אתר תצורה גנומית

אתר תצורה גנומית (באנגלית: Topologically associating domain (TAD)) הוא מבנה כרומוזומלי, שבו תבנית הפתיחה והסגירה של הכרומטין משותפת לקבוצת גנים באותו אזור, וגורמת לאותם גנים להיות בעלי דגם ביטוי דומה.Bonev, B. et al. Multiscale 3D Genome Rewiring during Mouse Neural Development. Cell 171, 557-572.e24 (2017). בשנת 2012 התגלו אתרי תצורה גנומית בזבוב התסיסה (דרוזופילה) וביונקים תוך שימוש ב-Hi-C - שיטת אנליזה לאיתור קרבה בין אתרים גנומיים.Sexton, T. et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell 148, 458–472 (2012).Dixon, J. R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485, 376–380 (2012). מבחינת מבנה ותפקיד ביולוגי, אתרי תצורה גנומית שמורים ברמה גבוהה לאורך האבולוציהKrefting, J., Andrade-Navarro, M. A. & Ibn-Salem, J. Evolutionary stability of topologically associating domains is associated with conserved gene regulation. BMC Biol. 16, 1–12 (2018).. למרות שאתרי תצורה גנומית תוארו ביצורים רב-תאיים בלבד, גם בשמרים ובבקטריה יש מבנים כרומוזומליים עם תפקיד דומהSzabo, Q., Bantignies, F. & Cavalli, G. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci. Adv. 5, (2019).. אף על פי שמנגנון ההיווצרות של אתרי תצורה גנומית אינו מובן באופן מלא, הוא מוסבר על ידיי מודל loop extrusion.Sikorska, N. & Sexton, T. Defining Functionally Relevant Spatial Chromatin Domains: It is a TAD Complicated. J. Mol. Biol. 432, 653–664 (2020). מחקרים מצביעים על כך ששיבושים במיקום של אתרי תצורה גנומית גורמים להפרעות התפתחותיות בעוברי עכבריםLupiáñez, D. G., Spielmann, M. & Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends Genet. 32, 225–237 (2016).. מוטציות באזורים של אתרי תצורה גנומית בבני אדם עלולות לגרום למחלות. בנוסף, דווח על קשר בין מוטציות באתרי תצורה גנומית לבין התפתחות סרטן, מה שתומך בתפקידם של אזורי בקרה גנומיים בפעילות התקינה של התא, הרקמה והאורגניזם.Valton, A. L. & Dekker, J. TAD disruption as oncogenic driver. Curr. Opin. Genet. Dev. 36, 34–40 (2016).

 מבנה ותפקיד ביולוגי 
אתרי תצורה גנומית הם חלק אחד מתוך מערכת שלמה שאחראית לארגון תלת-ממדי של הגנוםGibcus, J. H. & Dekker, J. The Hierarchy of the 3D Genome. Mol. Cell 49, 773–782 (2013).. כרומוזומים מאורגנים במבנה כרומטין (המורכב מהאינטראקציה בין DNA עם חלבוני היסטון וחלבונים נוספים הקושרים DNA), ומקומם בגרעין מוגדר לשטחים כרומוזומליים (chromosome territory), בגודל הנע בין 1–2 מיקרון. ארגון הכרומוזומים בגרעין קשור לפעילות הגנים המקודדים בהם: כרומוזומים המקודדים למספר רב של גנים פעילים מתרכזים קרוב יותר לאמצע הגרעין, לעומת כרומוזומים עם פחות גנים פעילים אשר נוטים להתמקם סמוך לממברנת הגרעיןoyle, S. et al. The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells. Hum. Mol. Genet. 10, 211–219 (2001).. בשטחים או בתחומים הכרומוזומליים שבגרעין (chromosome compartments), אינטראקציות בין אזורים גנומיים שונים משחקות תפקיד בסידור המבנה התלת-ממדי של הגנום בלולאות של 100kb עד מספר מיליוני בסיסים. התחומים הכרומוזומליים מכילים אתרי תצורה גנומית.Long, H. S. et al. Making sense of the linear genome, gene function and TADs. Epigenetics and Chromatin 15, 1–19 (2022). בנוסף, כרומוזומים מחולקים לפי רמת הביטוי של הגנים בתוכם לשתי קבוצות הקרויות מדור A (פעיל) ומדור B (אזור מושתק). תחומים כרומוזומליים, וכן אתרי תצורה גנומית, מכילים את שתי קבוצות הגנים.

