כימיה קומבינטורית

כימיה קומבינטורית (באנגלית: Combinatorial chemistry) כוללת בתוכה שיטות כימיות סינתטיות המאפשרות להכין מספר גדול (עשרות, אלפים ואף מיליונים) של תרכובות בתהליך אחד. ספריות התרכובות האלו יכולות להיווצר כתערובות, כקבוצות של תרכובות נפרדות או כמבנים כימיים שנוצרו באמצעות תוכנת מחשב. כימיה קומבינטורית יכולה לשמש גם לסינתזה של מולקולות קטנות וגם של פפטידים.

אסטרטגיות שמאפשרות לזהות רכיבים שימושיים מתוך הספריות הן גם חלק מהכימיה הקומבינטורית. השיטות הנהוגות בכימיה קומבינטורית מיושמות גם מחוץ לתחום הכימיה.

 מבוא 
בצורתה המודרנית, לכימיה קומבינטורית ככל הנראה הייתה ההשפעה הגדולה ביותר בתעשיית התרופות. חוקרים המנסים לייעל את פרופיל הפעילות של תרכובת יוצרים 'ספרייה' של תרכובות רבות ושונות אך קשורות זו לזו. ההתקדמות בתחום הרובוטיקה הובילה לגישה תעשייתית בסינתזה קומבינטורית, המאפשרת לחברות לייצר באופן שגרתי למעלה מ-100,000 תרכובות חדשות וייחודיות בשנה.Jeffrey W. Noonan et al. "Advancing Parallel Solution Phase Library Synthesis through Efficient Purification, Quantitation, and Characterization Techniques"  Journal of Laboratory Automation, 48 (1992) 3789].

כדי להתמודד עם המספר העצום של האפשרויות המבניות, חוקרים יוצרים לעיתים קרובות 'ספרייה וירטואלית', כלומר, רשימה חישובית של כל המבנים האפשריים של פארמקפור נתון עם כל המגיבים הזמינים.E. V.Gordeeva et al. "COMPASS program - an original semi-empirical approach to computer-assisted synthesis"  Tetrahedron, 48 (1992) 3789]. ספרייה כזו יכולה להכיל אלפים עד מיליוני תרכובות 'וירטואליות'. החוקר יבחר תת-קבוצה של 'הספרייה הווירטואלית' לסינתזה בפועל, בהתבסס על חישובים וקריטריונים שונים (ראו ADME, כימיה חישובית ו-QSAR).

בשנת 1996, במרכז המחקר הפרמצבטי של Parke-Davis, המדען אנתוני צ'ארניק הוביל מחקר ודיווח על השימוש הראשון באוטומציה בסינתזה של ספריות תרכובות. כעורך המייסד של כתב העת לכימיה קומבינטורית של האגודה האמריקאית לכימיה (ACS), הוא גם הוביל מחקר על תגי RFID למיון ממוקד בסינתזה של ספריות תרכובות.

 פולימרים (פפטידים ואוליגונוקלאוטידים) 
 סינתזה קומבינטורית של פיצול-ערבוב (split and pool) 
סינתזה קומבינטורית בשיטת פיצול ערבובFurka Á, Sebestyén F, Asgedom M, Dibó G. Cornucopia of peptides by synthesis. In Highlights of Modern Biochemistry, Proceedings of the 14th International Congress of Biochemistry. VSP.Utrecht.1988; 5; p. 47.Á. Furka, F. Sebestyen, M. Asgedom, G. Dibo, General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures. Int. J. Peptide Protein Res., 1991, 37, 487-493. מבוססת על סינתזה בפאזה מוצקה שפותחה על ידי ברוס מריפילד. אם מסנתזים ספריית פפטידים קומבינטורית באמצעות 20 חומצות אמינו (או סוגים אחרים של אבני בניין) התמיכה המוצקה של החרוזים מחולקת ל-20 חלקים שווים. לאחר מכן, מוצמדת חומצת אמינו שונה לכל חלק. השלב השלישי הוא ערבוב כל המנות. שלושת השלבים הללו מהווים מחזור. אפשר להאריך את שרשראות הפפטיד פשוט על ידי חזרה על המחזור הזה שוב ושוב.
ימין|ממוזער|286x286 פיקסלים|דיאגרמת זרימה של הסינתזה הקומבינטורית בשיטת ״פיצול-ערבוב״

ההליך מומחש על ידי סינתזה של ספריית דיפפטיד באמצעות אותן שלוש חומצות אמינו כאבני בניין בשני המחזורים. כל רכיב של ספרייה זו מכיל שתי חומצות אמינו המסודרות בסדר שונה. חומצות האמינו המשמשות בחיבורים מיוצגות על ידי עיגולים צהובים, כחולים ואדומים באיור. חיצים מתפצלים מציגים חלוקת שרף תמיכה מוצק (עיגולים ירוקים) לחלקים שווים, חיצים אנכיים פירושם צימוד וחצים מתכנסים מייצגים ערבוב של חלקי התמיכה.

