ריצוף בשיטת Ion

ריצוף בשיטת Ion היא שיטה לריצוף DNA המבוססת על זיהוי יוני מימן (פרוטונים) שמשתחררים בזמן פולימריזציית DNA. זוהי שיטה בה הריצוף מתבצע על ידי סינתזה, שבמהלכה נבנה גדיל משלים על גבי רצף גדיל המקור.
ממוזער|מכונת ריצוף בשיטת Ion Proton:  Ion semiconductor sequencer
אל מיקרו-בְּאֵרִיּוֹת, המכילות את גדיל המקור של ה-DNA שאותו מעוניינים לרצף, מוזרמים לסירוגין בסיסי DNA – דאוקסיריבונוקלאוטיד פוספט, סוג אחד של בסיס בכל מחזור פעולה. אם הבסיס שהוזרם משלים לבסיס הפנוי הבא בגדיל המקור, הוא מצורף אל הגדיל המשלים ההולך ונבנה, תוך כדי פליטת יון מימן, המאותת לחיישן יונים וזה מזהה כי התגובה התרחשה. אם ישנן חזרות ברצף המקור, מספר בסיסים מצורפים במחזור אחד. התרחשות זו גוררת אחריה פליטת יוני מימן בהתאם וכן עלייה פרופורציונית בעוצמת האיתות החשמלי.

שיטה זו נבדלת משאר שיטות הריצוף בכך שאינה מצריכה נוקלאוטידים מיוחדים או שימוש באופטיקה. שיטת ריצוף Ion מכונה גם בשמות: ריצוף Ion Torrent, ריצוף באמצעות pH, ריצוף סיליקוני או ריצוף באמצעות מוליכים למחצה (מל"מ).

 היסטוריית התפתחות הטכנולוגיה 
הטכנולוגיה נרשמה על ידי DNA Electronicd Ltd, פותחה על ידי Ion Torrent Systems Inc ושוחררה בפברואר 2010. Ion Torrent מיתגה את המוצר שלה כמכונת ריצוף מהירה, קומפקטית וחסכונית, שיכולה לשמש מעבדות רבות. Roshe's 454 Life Sciences משתפת פעולה עם DNA Electronics במאמצים לפתח על בסיס שיטה זו פלטפורמת ריצוף בעלת צפיפות גבוהה (המאפשרת מספר רב יותר של קריאות במקביל) ויכולת לקרוא מקטעים ארוכים.

 טכנולוגיה 
טקסט=caption|ממוזער|צירוף דאוקסיריבונוקלאוטיד טריפוספט לתוך הגדיל המשלים המסונטז של DNA גורם לפליטת יוני מימן ופירופוספט
טקסט=caption|ממוזער|שחרור יון מימן מסמן כמה נוקלאוטידים חוברו: אפס, אחד או כמה ברצף.
טקסט=caption|ממוזער|יוני המימן המשוחררים מזוהים על ידי חיישן יונים. חזרות של אותו הבסיס מובילות לעליה ברמת שחרור יוני המימן ולחזיוק האיתות החשמלי.

 כימיית הריצוף 
בטבע, הוספת בסיס של חומצת גרעין לקצהו של גדיל DNA שהולך ונבנה (על גבי גדיל קיים ובהשלמה לו) גורמת ליצירת קשר קוולנטי ולשחרור יון מימן טעון חיובית ויון פירופוספט טעון שלילית. הבסיס מתווסף אך ורק אם הוא משלים לבסיס הפנוי הבא בגדיל הקיים. שיטת הריצוף Ion מזהה האם נפלט יון מימן בעקבות הזרמת סוג אחד של בסיס לתוך התגובה.

אל תוך מיקרו-בְּאֵרִיּוֹת, המכילות עותקים רבים של מולקולת DNA חד-גדילית אחת שאותה מעוניינים לרצף, וכן DNA פולימראז, מוזרמים לסירוגין בסיסי חומצת גרעין A, C, G או T. אם הבסיס שהוזרם הוא הבסיס המשלים לבסיס הפנוי הבא בגדיל המקור, הוא מתווסף לקצהו של הגדיל שהולך ונבנה, על ידי DNA פולימראז. אם הבסיס אינו משלים – אין הוספה ואין תגובה ביוכימית. יון המימן המשוחרר משנה את ה-pH של התמיסה, והדבר מזוהה על ידי חיישן יונים. בסיסים שלא חוברו לגדיל נשטפים לפני מחזור הפעולה הבא, שבו יוזרמו בסיסים מסוג שונה.

 זיהוי אותות 
מתחת לשכבה של מיקרו-בְּאֵרִיּוֹת ממוקמת שכבה שרגישה ליונים, ותחתיה חיישן יונים. כל השכבות מאוגדות בתוך שבב CMOS, כזה שמשתמשים בו בתעשיית האלקטרוניקה.

כל שבב מכיל מערך של מיקרו-באריות עם חיישני יונים תואמים. כל יון מימן המשוחרר בעת תגובה מגרה את חיישן היונים. סדרת האותות החשמליים שמועברת מהצ'יפ למחשב מתורגמת לרצף DNA, ללא צורך בעיבוד ביניים של האותות לפני העברתם למחשב. מכיוון שאירועים של הרכבת נוקלאוטיד על גבי גדיל המקור נמדדים ישירות באמצעות האלקטרוניקה, השיטה נמנעת מלהשתמש בנוקלאוטידים מסומנים ובמדידות אופטיות. עיבוד האות וחישוב הרצף המתקבל מתבצעים לאחר מכן על ידי תוכנה.