אתרי תצורה גנומית הם אזורים בעלי תפקיד חיוני לבקרת ביטוי גנים, שכן הם מאפשרים אינטראקציה בין אזורים בקרתיים. ביטוי גנים ברמת רנ"א תלוי בהפעלת קדם (promoter) על ידי מגבירי ביטוי גנים - מעצמים (enhancers). הפעלת קדם דורשת אינטראקציה בין הקדם לבין מעצם, שבלעדיה לא יתקיים תעתוק. לפי רצף דנ"א, מעצמים רבים נמצאים במרחק שאינו מאפשר הפעלת קדם על ידי אינטראקציה. הלולאות של דנ"א שנוצרות באתרי תצורה גנומית מקרבות את המעצם לקדם ובכך מאפשרות את הפעלת התיעתוק של הגן. רוב האינטראקציות מתקיימות בין אלמנטים שנמצאים באותו אתר תצורה גנומית, כיוון שאזורי אתרי התצורה הגנומית מבודדים זה מזה על ידי גבולות.

ממוזער|יחידת TAD בצורה של פיתול. מעצם (צהוב) מתקרב לגן (אדום) ומגביר את הביטוי. חלבוניי cohesin וCTCF מייצבים את המבנה (להרחבה- ראו מנגנוני היוצרות TAD)

 מיפוי של אזורי TAD 
אתרי תצורה גנומית התגלו ב-2012, ביונקים ובדרוזופילה במקביל. התקדמות טכנית בשיטת מחקר מסוג Hi-C ,5C, הקרויה Chromatin conformation capture carbon copy, וכן השיטה הוותיקה יותר, 3C, הקרויה chromatin conformation capture, אפשרה ביצוע מחקר זהDostie, J. et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 16, 1299–1309 (2006).. הרעיון המשותף שעומד בבסיס כל השיטות הללו הut אפיון תדירות אינטראקציות בין אתרים בכרומוזומים, ביחס לרצפי דנ"א אחרים באותו מיקום כרומוזומאלי. בקצרה, שיטת 3C מתמקדת באיתור אינטראקציות בין אזור מוגדר מראש לאזורים אחרים בכרומוזום שנבחר. לכן, היה צורך בפיתוח שיטות לאפיון כל האינטראקציות האפשריות באזורים שונים ברחבי הגנום. שימוש בשיטות 5C וHi-C, בנוסף לפיתוחים חדשים של שיטות אלה, מאפשר לאפיין מגוון רחב של אינטראקציות ברחבי הגנום הנחקר. תוצאות של Hi-C או 5C מופיעות כ'מפת חום' (heat map).Song, F., Xu, J., Dixon, J., Yue, F. Analysis of Hi-C Data for Discovery of Structural Variations in Cancer. Methods Mol. Biol. 2301, (2022).לדוגמה, ראו את התרשים בלינק הבא:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34415534/#&gid=article-figures&pid=fig-3-uid-2 .

ציר X מייצג מיקום בגנום, והריבועים מייצגים את התדירות היחסית של האינטראקציה הכרומוזומלית בין 2 נקודות ביחס למיקום בדנ"א. כדי לקרוא מפת Hi-C, ניתן לתאר 2 קווים שנפגשים באמצע של 2 נקודות בציר X, ויוצרים צורה של משולש. בכל נקודה, עוצמת הצבע של הריבוע עולה עם חוזק האינטראקציה: אדום כהה מייצג תדירות גבוהה של אינטראקציות, לעומת שטח לבן שמייצג מיעוט/חוסר באינטראקציות 

בעזרת שיטות אלה נתגלו אזורים גנומיים בהם קיימת נטייה משמעותית ליצור אינטראקציות מקומיות; אזורים אלה זכו לכינוי: TAD (topologically associated domains)Belton, J. M. et al. Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods 58, 268–276 (2012)..

 שימור אבולוציוני 
השימור האבולוציוני של TAD במינים רב-תאיים, וקיום מבנים כרומוזומליים דומים בשמרים ובחיידקים, מדגישים את החשיבות של תפקידם הביולוגי. מיעוט מוטציות, ואף העדרן, במיוחד בגבולות ה-TAD, מעיד על לחץ סלקציה שלילי המתבטא בשימור אבולוציוני. במהלך הזמן, ועם פיצול מינים, השוני העיקרי שהתרחש מבחינת TAD הוא שינוי במיקומי TADs באותו הכרומוזום.McArthur, E. & Capra, J. A. Topologically associating domain boundaries that are stable across diverse cell types are evolutionarily constrained and enriched for heritability. Am. J. Hum. Genet. 108, 269–283 (2021).

עיבוד נתוני Hi-C של מינים שונים הראה, שבזמן היוצרות מינים חדשים, קיים שימור של גבולות TAD אפילו בין יצורים רחוקים אבולוציוניתSikorska, N. & Sexton, T. Defining Functionally Relevant Spatial Chromatin Domains: It is a TAD Complicated. J. Mol. Biol. 432, 653–664 (2020).