האיור מראה שבשני המחזורים הסינתטיים נוצרים 9 דיפפטידים. במחזור השלישי והרביעי ייווצרו 27 טריפפטידים ו-81 טטרפפטידים, בהתאמה.שמאל|ממוזער|278x278 פיקסלים|פפטידים נוצרים במחזורים 3 ו-4

ל"סינתזה בשיטת ״פיצול-ערבוב" יש כמה תכונות יוצאות דופן:

 זו שיטה יעילה מאוד. כפי שהאיור מדגים, מספר הפפטידים הנוצרים בתהליך הסינתטי (3, 9, 27, 81) עולה בצורה מעריכית עם מספר המחזורים המבוצעים. בשימוש ב-20 חומצות אמינו בכל מחזור סינתטי, מספר הפפטידים שנוצרו הוא: 400, 8,000, 160,000 ו-3,200,000, בהתאמה. המשמעות היא שמספר הפפטידים גדל בצורה מעריכית כשמבצעים יותר מחזורים.
 כל רצפי הפפטידים האפשריים שמורכבים מהשילובים של החומצות שהשתמשו בהן במחזורים - נוצרים במהלך התהליך.
 החלוקה של תומך המוצק למדגמים שווים מבטיחה שכל מרכיבי הספרייה ייווצרו בכמויות מולקולריות כמעט שוות.
 על כל חרוז נוצר פפטיד יחיד בלבד. זו התוצאה של שימוש בחומצת אמינו אחת בלבד בכל שלב של הצימוד. אולם, לא ידוע מראש מהו הפפטיד הנמצא על כל חרוז ספציפי.
 ניתן להשתמש בשיטת הפיצול-ערבוב לסינתזה של תרכובות אורגנית או כל סוג אחר של ספרייה שניתן להרכיב אותה בשלבים מאבני בניין.
בשנת 1990 שלוש קבוצות תיארו שיטות להכנת ספריות פפטידים בשיטות ביולוגיות.J. J. Devlin, L. C. Panganiban and P. E. Devlin Science 1990, 249, 404. שנה לאחר מכן, פודור ועמיתיו פרסמו שיטה יוצאת דופן לסינתזה של מערכי פפטידים על שקופיות זכוכית קטנות.Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D, 1991. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251, 767-73. שיטת "סינתזה מקבילית" פותחה על ידי מריו גייסן ועמיתיו לצורך הכנת מערכי פפטידים.H. M. Geysen, R. H. Meloen, S. J. Barteling Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3998. הם סינתזו 96 פפטידים על מוטות פלסטיק (סיכות) המצופים בקצותיהם בתומך מוצק. המוטות הוטבלו בתוך תמיסות ריאגנטים שהונחו בבארות של צלחת מיקרוטיטר. השיטה מיושמת באופן נרחב במיוחד באמצעות סינתיסייזרים אוטומטיים לסינתזה מקבילית. למרות שהשיטה המקבילית איטית יותר מהשיטה הקומבינטורית האמיתית, היתרון שלה הוא שידוע בדיוק איזה פפטיד או תרכובת נוצרת על כל מוט.

פותחו שיטות נוספות שמטרתן לשלב את היתרונות של סינתזת פיצול-ערבוב ושל סינתזה מקבילית. בשיטה שתוארה על ידי שתי קבוצות מחקר,E. J. Moran, S. Sarshar, J. F. Cargill, M. Shahbaz, A Lio, A. M. M. Mjalli, R. W. Armstrong J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10787.K. C. Nicolaou, X –Y. Xiao, Z. Parandoosh, A. Senyei, M. P. Nova Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 36, 2289. התומך המוצק הוכנס לתוך כמוסות פלסטיק חדירות יחד עם תג זיהוי בתדר רדיו (RFID) שנשא את הקוד של התרכובת שאמורה להיווצר באותה כמוסה. התהליך בוצע בדומה לשיטת הפיצול-ערבוב, אך בשלב הפיצול, הכמוסות חולקו לכלי התגובה בהתאם לקודים שנקראו מתגי ה-RFID של הכמוסות.

שיטה שונה לאותה מטרה פותחה על ידי פורקה ועמיתיוÁ. Furka, J. W. Christensen, E. Healy, H. R. Tanner, H. Saneii J. Comb. Chem. 2000, 2, 220. שכינו אותה "סינתזת מחרוזת". בשיטה זו, הכמוסות לא נושאות קוד. הן מושחלות כמו חרוזים על מחרוזת ומוכנסות לכלי התגובה כשהן במבנה של מחרוזת. זהות הכמוסות, כמו גם תכולתן, נשמרת לפי המיקום שלהן על גבי המחרוזת. לאחר כל שלב של צימוד, הכמוסות מחולקות מחדש למחרוזות חדשות בהתאם לכללים מוגדרים מראש.

