan enzim yang biasanya mendegradasi DNA plasmid, menghasilkan DNA plasmid berkualitas lebih tinggi setelah mini-prep. Gen endA1 berperan dalam kode enzim nuklease I, apabila gen ini dimutasi menyebabkan penurunan atau hilangnya aktivitas enzim. 
 Mutasi lacZΔM15 membuatnya kompatibel dengan penyaringan biru-putih, teknik umum untuk mengidentifikasi secara visual koloni bakteri yang telah berhasil mengambil plasmid dengan sisipan yang diinginkan. Mutasi gen lacZΔM15 merupakan perubahan genetik pada bakteri E. coli yang menyebabkan sebagian gen lacZ terhapus, sehingga protein β-galaktosidase yang dihasilkan menjadi tidak utuh atau kehilangan aktivitasnya. Mutasi ini berperan penting dalam metode seleksi biru-putih (blue-white screening), yakni teknik identifikasi keberhasilan proses kloning. sSel inang yang membawa mutasi lacZΔM15 dapat dibedakan berdasarkan warna koloni yang muncul setelah penambahan substrat X-gal dan induktor IPTG. Koloni berwarna putih umumnya menunjukkan keberhasilan penyisipan fragmen DNA interest, sedangkan koloni biru menandakan tidak adanya sisipan DNA pada plasmid pada sel bakteri.
Pada sistem blue-white screening, sel inang yang digunakan umumnya memiliki mutasi lacZΔM15, yaitu mutasi yang menyebabkan gen lacZ kehilangan sebagian sekuensnya. Kehilangan sekuens ini menyebabkan sel inang hanya mampu menghasilkan fragmen β-galaktosidase yang tidak aktif, dikenal sebagai α-peptida. Vektor kloning dirancang sedemikian rupa sehingga daerah penyisipan DNA target berada di dalam sekuens yang mengkode α-peptida tersebut. Saat fragmen DNA target berhasil disisipkan ke dalam vektor, proses tersebut akan menginduksi pembentukan α-peptida. Jika kloning berhasil dilakukan, penyisipan DNA target akan menghentikan sintesis α-peptida, sehingga tidak terbentuk enzim β-galaktosidase aktif. Ketika koloni bakteri hasil transformasi ditumbuhkan pada media yang mengandung X-gal, tidak terjadi pemecahan substrat, dan koloni tampak berwarna putih. Proses sebaliknya terjadi jika kloning tidak berhasil dan tidak ada DNA interest tersisipkan, maka vektor tetap menghasilkan α-peptida yang lengkap. Fragmen tersebut akan berinteraksi dengan fragmen β-galaktosidase yang terdapat pada sel inang, membentuk enzim aktif yang mampu menghidrolisis X-gal dan menghasilkan warna biru pada koloni Manfaat Skrining biru-putih adalah cara cepat dan mudah untuk membedakan koloni bakteri yang berhasil mengalami transformasi dengan DNA rekombinan (putih) dan yang tidak (biru).

 Referensi