נוקלאז

נוקלאז (Nuclease) הוא אנזים המסוגל לבקע קשרים פוספודיאסטרים המחברים בין נוקלאוטידים ליצירת חומצות גרעין. את הנוקלאזות מקובל לחלק לאנדונוקלאזות , החותכים קשרים בתוך שרשרת פולינוקלאוטיד, ולאקסונוקלאזות, המבקעים את הקשרים בקצה השרשרת. סיווג נוסף הוא לדאוקסיריבונוקלאזות  וריבונוקלאזות. הסוג הראשון פועל על DNA, השני על RNA.

בסוף שנות השישים של המאה ה-20 ורנר ארבר וסטיוארט לין בודדו דוגמאות של שני סוגים של אנזימים האחראיים על הגבלת גידול של פאג'ים בחיידק Escherichia coli. אחד מאנזימים אלו הוסיף קבוצת מתיל בסוף ה-DNA (מתילאז; Methylase), ואילו האחר ביקע DNA שלא עבר מתילציה במגוון מקומות לאורך המולקולה (אנזים הגבלה).

לנוקלאזות אתר זיהוי ואתר חיתוך. האנזים מזהה רצף גנטי ספציפי (זה אתר הזיהוי, למשל AATT באיור המצורף) ובהתאם אליו יחתוך את הרצף במיקום ספציפי (באיור המצורף, יחתוך בין שני הגדילים על גבולות אתר הזיהוי). ברוב המקרים, אך לא תמיד, אתר החיתוך ימצא בתוך אתר הזיהוי. אתר הזיהוי יהיה לרוב בעל רצף במבנה של פלינדרום.

החיתוך יכול לייצר "קצוות דביקים" בהם לכל גדיל שנחתך יש שארית של רצף נוקלאוטידים חד גדילי, או "קצוות כהים" בו שני הקצוות מסתיימים ברצף דו-גדילי.ממוזער|תיאור של אנזים ההגבלה (endonuclease) HindIII החוצה מולקולת DNA דו-גדילית באתר הגבלה תקף ().דוגמאות לנוקלאזות מוכרות הם RNase A (החותך RNA חד גדילי) ו-DNase I .

 היסטוריה 
בסוף שנות ה-60, המדענים סטיוארט לין וורנר ארבר בודדו דוגמאות לשני סוגי האנזימים האחראים על הגבלת צמיחת פאג'ים בחיידקי אשריכיה קולי (E. coli). אחד האנזימים הללו הוסיף קבוצת מתיל ל-DNA, ויצר DNA מתיל , בעוד שהשני ביטל DNA ללא מתיל במגוון רחב של מיקומים לאורך המולקולה. הסוג הראשון של אנזים נקרא "מתילאז " והשני "נוקלאז רסטריקציה". כלים אנזימטיים אלה היו חשובים למדענים שאספו את הכלים הדרושים ל"גזירה והדבקה" של מולקולות DNA. מה שהיה נחוץ אז היה כלי שיחתוך DNA באתרים ספציפיים, ולא באתרים אקראיים לאורך המולקולה, כך שמדענים יוכלו לחתוך מולקולות DNA בצורה צפויה וניתנת לשחזור.

התפתחות חשובה התרחשה בשנת 1968, כאשר ה. או. סמית', ק.וו. וילקוקס ו - טי. ג'יי. קלי , שעבדו באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, בודדו ואפיינו את נוקלאז הרסטריקציה הראשון שתפקודו היה תלוי ברצף נוקלאוטידים ספציפי של DNA. קבוצה זו, שעבדה עם חיידקי ההמופילוס אינפלואנזה, בודדה אנזים, בשם Hind II, שחותך תמיד מולקולות DNA בנקודה מסוימת בתוך רצף ספציפי של שישה זוגות בסיסים. הם גילו שאנזים Hind II תמיד חותך ישירות במרכז רצף זה (בין זוג הבסיסים השלישי והרביעי).

 מערכת סיווג מספרית 
רוב הנוקלאזות מסווגות לפי מספר ועדת האנזימים  של "הועדת למינוח של האיגוד הבינלאומי לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית " כהידרולאזות (EC מספר 3). הנוקלאזות שייכות, בדיוק כמו פוספודיאסטראז, ליפאז ופוספטאז, לאסטראזות (EC מספר 3.1), תת-קבוצה של ההידרולאזות. האסטרזות אליהן שייכות הנוקלאזות מסווגות במספרי EC שנעים בין EC 3.1.11 ל־EC 3.1.31.