 מולקולות קטנות 
בתהליך גילוי התרופות, הסינתזה וההערכה הביולוגית של מולקולות קטנות בעלות עניין היו בדרך כלל תהליך ארוך ומייגע. בשנים האחרונות, הכימיה הקומבינטורית צמחה כגישה המאפשרת סינתזה מהירה ויעילה של מספר רב של מולקולות קטנות פוטנציאליות כתרופות. בסינתזה טיפוסית, רק מולקולת מטרה אחת מיוצרת בסיום תהליך הסינתזה, כאשר בכל שלב מתקבל תוצר אחד בלבד. לעומת זאת, בסינתזה קומבינטורית, גם כאשר משתמשים בחומר מוצא יחיד בלבד, ניתן לסנתז ספרייה גדולה של מולקולות בתנאי תגובה זהים, אשר לאחר מכן ניתן לבדוק את הפעילות הביולוגית שלהן. מאגר זה של תוצרים מחולק לשלושה חלקים שווים, שכל אחד מהם מכיל את שלושת התוצרים. לאחר מכן, כל אחד משלושת המאגרים הנפרדים מגיב עם יחידה נוספת של מגיב B, C או D, וכך מקבלים 9 תרכובות ייחודיות מתוך ה-3 הקודמות. תהליך זה חוזר על עצמו עד להוספת המספר הרצוי של אבני הבניין, וכך נוצרת כמות רבה של תרכובות. בעת סינתזה של ספריית תרכובות בתהליך סינתזה רב-שלבי, יש להשתמש בשיטות תגובה יעילות, ואם משתמשים בשיטות טיהור מסורתיות לאחר כל שלב תגובה, התפוקות והיעילות ייפגעו.

הסינתזה במצב מוצק מציעה פתרונות פוטנציאליים לביטול הצורך בשלבי כיבוי (quenching) וטיהור טיפוסיים הנהוגים לעיתים קרובות בכימיה סינתטית. באופן כללי, מולקולת המוצא נקשרת לתומך מוצק (בדרך כלל פולימר בלתי מסיס), ואז מתבצעות תגובות נוספות, והמוצר הסופי מטוהר ולאחר מכן מנותק מהתומך המוצק. מכיוון שהמולקולות הרצויות קשורות לתומך מוצק, ניתן לצמצם את תהליך הטיהור לאחר כל תגובה לשלב פשוט של סינון/שטיפה, ובכך לבטל את הצורך בשלבים מייגעים כמו מיצוי נוזל-נוזל ואידוי ממסים, שהם חלק עיקרי ברוב תהליכי הסינתזה הכימית. בנוסף, על ידי שימוש בריאגנטים הטרוגניים, ניתן להשתמש בעודף מגיבים כדי להוביל תגובות איטיות לסיום מלא, מה שיכול לשפר עוד יותר את הניצולת. את עודפי המגיבים ניתן פשוט לשטוף מבלי צורך בשלבי טיהור נוספים כמו כרומטוגרפיה.
ממוזער|שימוש בפוליאמין הנתמך במוצק כדי לנקות ריאגנט עודף
במהלך השנים פותחו מגוון שיטות לשיפור השימוש בסינתזה אורגנית במצב מוצק במסגרת כימיה קומבינטורית, לרבות מאמצים להגברת נוחות הסינתזה והטיהור, וכן שיטות לא מסורתיות לאפיון תוצרי ביניים. למרות שברוב הדוגמאות המתוארות כאן משתמשים בסביבות תגובה הטרוגניות בכל שלבי התגובה, בות' והודג'ס מציגים דוגמה מוקדמת לשימוש בריאגנטים הקשורים לתמך מוצק רק במהלך שלב הטיהור של סינתזות מסורתיות במצב תמיסה. לשיטתם, לכימיה במצב תמיסה יש יתרונות בכך שאפשר להימנע מהצורך בביצוע תגובות קישור וניתוק הדרושות לעיגון והסרה של מולקולות מהתמיכה, וכן אין צורך לפתח מקבילים במצב מוצק לתגובות שכבר ידועות ומקובלות במצב תמיסה.

שלב הטיהור היחיד בסיום הסינתזה מאפשר הסרה של זיהום אחד או יותר, בהנחה שהמבנה הכימי של הזיהום ידוע. אף על פי שהשימוש בריאגנטים הקשורים לתומך מוצק מפשט מאוד את תהליך הסינתזה של תרכובות, סינתזות קומבינטוריות רבות דורשות מספר שלבים, כאשר כל שלב עדיין דורש סוג כלשהו של ניקוי. ארמסטרונג ועמיתיו מתארים שיטה של ״סיר אחד״ (one-pot) ליצירת ספריות קומבינטוריות, תגובות עיבוי מרובות-רכיבים (multiple-component condensations – MCCs). במסגרת שיטה זו, שלושה מגיבים או יותר מגיבים כך שכל אחד מהם משולב בתוצר הסופי בשלב יחיד, וכך מבטל את הצורך בסינתזה רב-שלבית הכוללת שלבי ניקוי רבים. ב-MCCs, אין צורך בתהליך של דה-קונבולציה (פירוק והרכבה מחדש) כדי לזהות אילו תרכובות פעילות ביולוגית מכיוון שבכל סינתזה במערך מתקבל רק תוצר אחד, ולכן זהות התרכובת אמורה להיות ידועה באופן חד משמעי.
ממוזער|דוגמה לצבע נתמך בתמך מוצק לצורך איתות על קישור ליגנד
בסינתזה אחרת של מערך, סטיל יצר ספרייה גדולה של אוליגופפטידים באמצעות סינתזת פיצול (split synthesis). החיסרון בייצור של אלפי תרכובות הוא הקושי בזיהוי המבנה של התרכובות שנוצרו. הפתרון שהוצע הוא שימוש בתגיות מולקולריות, כמות זעירה (1 פיקומול לכל חרוז) של צבע מחוברת לחרוזים, וזהות של חרוז מסוים ניתנת לזיהוי על ידי ניתוח אילו תגיות קיימות עליו. על אף שהצמדת תגיות הופכת את תהליך זיהוי הקולטן לפשוט יחסית, לא ניתן לסרוק כל תרכובת בנפרד כדי לבדוק את יכולת הקישור שלה לקולטן. לכן, צבע חובר לכל קולטן, כך שרק קולטנים שנקשרים לסובסטרט שלהם יגרמו לשינוי בצבע.