 מאפייני הריצוף 
מידת הדיוק שעובדי חברת Ion Torrent הצליחו להשיג באמצעות מכונת ריצוף מסוג Ion Torrent Ion semiconductor בפברואר 2011, הייתה 99.6% לבסיס – חישוב המבוסס על קריאות באורך 50 בסיסים, עם 100 מגה בסיסים להרצה. מידת הדיוק בריצוף הומופולימר (פולימר המורכב מחזרות של אותה יחידה בסיסית) באורך של 5 חזרות עמדה על 98%. גרסאות מאוחרות יותר מציגות קריאות מקטעים באורך 400 בסיסים. המספרים הללו טרם אומתו על ידי גורמים בלתי תלויים מחוץ לחברה.

 יתרונות 
היתרונות העיקריים של ריצוף בשיטת Ion הם מהירות הריצוף הגבוהה, והעלויות הנמוכות של המכשור והתפעול. העלויות הנמוכות מתאפשרות בזכות ההימנעות משימוש בנוקלאוטידים מסומנים ובמדידות אופטיות.

מכיוון שהמערכת מקבלת אותות מאירועי צירוף של נוקלאוטידים באמצעות DNA פולימראז המתרחשים בזמן אמת, גם הריצוף יכול להתבצע בזמן אמת. בפועל תדירות הריצוף מוגבלת על ידי מהירות מיחזור הנוקלאוטידים במערכת. מפתחת השיטה Ion Torrent Systems Inc טוענת כי מדידת כל אירוע ריצוף מצריכה 4 שניות וכל הרצה לוקחת כשעה, שבמהלכה מרוצפים 100–200 נוקלאוטידים. אם שבבי המל"מ ישתפרו (כפי שחוזה חוק מור), מספר הקריאות לרכיב (ולפיכך להרצה) אמור לעלות.

המחיר לצרכן של מכונת ריצוף בשיטה זו בזמן יציאתה לשוק הוערך בכ-50,000 דולר, לא כולל ציוד להכנת הדגימה ושרת לעיבוד מידע. העלות להרצה גם היא נמוכה משמעותית מזו של שיטות ריצוף אוטומטיות אחרות, וההפרש מוערך בכ-1,000 דולר.

 מגבלות 
אם בגדיל המקור (הגדיל המרוצף) מופיעות חזרות של אותו הנוקלאוטיד (כגון GGGGG), אז יותר נוקלאוטידים מהתמיסה מצורפים לגדיל המסונטז ויותר יוני מימן נפלטים במהלך אותו מחזור פעולה. הדבר גורם לשינוי גדול יותר ב-pH ולעלייה פרופורציונית בעוצמת האות. עלייה זו איננה ליניארית ולכן קשה לבצע קריאה מדויקת של חזרות ארוכות. מגבלה זו קיימת גם בשיטות אחרות שמזהות הוספה של נוקלאוטיד בודד, כגון שיטת ה-pyrosequencing. קשה להבחין בין אות שנובע ממספר רב של חזרות של אותו נוקלאוטיד ובין אות שנובע ממספר דומה אבל אחר של חזרות; לדוגמה, קשה להבחין בין 7 ל-8 מופעים של אותו הבסיס.

מגבלה אחרת של השיטה היא אורך קריאה קצר יותר לעומת שיטות אחרות, כמו ריצוף בשיטת Sanger או pyrosequencing. היכולת לקרוא מקטעים ארוכים מהווה יתרון בהרכבת גנום מחדש (שלא מול גנום היחוס). שיטת ריצוף Ion מפיקה בממוצע כ-400 נוקלאוטידים לקריאה.

נכון לעכשיו תפוקתה של השיטה נמוכה מזו של שיטות ריצוף אחרות בעלות תפוקה גבוהה, אך המפתחים מקווים לשנות זאת על ידי העלאת צפיפות השבב.

 שימוש 
מפתחי שיטת הריצוף Ion מיתגו אותה כשיטת ריצוף מהירה, חסכונית וקומפקטית, שיכולה להיות בשימוש רחב במעבדות. החברה מקווה כי המערכת אותה פיתחה תוציא את מלאכת הריצוף מידיהם של המרכזים הייעודיים ותעביר אותה להישג ידם של בתי חולים ומעבדות קטנות יותר. בינואר 2011 פורסמה בעיתון New York Times כתבה "ריצוף DNA – לנחלת הכלל", שמדגישה שאיפות אלו.

מכיוון שהשיטות המתחרות לריצוף DNA מגיעות לאורך קריאה גבוה יותר (ולפיכך מתאימות יותר לריצוף הגנום השלם), הטכנולוגיה הזו יכולה להתאים במיוחד לשימוש בקנה מידה קטן, כמו ריצוף גנומים של מיקרואורגניזמים, ריצוף תוצרי תעתוק של מיקרואורגניזמים, ריצוף אמפליקונים, או לצורך בקרת איכות של ספריות גנומיות שנבנו בשיטות אחרות.

 קישורים חיצוניים 
 עמוד הבית של Ion Torrent
 עמוד הבית של DNA Electronics Ltd
 כתבה ב-New York Times

 הערות שוליים 

קטגוריה:ביוטכנולוגיה
קטגוריה:ביולוגיה מולקולרית