 מבנה 
המבנה הראשוני של נוקלאזות אינו שמור היטב ברובו, והוא שמור באופן מינימלי באתרים הפעילים, אשר פני השטח שלהם מורכבים בעיקר משאריות חומצות אמינו חומציות ובסיסיות. ניתן לסווג נוקלאזות לפי משפחות קיפול.
ממוזער|מבנה גבישי של EcoRV בקומפלקס עם DNA.

 זיהוי אתר 
נוקלאז חייב להיקשר לחומצת גרעין (נוקלאין) לפני שיוכל לבקע את המולקולה. פעולה זו כרוכה ברמה מסוימת של זיהוי. נוקלאזות עושות שימוש גם בקשרים לא-ספציפיים וגם בקשרים ספציפיים בדרכי הזיהוי והקישור שלהן. שני המצבים ממלאים תפקידים חשובים ביצורים חיים, במיוחד בתיקון DNA.

אנדונוקלאזות לא ספציפיות המעורבות בתיקון DNA יכולות לסרוק את ה-DNA כדי לאתר רצפי מטרה  או נזקים . נוקלאז כזה נע בדיפוזיה לאורך ה-DNA עד שהוא נתקל במטרה, ואז שאריות באתר הפעיל שלו יוצרות אינטראקציה עם קבוצות כימיות ב-DNA. במקרה של אנדונוקלאזות כמו EcoRV , BamHI  ו-PvuII, הקישור הלא-ספציפי כולל אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין שטח פנים מינימלי של החלבון לבין ה-DNA. קשר חלש זה אינו משנה את הצורה הכללית של ה-DNA, אשר נשאר במבנה B (B-form).

נוקלאז ייחודי-לאתר (site-specific nuclease) לעומת זאת, יוצר קשרים חזקים בהרבה.. הוא מושך את ה-DNA אל תוך התעלה העמוקה של תחום הקישור ל-DNA  שלו. פעולה זו גורמת לעיוות משמעותי במבנה השלישוני של ה-DNA, והיא מתבצעת באמצעות אזורים עשירים בשאריות בסיסיות (בעלות מטען חיובי). הנוקלאז מקיים אינטראקציות אלקטרוסטטיות נרחבות עם ה-DNA.

חלק מהנוקלאזות המעורבות בתיקון DNA מפגינות ספציפיות חלקית לרצף. עם זאת, רובם אינם ספציפיות, אלא מזהות חריגות מבניות הנוצרות בשלד  של ה-DNA כתוצאה מחוסר התאמה בזוגות הבסיסים.

 נוקלאז ספציפי לרצף 
אנזיםמקוררצף מזההגזירהHindIIהמופילוס אינפלואנזה5'–GTYRAC–3'
3'–CARYTG–5'5'– –3'
3'– –5'R = A or G; Y = C or T

יותר מ־900 אנזימי רסטריקציה, חלקם בעלי ספציפיות לרצף וחלקם לא, בודדו מיותר מ־230 זני חיידקים מאז הגילוי הראשוני של האנזים HindII. לרוב, שמות אנזימי הרסטריקציה משקפים את מקורם - האות הראשונה בשם מגיעה מהסוג (genus) ושתי האותיות הבאות מגיעות ממין התא (species) הפרוקריוטי שממנו בודד האנזים. לדוגמה, האנזים EcoRI מגיע מחיידק Escherichia coli, מזן RY13, בעוד HindII מקורו בחיידק Haemophilus influenzae מזן Rd. מספרים המופיעים לאחר שם הנוקלאז מציינים את הסדר הבידוד של האנזימים מאותו זן חיידקים: EcoRI, EcoRII .

יותר מ־900 אנזימי רסטריקציה, חלקם בעלי ספציפיות לרצף וחלקם לא, בודדו מיותר מ־230 זני חיידקים מאז הגילוי הראשוני של האנזים HindII. לרוב, שמות אנזימי הרסטריקציה משקפים את מקורם - האות הראשונה בשם מגיעה מהסוג (genus) ושתי האותיות הבאות מגיעות ממין התא (species) הפרוקריוטי שממנו בודד האנזים. לדוגמה, האנזים EcoRI מגיע מחיידק Escherichia coli, מזן RY13, בעוד HindII מקורו בחיידק Haemophilus influenzae מזן Rd. מספרים המופיעים לאחר שם הנוקלאז מציינים את הסדר הבידוד של האנזימים מאותו זן חיידקים: EcoRI, EcoRII.