 סריקה ופענוח 

 ספריות קומבינטוריות 
ספריות קומבינטוריות הן תערובות מיוחדות מרובות רכיבים של תרכובות כימיות בעלות מולקולות קטנות, המסונתזות בתהליך מדורג אחד. הן נבדלות מאוספים של תרכובות בודדות וכן מסדרות של תרכובות שהוכנו בסינתזה מקבילה. מאפיין חשוב הוא שהתערובות עצמן משמשות בתהליך הסינתזה. השימוש בתערובות מבטיח יעילות גבוהה מאוד של התהליך. שני המגיבים יכולים להיות תערובות ובמקרה זה ההליך יהיה יעיל אף יותר. עם זאת, מסיבות מעשיות, מומלץ להשתמש בשיטת ה״ערבוב-פיצול״, שבה אחת משתי תערובות מוחלפת באבני בניין בודדות (BBs). התערובות כה חשובות עד שאין ספריות קומבינטוריות ללא שימוש בתערובת בתהליך הסינתזה, ואם משתמשים בתערובת בתהליך, בהכרח נוצרת ספרייה קומבינטורית. סינתזת התערובת המפוצלת מתבצעת בדרך כלל באמצעות תמיכה מוצקה, אך ניתן ליישם אותה גם בתמיסה. מכיוון שמבנה הרכיבים לא ידוע, יש להשתמש בשיטות פיענוח בשלב הסריקה. אחת התכונות החשובות ביותר של ספריות קומבינטוריות היא שניתן לסרוק את כל התערובת בתהליך יחיד. תכונה זו הופכת את הספריות הללו לשימושיות מאוד במחקר תרופתי. ניתן גם לסנתז ספריות חלקיות מתוך ספריות קומבינטוריות מלאות וחלקן יכולות לשמש בתהליך הפענוח.A. Furka Sub-Library Composition of Peptide Libraries. Potential Application in Screening. Drug Development Research 33, 90-97 (1994).

 פיענוח של ספריות שנקטעו מהתומך המוצק 
אם המולקולות המסונתזות של ספרייה קומבינטורית מנותקות מהתומך המוצק, נוצרת תערובת מסיסה. בתמיסה כזו ניתן למצוא מיליוני תרכובות שונות. כאשר שיטת הסינתזה הזאת פותחה,  נראה היה בתחילה שאין אפשרות לזהות את המולקולות, ולמצוא מולקולות בעלות תכונות שימושיות. עם זאת, פותחו אסטרטגיות לזיהוי הרכיבים השימושיים כדי לפתור את הבעיה. כל האסטרטגיות הללו מבוססות על סינתזה ובדיקה של ספריות חלקיות. אסטרטגיה איטרטיבית (מחזורית) מוקדמת תוכננה על ידי פורקה בשנת 1982. השיטה פורסמה מאוחר יותר באופן בלתי תלוי על ידי ארב ועמיתיו תחת השם  "פיענוח רקורסיבי" (Recursive deconvolution).Erb E, Janda KD, Brenner S (1994) Recursive deconvolution of combinatorial chemical libraries Proc. Natl Acad Sci.USA 91; 11422-11426.ימין|ממוזער|350x350 פיקסלים|פיענוח רקורסיבי. עיגולים כחולים, צהובים ואדומים: חומצות אמינו, עיגול ירוק: תמיכה מוצקה

 פירוק רקורסיבי 
האיור הופך את השיטה לברורה להבנה. ספריית פפטידים המורכבת מ-27 חברים מסונתזת משלוש חומצות אמינו. לאחר המחזור הראשון (A) והשני (B) נשמרו דגימות בצד לפני ערבובן. תוצרי המחזור השלישי (C) מנותקים (cleaved) לפני הערבוב ולאחר מכן נבדקים לפעילות. נניח שהקבוצה שסומנה בסימן + היא הפעילה. כל החברים בקבוצה זו מכילים את חומצת האמינו האדומה בעמדת הצימוד האחרונה (CP – Coupling Position). לכן, גם הרכיב הפעיל מכיל את חומצת האמינו האדומה בעמדה זו.