ראו את הנתונים בחלק B בלינק הבא:

https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-018-0556-x/figures/2

בציר X המיקום בגנום ביחס לגבול TAD-TAD. בציר Y השימור אבולוציוני ביחס למיקום הגנומי המיוצג בציר X . Breakpoint הוא שבירה בDNA שהתרחשה במהלך האבולוציה. כלומר, breakpoint הוא מקום עם מעט אירועי DNA shuffling, או מקום שמור. השוואת Hi-C בין שימפנזה, יונקי כיס (אופוסום), בקר, ודג זברה, הראתה שאזור הגבולות של TAD שמור ביותר. פיצול מינים אלה במהלך 450 מיליון שנים מדגיש את השימור ארוך השנים של TADs באבולוציה של חולייתנים.

מיפוי כרומוזומאלי הראה שכרומוזומים של דרוזופילה מחולקים על ידי גבולות ברורים, ומותאמים לפי אזורים של ביטוי גנים פעילים, בדומה ל-TAD של יונקים. במינים רבים של צמחים גם כן נמצאו TAD. לדוגמה, בכרומוזומים של אורז וכותנה אזורי TAD מועשרים בביטוי גנים פעיל.

מבנים דומים ל-TAD בצורתם ובתפקידם נמצאו ביצורים חד תאיים.Fudenberg, G. et al. Formation of Chromosomal Domains by Loop Extrusion. Cell Rep. 15, 2038–2049 (2016). בשמרים מסוג S. pombe קיימות יחידות מבניות בגודל של כ-100 kb עם קשירה של החלבון cohesin בגבולות בין היחידות השונות, שבתוכן נמצאים גנים המבוקרים יחד.Mizuguchi, T. et al. Cohesin-dependent globules and heterochromatin shape 3D genome architecture in S. pombe. Nature 516, 432–435 (2014). בבקטריה, כגון Bacillus subtilis ו-Caulobacter crescentus, קיימים גנים המבקרים יצירת אינטראקציה בין אזורים שונים בגנום החיידק.

 מנגנוני ההיווצרות של TAD 
כיום, המודל העיקרי העומד בבסיס האינטראקציות המבניות ב-TADs הוא loop extrusion model, שנחקר בעיקר ביונקים. TADs מקבלים צורת לולאה עקב פעילות משותפת של קבוצת חלבונים, שהבולטים שבהם הם CTCF ו-cohesin.Vian, L. et al. The Energetics and Physiological Impact of Cohesin Extrusion. Cell 173, 1165-1178.e20 (2018). כפי שניתן לראות באיור 5, שתי יחידות של cohesin קושרות אזור כרומטיני בשני קצותיו, ומושכות את הדנ"א לצורת לולאה. בזמן שcohesin מושך את הדנ"א, שתי יחידות של CTCF מתקרבות ללולאה משני הצדדים. ברגע שcohesin מתקרב לחלבון בCTCF, נוצר מבנה יציב של TAD. לולאות אלה, בגודל של כ-1.5 מיליוני בסיסים, נצפו מבעד לעדשת המיקרוסקופ.

המנגנון של loop extrusion מתרחש באופן אקטיבי, תלוי-ATP. עיקוב של יצירת ATP בתאים של בני אדם מנע את היווצרות הלולאות של TAD. היווצרות TAD מתרחשת בשלב האינטרפאזה במחזור החיים של התא, בשל הצורך הרב בבקרת ביטוי גנים.

ממוזער|לאחר טעינת cohesin (עיגולים סגולים), Cohesin מוטח את הדנ"א ומקרב את CTCF (משולשים שחורים) מ-2 הצדדים. כתוצאה, מתבצעת יוצרות פיתולים והיתייצבות של ה-TAD

היווצרות TAD, בדומה למסלולים רבים בביולוגיה של התא, הנה דינמית. בכרומוזומים, TADs נבנים ומתפרקים באופן תדיר. יציבותו של TAD נשמרת לפרק זמן שמותאם לתפקוד התאים. בנוסף לcohesin ול- CTCF ישנם חלבונים שתפקידם להוליך, לקשור את חלבון ה-cohesin לכרומטין או לשחרר אותו משם. לדוגמה, עיקוב של החלבון WAPL, אשר משחרר את cohesion מהכרומטין, גורם לשינויים במרחק האינטראקציות שמתרחשות בין גנים ומעצמים (אינהנסרים).Uusküla-Reimand, L. et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biol. 17, 1–22 (2016).Haarhuis, J. H. I. et al. The Cohesin Release Factor WAPL Restricts Chromatin Loop Extension. Cell 169, 693-707.e14 (2017) נתגלה, כי מרחק האינטראקציות ב-TAD, וכמובן גודל הלולאות, גדלים על ידי עיקוב פעילות של החלבון WAPL. בנוסף, גבולות TAD מועשרים בחלבון topoisomerase II, שתפקידו לשחרר לולאות בדנ"א באמצעות חיתוכים. ממצא זה מחזק את מודל loop extrusion כי מתח פיזי בדנ"א הוא תופעה צפויה באזור בלולאות תקינות של ה-TAD. עם זאת, רבים מאתרי הקישור של חלבון ה-CTCF תוארו במקומות שאינם בקצוות של TAD, מה שמרמז על קיומם של פקטורים נוספים המבקרים את גבולות ה-TADs.