 אנדונוקלאזים 
אנדונוקלאז רסטריקציה פועל באמצעות "סריקה" של אורך מולקולת ה-DNA. כאשר הוא נתקל ברצף ההכרה הספציפי שלו, הוא נקשר למולקולת ה-DNA ומבצע חיתוך אחד בכל אחד משני השלדים של סוכר-פוספט. מיקומם של שני החיתוכים האלה, הן ביחס זה לזה והן ביחס לרצף ההכרה עצמו, נקבע על פי זהותו של האנדונוקלאז. אנדונוקלאזים שונים יוצרים מערכות שונות של חיתוכים, אך אנדונוקלאז מסוים תמיד יחתוך רצף בסיסים מסוים באותה הדרך, בלי קשר על איזו מולקולת DNA הוא פועל. לאחר ביצוע החיתוכים, מולקולת ה-DNA תתפרק למקטעים.

 חיתוך מדורג 
לא כל אנדונוקלאזות הרסטריקציה חותכות בצורה סימטרית ומשאירות קצוות קהים כמו HindII שתואר לעיל. אנדונוקלאזות רבות חותכות את עמוד השדרה של ה-DNA בעמדות שאינן ממוקמות זו מול זו בדיוק, וכך יוצרות קצוות בולטים. לדוגמה, לאדונוקלאז EcoRI יש את רצף הזיהוי 5'—GAATTC—3'.
אנזיםמקוררצף הגבלהחיתוךHindIIIהמופיליוס אינפלואנזה5'–AAGCTT–3'
3'–TTCGAA–5'5'– –3'
3'– –5'EcoRIאשריכיה קולי 5'–GAATTC-3'
3'–CTTAAG–5' 5'– –3'
3'– –5'BamHIBacillus amyloliquefaciens 5'–GGATCC–3'
3'–CCTAGG–5' 5'– –3'
3'– –5'

כאשר האנזים נתקל ברצף זה, הוא חותך כל עמוד שדרה בין שייר הבסיס G לשייר הבסיס A הקרוב ביותר. לאחר ביצוע החיתוכים, המקטעים המתקבלים מוחזקים יחד רק על ידי קשרי המימן החלשים יחסית שמחברים בין הבסיסים המשלימים. חולשתם של קשרים אלה מאפשרת למקטעי ה-DNA להיפרד זה מזה. כל מקטע שנוצר כולל קצה 5' בולט המורכב מבסיסים לא מזווגים. אנזימים אחרים יוצרים חיתוכים בעמוד השדרה של ה-DNA, שגורמים להיווצרות קצוות 3' בולטים. קצוות בולטים - גם 3' וגם 5' - נקראים לפעמים "קצוות דביקים " משום שהם נוטים להיקשר לרצפים משלימים של בסיסים. במילים אחרות, אם רצף לא מזווג של בסיסים 5'—AATT—3' פוגש רצף לא מזווג אחר עם הרצף 3'—TTAA—5' הם יקשרו זה לזה - הם "דביקים" זה לזה. לאחר מכן נעשה שימוש באנזים ליגאז כדי לחבר את עמוד השדרה הפוספטי של שתי המולקולות. המקור התאי, או אפילו מקור המין, של הקצוות הדביקים אינו משפיע על מידת הדביקות שלהם. כל זוג של רצפים משלימים ייטה להיקשר, גם אם אחד מהם מגיע מקטע DNA אנושי, והשני מגיע מקטע DNA של חיידקי. למעשה, תכונת הדביקות הזו היא שמאפשרת את יצירתן של מולקולות DNA רקומביננטיות, מולקולות המורכבות מ-DNA ממקורות שונים, ושמהווה את הבסיס לטכנולוגיית ההנדסה הגנטית.

 תפקיד בטבע 
 תיקון DNA 
מכיוון שכל התאים מסתמכים על DNA כאמצעי להעברת מידע גנטי, בקרת איכות גנטית היא פונקציה חיונית בכל האורגניזמים. שכפול DNA הוא תהליך מועד לשגיאות, ומולקולות ה-DNA עצמן פגיעות לשינויים על ידי גורמים מטבוליים וסביבתיים שונים. דוגמאות נפוצות כוללות רדיקלים מחמצנים , קרינה על סגולה קרובה וקרינה מייננת. נוקלאזות רבות משתתפות בתיקון DNA בכך שהן מזהות את אתרי הנזק וחותכות אותם מה-DNA שמסביב. אנזימים אלה פועלים באופן עצמאי או כחלק מקומפלקסים . רוב הנוקלאזות המעורבות בתיקון DNA אינן תלויות ברצף מסוים. הן מזהות את אתרי הנזק דרך שינוי במבנה השניוני של DNA דו גדילי (dsDNA).