בהתאם לכך, חומצת האמינו האדומה מצומדת לשלוש הדגימות שנשמרו לאחר המחזור השני (B), ליצירת הדגימות D. לאחר הניתוק (cleaving), מתקבלות שלוש דגימות E. אם לאחר בדיקה הדגימה המסומנת + היא זו שמראה פעילות, ניתן להסיק שחומצת האמינו הכחולה נמצאת בעמדת הצימוד השנייה של הרכיב הפעיל.

לאחר מכן, לשלוש הדגימות מהשלב הראשון (A) מצומדות תחילה חומצת האמינו הכחולה ואז האדומה (ליצירת F), והן נבדקות שוב לאחר ניתוק (G). אם גם כאן הרכיב המסומן + מתגלה כפעיל, אז רצף חומצות האמינו של הרכיב הפעיל נקבע ומוצג בשלב H.

 סריקה עמדתית 

סריקה עמדתית (Positional scanning) הוצגה באופן בלתי תלוי על ידי פורקה ועמיתיוFurka Á, Sebestyén F, WC 93/24517, 1993. ופיניה ועמיתיו.Pinilla C, Appel JR, Blanc P, Houghten RA (1993) Rapid identification of high affinity peptide ligands using positional scanning synthetic peptide combinatorial libraries. BioTechniques 13(6); 901-5. השיטה מבוססת על סינתזה ובדיקה של סדרות של תת-ספריות, שבהן עמדה מסוימת ברצף תפוסה על ידי אותה חומצת אמינו. האיור מציג את תשע ספריות המשנה (B1-D3) של ספריית פפטידים מלאה בת שלוש חומצות אמינו (A) שנוצרה משלוש חומצות אמינו שונות. בכל תת-ספריות יש עמדה אחת ברצף שבה מופיעה אותה חומצת אמינו בכל הרכיבים. בסינתזה של תת-ספרייה, התומך לא מחולק ורק חומצת אמינו אחת מקושרת לכל הדגימה. כתוצאה מכך, עמדה אחת תפוסה למעשה על ידי אותה חומצת אמינו בכל התרכובות של התת-ספריה. לדוגמה, בתת-ספריית B2, עמדה 2 תפוסה על ידי חומצת האמינו "הצהובה" בכל תשעת הרכיבים. אם תת-הספרייה הזו נותנת תוצאה חיובית בבדיקת סקר (screening), פירוש הדבר שגם בפפטיד הפעיל, העמדה השנייה תפוסה על ידי חומצת האמינו ה"צהובה". ניתן לקבוע את רצף חומצות האמינו על ידי בדיקת כל תשע (או לפעמים פחות) תת-הספריות.

ימין|ממוזער|400x400 פיקסלים|סריקה לפי מיקום: ספריית פפטידים טרימרים מלאה העשויה מ-3 חומצות אמינו ו-9 תת-ספריות שלהן. השורה הראשונה מציגה את מיקומי הצימוד.
שמאל|ממוזער|326x326 פיקסלים|ספרייה מלאה של טריפפטידים בת 27 חברים ושלוש ספריות חסר. העיגולים הצבעוניים הם חומצות אמינו.

 ספריות חסר 
בספריות חסרCarell TE, Winter A, Rebek J Jr. (1994) A Novel Procedure for the Synthesis of Libraries Containing Small Organic Molecules, Angew Chem Int Ed Engl 33; 2059-2061.Câmpian E, Peterson M, Saneii HH, Furka Á, (1998) Deconvolution by omission libraries, Bioorg &[ Med Chem Letters 8; 2357-2362. חומצת אמינו מסוימת חסרה בכל הפפטידים שבתערובת. האיור מציג את הספרייה המלאה ואת שלוש ספריות החסר. בחלק העליון מוצגות חומצות האמינו שהושמטו. אם ספריית החסר נותנת תוצאה שלילית, משמעות הדבר היא שחומצת האמינו שהושמטה קיימת ברכיב הפעיל.

 פירוק של ספריות קומבינטוריות קשורות 
אם הפפטידים אינם מנותקים מהתמיכה המוצקה (solid support), מדובר בתערובת של חרוזים, כאשר כל חרוז מכיל פפטיד יחיד. סמית׳ ועמיתיוJ. A. Smith J. G. R. Hurrel, S. J. Leach A novel method for delineating antigenic determinants: peptide synthesis and radioimmunoassay using the same solid support. Immunochemistry 1977, 14, 565. הראו בעבר שניתן לבדוק פפטידים גם כשהם קשורים לתומך. גישה זו שימשה גם לסריקה של ספריות פפטידים. ספריית הפפטידים הקשורה (tethered peptide library) נבדקה באמצעות חלבון מטרה מומס. החרוזים שאליהם נקשר החלבון זוהו, החלבון הוסר מהחרוז ולאחר מכן זוהה הפפטיד הקשור באמצעות ריצוף. טיילור ומורקן נקטו בגישה שונה במקצת.S. J. Taylor, J. P. Morken Thermographic Selection of Effective Catalysts from an Encoded Polymer-Bound Library Science 1998, 280, 267. הם השתמשו בתרמוגרפיה באינפרה- אדום כדי לזהות זרזים בספריות לא פפטידיות הקשורות לתומך. השיטה מבוססת על החום הנפלט מהחרוזים המכילים זרז כאשר הספרייה הקשורה טובלת בתמיסה של מצע. כאשר בוחנים את החרוזים תחת מיקרוסקופ אינפרה-אדום, החרוזים המכילים את הזרז נראים כנקודות בהירות וניתן לבחור אותם.