ה-loop extrusion model לא רק מתאר כיצד נבנים ה-TADs, אלה גם נותן הסבר מנגנוני לפעילות של ריכוזי מעצמים ומעצמי-על (super enhancers).Grosveld, F., Van Staalduinen, J. & Stadhouders, R. Transcriptional Regulation by (Super)Enhancers: From Discovery to Mechanisms. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 22, 127–146 (2021) מעצמי-על, כגון ה-Locus control region (LCS) המבקר את פעילות הגנים ממשפחת הבתא-גלובין באדם (מעצם-העל הראשון שנתגלה), מורכבים מקבוצות מעצמי גנים, שפועלים באופן מתואם. אכן, אזורים בתוך מעצם העל של משפחת גני הגלובין נמצא בגבול של TAD.Kim, J., Kang, J., Kim, Y. W. & Kim, A. R. The human β-globin enhancer LCR HS2 plays a role in forming a TAD by activating chromatin structure at neighboring CTCF sites. FASEB J. 35, 1–12 (2021).

מנגנונים העומדים בבסיס הקשר בין היווצרות TADs לבקרת תהליכי שכפול DNA, תעתוק, ושינויים בקשירת חלבוני היסטון ועריכתם על ה-DNA עדיין אינם מובנים לעומקPope, B. D. et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature 515, 402–405 (2014).. כמו כן, הבנת הקשר בין שינויים ב-TAD להשפעה על תפקוד התאים, הפנוטיפ, ומחלות תורשתיות באדם עדיין בחיתוליה. עם זאת, בעוברי עכברים, עיקוב של שכפול מבטל היווצרות TAD, ועיקוב תיעתוק לא משפיע על היווצרות TADs.Ke, Y. et al. 3D Chromatin Structures of Mature Gametes and Structural Reprogramming during Mammalian Embryogenesis. Cell 170, 367-381.e20 (2017). ממצא זה משמש רמז לתפקיד החשוב של TADs בבקרת פעילות התא והאורגניזם.

 TAD ומחלות בבני אדם 
עקב החיוניות של תפקידם הביולוגיים של ה-TAD, ירידה בתפקוד ה-TADs עלולה לעמוד בבסיס מחלות תורשתיות או להוליך להתפתחות סרטן.Gröschel, S. et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in Leukemia. Cell 157, 369–381 (2014).. מחקר שנעשה בעכברים מעיד על החשיבות של היווצרות ותפקוד באזורים של TAD למחלות. לדוגמה, מחקר בעכברים הראה, כי מוטציה בגבול של -TAD המכיל גנים המעורבים בהתפתחות הגפיים, גורמת להתפתחות לא תקינה במבנה מפרק הרגל של העכבר; לעומת זאת, חסר שהתרחש בתוך TAD זה לא השפיע על הפנוטיפ.

בבני אדם, גילו מתאם בין מוטציות באזור גנומי של TAD לבין מחלות. קיים קשר בין מחלות ניורולוגיות, כמו autosomal dominant leukodystrophy(ADLD), ומחלות תורשתיות שמובילות להפרעות אנטומיות, כמו F-syndrome וmesomelic dysplasia.

מוטציות ב-TAD שנצברות במהלך החיים יכולות להשפיע על מסלולי התפתחות סרטן, כמו לוקמיה מיאלואידית חריפה ו-medulloblastoma.Northcott, P. A. et al. Enhancer hijacking activates GFI1 family oncogenes in medulloblastoma. Nature 511, 428–434 (2014). שיבוש בגבולות של TAD עשוי להוליך לפגם בבקרת ביטוי של גנים, תהליך שעלול לתרום להתפתחות סרטן.

 קישורים חיצוניים 

 Jian Ma | Comparing 3D Genome Organization | CGSI 2019 (הרצאה)
 Prof. Daniel Panne: Structural insights into genome folding by CTCF and cohesin (הרצאה)

 הערות שוליים 

קטגוריה:גנטיקה