 תיקון שגיאות בשכפול 
במהלך שכפול ה-DNA, אנזימי DNA פולימראז מאריכים את גדילי ה-DNA החדשים מול גדילים תבניתיים משלימים. רוב אנזימי ה-DNA פולימראז כוללים שני תחומים אנזימטיים שונים: פולימראז  ואקסונוקלאז לתיקון שגיאות. הפולימראז מאריך את הגדיל החדש בכיוון 5' → 3'. האקסונוקלאז מסיר נוקלאוטידים שגויים מאותו גדיל בכיוון 3' → 5'. פעילות אקסונוקלאז זו חיונית ליכולתו של ה-DNA פולימראז לבצע תיקון שגיאות. מחיקות  שמנטרלות או מסירות את האקסונוקלאזות הללו מעלות את שיעורי המוטציות והתמותה במיקרואורגניזמים שנפגעו וכן מגבירות את הסיכון לסרטן בעכברים.

 מזלג שכפול שהושהה 
צורות רבות של נזק ל-DNA  עוצרות את התקדמות מזלג השכפול, וגורמות ל-DNA פולימראז ולאנזימים הנלווים לו לנטוש את המזלג. לאחר מכן יש לעבד את המזלג באמצעות חלבונים ייחודיים למזלג השכפול. הבולט בהם הוא MUS81 . מחיקות שלו גן זה גורמות לרגישות לנזק מקרינת UV או מתילציה בשמרים, בנוסף לפגמים במיוזה.

 עיבוד שברי אוקזאקי 
משימה נפוצה בתאים היא הסרת פריימרים של RNA של מקטע אוקזאקי מהשכפול. רוב הפריימרים הללו מוסרים מגדיל ה-DNA המתעכב שסונתז זה עתה על ידי אנדונוקלאזות ממשפחת RNase H . באיקריוטים ובארכאה, גם האנדונוקלאז מסוג FEN1  משתתף בעיבוד של מקטעי אוקזאקי.

 תיקון אי התאמה 
תיקון חוסר התאמה ב-DNA  בכל אורגניזם נתון מתבצע על ידי קבוצת אנדונוקלאזות ייחודיות לזיהוי חוסר התאמה. בפרוקריוטים, תפקיד זה מבוצע בעיקר על ידי החלבונים MutSLH וחלבונים הקשורים למנגנון תיקון בטווח קצר מאוד  (VSP repair).

מערכת MutSLH (הכוללת את MutS , MutL ו-MutH) מתקנת מוטציות נקודתיות וסיבובים  קטנים ב-DNA. חוסר התאמה מזוהה על ידי MutS שנקשר אליו, ושם הוא מגייס את MutL ו-MutL. MutH מתווך את האינטראקציה בין MutS ו-MutH, ומגביר את הפעילות האנדונוקלאזית של האחרון. MutH מזהה אתרי 5'—GATC—3' שהם חצי-ממותלים, וחותך ליד בסיס ה-G של הגדיל שאינו ממותל – כלומר, הגדיל שזה עתה סונתז.

תיקון VSP מתחיל על ידי האנדונוקלאז Vsr. זה מתקן חוסר התאמה ספציפי מסוג T/G שנגרם על ידי דה-אמינציה ספונטנית של ציטוזינים ממותלים לטימינים. Vsr מזהה את הרצף 5'—C T W GG—3' (כאשר ה-T הוא הבסיס הבעייתי), וחותך את גדיל ה-DNA בצד 5' של הטימין הלא תואם (המודגש ברצף הקודם). לאחר מכן, אחד מהאקסונוקלאזות RecJ, ExoVII  או ExoI  מפרק את האזור הפגום לפני ש-DNA פולימראז משלים מחדש את הפער בגדיל.

 תיקון בסיסים 
היווצרות אתר AP  היא תופעה נפוצה ב-DNA דו גדילי. היא נגרמת כתוצאה מהידרוליזה ספונטנית ו כן מפעילות של DNA גחיקוזילאזות , כשלב ביניים בתיקון בסיסים . אתרי AP אלה מוסרים על ידי אנדונוקלאזות מסוג AP , שגורמות לשברים בגדיל האחד סביב האתר.

 תיקון נוקלאוטידים 
תיקון נוקלאוטידים (NER) , שאין לבלבל אותו עם תיקון בסיסים (BER), כולל הסרה והחלפה של נוקלאוטידים פגומים. מקרים של קשרים צולבים , אדוקטים ופגיעות ב-DNA (שנגרמות על ידי קרינת UV או מצורוני חמצן פעילים ) יכולים להפעיל מסלול תיקון זה. קטעים קצרים של DNA חד-גדילי, המכילים נוקלאוטיד פגום כזה, מוסרים מ-DNA הדו-גדילי על ידי אנדונוקלאזות נפרדות שיוצרות חתכים לפני ואחרי אזור הנזק. מחיקות או מוטציות באנזימים אלו גורמות לרגישות מוגברת לנזקי קרינת UV ולסיכון מוגבר להתפתחות סרטן. ליקויים כאלה עלולים אף לפגוע בהתפתחות מערכת העצבים.