 ספריות קומבינטוריות מקודדות 
כאשר מדובר בספריות אורגניות לא-פפטידיות, קשה הרבה יותר לקבוע את זהות התרכובת שבחרוז, בהשוואה לספריות פפטידים. כדי להתגבר על קושי זה, פותחו שיטות שמאפשרות לצרף לחרוזים, במקביל לסינתזה של הספרייה, מולקולות שמקודדות את המבנה של התרכובת שנוצרת בחרוז. אולמאייר ועמיתיו פרסמו שיטת קידוד בינארית.Ohlmeyer MHJ, Swanson RN, Dillard LW, Reader JC, Asouline G, Kobayashi R, Wigler M, Still WC (1993) Complex synthetic chemical libraries indexed with molecular tags, Proc Natl Acad Sci USA 90; 10922-10926. הם השתמשו בתערובות של 18 מולקולות תג (tagging molecules), אשר לאחר ניתוקן מהחרוזים ניתן היה לזהותן באמצעות כרומטוגרפיית גז עם לכידת אלקטרונים (Electron Capture Gas Chromatography). סרקר ועמיתיו תיארו אוליגומרים כיראליים של אמידים פנטנואיים (COPAs) שניתן להשתמש בהם לבניית ספריות OBOC (תרכובת אחת לכל חרוז) מקודדות במסה.Sarkar M, Pascal BD, Steckler C, Aquino C., Micalizio GC, Kodadek T, Chalmers MJ (1993) Decoding Split and Pool Combinatorial Libraries with Electron Transfer Dissociation Tandem Mass Spectrometry, J Am Soc Mass Spectrom 24(7): 1026-36. קר ועמיתיו הציגו שיטת קידוד חדשנית:Kerr JM, Banville SC, Zuckermann RN (1993) Encoded Combinatorial Peptide Libraries Containing Non-Natural Amino Acids, J Am Chem. Soc 115; 2529-2531. מקשר (linker) דו-תפקודי עם הגנות אורטוגונליות (שניתן להסירן באופן עצמאי) חובר לחרוזים. קצה אחד של המקשר שימש לצימוד אבני הבניין הלא-טבעיות של הספרייה, ובקצה השני חוברו שלשות של חומצות אמינו לקידוד. אבני הבניין היו חומצות אמינו לא-טבעיות, ושלשות חומצות האמינו ששימשו לקידוד זוהו באמצעות פירוק אדמן (Edman degradation). היבט חשוב בשיטה זו היה האפשרות לנתק מהחרוזים את תרכובות הספרייה יחד עם תגי הקידוד, ובכך ליצור ספרייה מסיסה.

אותה גישה שימשה את ניקולייב ועמיתיו לקידוד באמצעות פפטידים.Nikolaiev V, Stierandová A, Krchnák V, Seligmann B, Lam KS, Salmon SE, Lebl M, (1993) Peptide-encoding for structure determination of nonsequenceable polymers within libraries synthesized and tested on solid-phase supports, Pept Res. 6(3):161-70. בשנת 1992 ברנר ולרנר הציגו שימוש ברצפי DNA כתגי קידוד לחרוזי התמיכה המוצקה, שיטה שהוכיחה עצמה כשיטת הקידוד היעילה ביותר.Brenner S, Lerner RA. (1992) Encoded combinatorial chemistry. Proc Natl Acad Sci USA 89; 5381–5383. נילסן, ברנר וג'אנדה השתמשו גם הם בגישת קר כדי ליישם את הקידוד באמצעות DNA.Nielsen J, Brenner S, Janda KD. (1993) Synthetic methods for the implementation of encoded combinatorial chemistry. Journal of the American Chemical Society, 115 (21); 9812–9813. בשנות האלפיים חלו התקדמויות משמעותיות בריצוף DNA. טכניקות הדור הבא (Next Generation Sequencing) מאפשרות לרצף מספר עצום של דגימות במקביל – דבר מאוד חשוב בעת סריקה של ספריות DNA מקודדות. חידוש נוסף שתרם להצלחת הקידוד ב-DNA הוצג בשנת 2000 על ידי הלפין והארברי, כשהם ביטלו את השימוש בתמיכה מוצקה בתהליך הסינתזה בשיטת split-mix של ספריות קומבינטוריות מקודדות ב-DNA, והחליפו אותה באוליגומרים של DNA המשמשים לקידוד. בסינתזה מוצקה (solid phase split and pool), מספר התרכובות בספרייה לא יכול לעלות על מספר החרוזים. בגישה החדשנית של הלפין והארברי, המגבלה הזו בוטלה – ואפשר היה להכין מספר בלתי מוגבל כמעט של תרכובות.Harbury DR, Halpin DR (2000) WO 00/23458. לדוגמה, החברה הדנית Nuevolution סינתזה ספריית DNA מקודדת שכללה לא פחות מ־40 טריליון רכיבים!B. Halford How DNA-encoded libraries are revolutionizing drug discovery. C&EN 2017, 95, Issue 25. ספריות DNA מקודדות הן מסיסות, מה שמאפשר לבצע סריקה באמצעות קישור אפיניות יעיל. יש מחברים שמשתמשים בראשי התיבות DEL (DNA Encoded Library), ואחרים ב־DECL (DNA Encoded Combinatorial Library). האפשרות השנייה מדויקת יותר, שכן היא מדגישה את האופי הקומבינטורי של הספריות. מספר סוגים של ספריות קומבינטוריות המקודדות ב-DNA הוצגו ותוארו בעשור הראשון של האלף הנוכחי. ספריות אלו מיושמות בהצלחה רבה במחקר ופיתוח תרופות:

 סינתזה של ספריות קומבינטוריות (DNA templated synthesis) מונחית DNA תוארה בשנת 2001 על ידי גרטנר ועמיתיוGartner ZJ, Tse BN, Grubina RB, Doyon JB, Snyder TM, Liu DR (2004) DNA-Templated Organic Synthesis and Selection of a Library of Macrocycles, Science 305; 1601-1605.
 ספריות קומבינטוריות מקודדות ב-DNA עם שני פארמקופור (Dual pharmacophore DNA encoded combinatorial libraries) הומצאו בשנת 2004 על ידי מלקו ועמיתיוMelkko S, Scheuermann J, Dumelin CE, Neri D (2004) Encoded self-assembling chemical libraries Nat Biotechnol 22; 568-574.
 ניתוב מקודד על פי רצף (Sequence encoded routing) פורסם על ידי הלפין והארברי בשנת 2004.Halpin DR, Harbury PB (2004) DNA Display I. Sequence-Encoded Routing of DNA Populations, PLoS Biology 2; 1015-102.
 ספריות קומבינטוריות מקודדות ב-DNA עם פארמקופור יחיד (Single pharmacophore DNA encoded combinatorial libraries) בשנת 2008 על ידי מאנוצ'י ועמיתיוMannocci L, Zhang Y, Scheuermann J, Leimbacher M, De Bellis G, Rizzi E, Dumelin C, Melkko S, and Neri N (2008) High-throughput sequencing allows the identification of binding molecules isolated from DNA-encoded chemical libraries, Proc Natl Acad Sci USA 105;17670–17675.
 ספריות קומבינטוריות מקודדות ב-DNA שנוצרו באמצעות תגובות בנפח יוקטוליטר (yoctoliter-scale reactor) פורסמו על ידי הנסן ועמיתיו בשנת 2009Hansen MH, Blakskjær P, Petersen LK, Hansen TH, Højfeldt JW, Gothelf KV, HansenNJV (2009) A Yoctoliter-Scale DNA Reactor for Small-Molecule Evolution (2009) J Am Chem Soc 131; 1322-1327.

פרטים על הסינתזה והשימוש בהן ניתן למצוא בדף ספריית כימיקלים המקודדים על ידי DNA . לספריות קומבינטוריות מסיסות המקודדות ב-DNA יש גם חסרונות. ראשית, היתרון הנובע משימוש בתמיכה מוצקה אובד לחלוטין. בנוסף, האופי הפולי-יוני של שרשראות הקידוד של ה-DNA מגביל את היכולת להשתמש בממסים לא מימיים במהלך הסינתזה. מסיבה זו, מעבדות רבות בוחרות לפתח תגובות התואמות DNA לצורך סינתזת DECLs(ספריות קומבינטוריות מקודדות ב-DNA). לא מעט מהתגובות הזמינות כבר תוארו.Luk KC, Satz AL (2014) DNA‐Compatible Chemistry in: Goodnow Jr. RA Editor A Handbook for DNA‐Encoded Chemistry: Theory and Applications for Exploring Chemical Space and Drug Discovery, Wiley, pp 67-98.Satz AL, Cai J, Chen Y,§, Goodnow R, Felix Gruber F, Kowalczyk A, Petersen A, Naderi-Oboodi G, Orzechowski L, Strebel Q (2015) DNA Compatible Multistep Synthesis and Applications to DNA Encoded Libraries Bioconjugate Chem 26; 1623−1632.Li Y, Gabriele E, Samain F, Favalli N, Sladojevich F, Scheuermann J, Neri D (2016) Optimized reaction conditions for amide bond formation in DNA-encoded combinatorial libraries, ACS Comb Sci 18(8); 438–443.

 מדע החומרים 
תחום מדע החומרים יישם את הטכניקות של כימיה קומבינטורית לגילוי חומרים חדשים. עבודה זו התחילה על ידי פ. ג. שולץ ועמיתיו באמצע שנות התשעיםX. -D. Xiang et al. "A Combinatorial Approach to Materials Discovery" Science 268 (1995) 1738 בהקשר של חומרים זוהרים שהתקבלו על ידי קו-דיפוזיה של יסודות על מצע סיליקון. עבודתו קדמה למחקר של ג'יי ג'יי האנק בשנת 1970,J.J. Hanak, J. Mater. Sci, 1970, 5, 964-971 אך באותה תקופה לא היו זמינים הכלים הממוחשבים והרובוטיים הנדרשים להפצת השיטה. העבודה נמשכה על ידי מספר קבוצות אקדמיותCombinatorial methods for development of sensing materials, Springer, 2009. V. M. Mirsky, V. Kulikov, Q. Hao, O. S. Wolfbeis. Multiparameter High Throughput Characterization of Combinatorial Chemical Microarrays of Chemosensitive Polymers. Macromolec. Rap. Comm., 2004, 25, 253-258H. Koinuma et al. "Combinatorial solid state materials science and technology" Sci. Technol. Adv. Mater. 1 (2000) 1 free downloadAndrei Ionut Mardare et al. "Combinatorial solid state materials science and technology" Sci. Technol. Adv. Mater. 9 (2008) 035009 free download וכן על ידי חברות עם תוכניות מחקר ופיתוח נרחבות (Symyx Technologies, GE, Dow Chemical וכו'). הטכניקה שימשה רבות בקטליזה,Applied Catalysis A, Volume 254, Issue 1, Pages 1-170 (10 November 2003) ציפויים,J. N. Cawse et al., Progress in Organic Coatings, Volume 47, Issue 2, August 2003, Pages 128-135 אלקטרוניקה,Combinatorial Methods for High-Throughput Materials Science, MRS Proceedings Volume 1024E, Fall 2007 ותחומים רבים אחרים.Combinatorial and Artificial Intelligence Methods in Materials Science II, MRS Proceedings Volume 804, Fall 2004 השימוש בכלים מתאימים מתחום האינפורמטיקה הוא קריטי לצורך ניהול, אדמיניסטרציה ואחסון של כמויות המידע העצומות המתקבלות.QSAR and Combinatorial Science, 24, Number 1 (February 2005) פותחו גם סוגים חדשים של שיטות לתכנון ניסויים על מנת להתמודד בצורה יעילה עם המרחבים הניסיוניים הנרחבים שניתן לחקור באמצעות שיטות קומבינטוריות.

 ספריות מוכוונות-שונות 
למרות שכימיה קומבינטורית הייתה חלק מהותי בשלבים הראשונים של גילוי תרופות במשך יותר משני עשורים, עד כה רק תרכובת כימית אחת שסונתזה לראשונה באמצעות כימיה קומבינטורית אושרה לשימוש קליני על ידי ה-FDA (סוראפניב, מעכב מולטיקינאז המיועד לטיפול בסרטן כליות מתקדם).D. Newman and G. Cragg "Natural Products as Sources of New Drugs over the Last 25 Years" J Nat Prod 70 (2007) 461 הניתוח של שיעור ההצלחה הנמוך של הגישה מציע כי הדבר נובע מהמרחב הכימי המצומצם יחסית המכוסה על ידי מוצרי הכימיה הקומבינטורית.M. Feher and J. M. Schmidt "Property Distributions: Differences between Drugs, Natural Products, and Molecules from Combinatorial Chemistry"  J. Chem. Inf. Comput. Sci., 43 (2003) 218] כאשר השוו את תכונות התרכובות בספריות כימיה קומבינטורית לאלו של תרופות ומוצרים טבעיים שאושרו, ציינו פהר ושמידט שספריות כימיה קומבינטורית סובלות במיוחד מחוסר כירליות, כמו גם מקשיחות מבנה, שתיהן נחשבות באופן נרחב כתכונות חשובות ל״תרופתיות״. למרות שגילוי תרופות ממקורות טבעיים אינו נחשב כנראה למגמה הפופולרית ביותר בתעשיית התרופות בתקופה האחרונה, עדיין חלק גדול מתרכובות הכימיות החדשות מקורו במרכיבים טבעיים, ולכן הוצע כי ניתן לשפר את יעילות הכימיה הקומבינטורית על ידי הגברת הגיוון הכימי של ספריות הסריקה.Su QB, Beeler AB, Lobkovsky E, Porco JA, Panek JS "Stereochemical diversity through cyclodimerization: Synthesis of polyketide-like macrodiolides." Org Lett 2003, 5:2149-2152. מכיוון שכיראליות ונוקשות מבנית הן שתי התכונות החשובות ביותר שמבדילות בין תרופות מאושרות ומוצרים טבעיים לבין תרכובות מתוך ספריות קומבינטוריות, אלו שני ההיבטים שעליהם מושם הדגש במה שנקרא ספריות מוכוונות-שונות (diversity-oriented libraries) – כלומר, אוספי תרכובות השואפים לכסות את המרחב הכימי, ולא רק לייצר מספרים גדולים של תרכובות.

 תת-סיווג פטנטי 
במהדורה השמינית של סיווג הפטנטים הבינלאומי (IPC), שנכנסה לתוקף ב-1 בינואר 2006, נוצרה תת-קטגוריה מיוחדת עבור בקשות פטנט ופטנטים הקשורים להמצאות בתחום הכימיה הקומבינטורית: "C40B".

ראו גם

 קומבינטוריקה
 כימואינפורמטיקה
 ביולוגיה קומבינטורית
 גילוי תרופות

 קישורים חיצוניים 

הערות שוליים

קטגוריה:כימיה