בחיידקים, שני החיתוכים מבוצעים על ידי קומפלקס UvrB-UvrC . בשמרים נבגיים, האנזימים Rad2 וקומפלקס Rad1-Rad10 מבצעים את החיתוכים בצד 5' ובצד 3', בהתאמה. אצל יונקים, ההומולוגים XPG  ו-XPF  - ERCC1  מבצעים את החתכים המקבילים, בהתאמה.

 תיקון שבר דו-גדילי 
שברים דו-גדיליים ב-DNA, בין אם מכוונים ובין אם לא, מתרחשים באופן קבוע בתאים. שברים לא מכוונים נוצרים לרוב כתוצאה מקרינה מייננת, חומרים כימיים חיצוניים ופנימיים, או מקילקול בתהליך השכפול(replication forks שנעצרו). שברים מכוונים נוצרים כשלב ביניים במיוזה ובתהליך רקומבינציית V(D)J, והם מתוקנים בעיקר באמצעות רקומבינציה הומולוגית או חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ). בשני המקרים יש צורך בעיבוד הקצוות של השבר על ידי נוקלאזות לפני שהתיקון יכול להתחיל. אחת מהנוקלאוזות החשובות לכך היא Mre11  שפועלת בקומפלקס עם Rad50 . מוטציות ב-Mre11 עלולות לגרום להפרעה דמוית אטקסיה-טלנגיאקטזיה.

רקומבינציה V(D)J כוללת פתיחה של מבני לולאות גזע  הקשורים לשברים דו-גדיליים, ולאחר מכן חיבור של שני הקצוות. הקומפלקס Artemis-DNAPK cs  משתתף בתהליך זה. למרות שארטמיס מפגין פעילות אקסונוקלאז 5' → 3' על DNA חד-גדילי כשהוא פועל לבד, יצירת קומפלקס שלו עם DNA-PK cs  מאפשרת לו לבצע עיבוד אנדונוקלאזי של מבני הלולאה-גזע. פגמים בכל אחד מהחלבונים הללו גורמים לחוסר חיסוני חמור.

רקומבינציה הומולוגית, לעומת זאת, מערבת שני סלילים כפולים הומולוגיים של DNA המחוברים באמצעות לולאות D  או צמתי הולידיי . בחיידקים, אנדונוקלאזות כמו RuvC  מפרקות את צמתי הולידיי לשני סלילים כפולים נפרדים על ידי חיתוך הצומת בשני אתרים סימטריים סמוך למרכז הצומת. באיקריוטים, האנזימים FEN1 , XPF  - נ  ו-MUS81  חותכים את לולאות ה-D, ו-Cce1  / Ydc2  מעבדים את צמתי הולידיי שבמיטוכונדריה.

 מגנוקלאזים 
התדירות שבה נוקלאז מסוים יחתוך מולקולת DNA נתונה תלויה במורכבות ה-DNA ובאורך רצף הזיהוי של הנוקלאז; בשל ההסתברות הסטטיסטית למצוא בסיסים בסדר מסוים באופן אקראי, רצף זיהוי ארוך יותר יוביל לחיתוך נדיר יותר. לדוגמה, רצף של ארבעה בסיסים (שמתאים לאתר הזיהוי עבור נוקלאז היפותטי) צפוי להופיע בממוצע כל 256 בסיסים (שכן 4^4=256), בעוד שרצף נתון בן שישה בסיסים צפוי להופיע בממוצע פעם אחת כל 4,096 בסיסים (4^6=4096).

משפחה ייחודית של נוקלאזות היא המגה-נוקלאזות , המאופיינות ברצפי זיהוי ארוכים יותר, ולכן נדירים יותר, המורכבים מ-12 עד 40 זוגות בסיסים. נוקלאזות אלו שימושיות במיוחד עבור יישומי הנדסה גנטית והנדסת גנום  ביצורים מורכבים כמו צמחים ויונקים, שבהם גנומים גדולים במיוחד (המכילים מיליארדי זוגות בסיסים) עלולים להוביל לחיתוך תכוף ומזיק באתרי DNA ספציפיים אם משתמשים בנוקלאזות רגילות.

 קישורים חיצוניים 



הערות שוליים

קטגוריה:אנזימים