RecBCD

RecBCD, tamén chamada exodesoxirribonuclease V ou exonuclease V de Escherichia coli (EC 3.1.11.5) é un encima da bacteria Escherichia coli que inicia a reparación recombinacional de roturas de dobre febra no ADN potencialmente letais que poden orixinarse por radiación ionizante, erros de replicación, endonucleases, danos oxidativos, e outros factores. O encima RecBCD funciona como helicase que desenrola ou separa as febras do ADN e tamén como nuclease que produce amosegas nunha soa das febras do ADN. Cataliza o corte exonucleolítico (en presenza de ATP) nas direccións 5′→3′ ou 3′→5′ para render 5′-fosfooligonucleótidos.

 Estrutura 
Este complexo encimático está composto por tres subunidades diferentes chamadas RecB, RecC e RecD, o que explica o seu nome de RecBCD (Figura 1). Antes do descubrimento do xene recD, o encima recibía o nome de “RecBC.”  Cada subnidade está codificada por un xene separado:

 xene cadea proteína función RecB β  3'-5' helicase, nuclease RecC γ  Recoñece os sitios Chi (crossover hotspot instigator) RecD α  5'-3' helicase

 Función 

miniatura|esquerda| Figura 2  Vía RecBCD da recombinación homóloga na que hai un exceso de ATP.
As subunidades RecD e RecB son helicases, é dicir, motores moleculares dependentes de enerxía que desenrolan o ADN (outras helicase poden desenrolar ARN). A subunidade RecB ademais ten unha función de nuclease. Finalmente, o encima RecBCD (quizais na subunidade RecC) recoñece secuencias específicas no ADN, concretamente a secuencia 5'-GCTGGTGG-3', chamada Chi.

RecBCD é pouco común entre as helicases porque ten dúas helicases que viaxan a diferentes velocidades e porque recoñece e é alterada pola secuencia Chi do ADN. RecBCD únese avidamente a un extremo de ADN bicatenario linear. A helicase RecD desprázase sobre unha febra de ADN cun extremo 5' libre no que o encima inicia o desenrolamento, e RecB faino na febra co extremo 3' libre. RecB é máis lenta que RecD, de maneira que se acumula un bucle de ADN monocatenario por diante de RecB (Figura 2). Isto produce estruturas de ADN con dúas colas monocatenarias (unha máis curta con extremo 3’ e outra máis longa con extremo 5’) e un bucle monocatenario (na febra do extremo 3’) observadas por microscopia electrónica. As colas monocatenarias poden realizar o annealing (emparellamento de bases) para producir un segundo bucle monocatenario complementario do primeiro; ditas estruturas de bucles xemelgos foron denominadas inicialmente “orellas de coello”.

 Mecanismo de acción 
250px|miniatura|Figura 3. Inicio da vía RecBCD da recombinación homóloga con exceso de Mg2+.
Durante o desenrolamento, a nuclease de RecB pode actuar de diferentes xeitos dependendo das condicións de reacción, especialmente as proporcións das concentracións de ións Mg2+ e ATP. (1) Se o ATP está en exceso, o encima simplemente fai unha amosega na febra do ADN con secuencia Chi (a febra co etremo 3' inicial) (Figura 2). O desenrolamento continúa e produce unha cola monocatenaria 3' co Chi preto do seu término. A esta cola pode unirse a proteína RecA, que promove o intercambio de febras cun dúplex de ADN homólogo intacto. Cando RecBCD chega ao extremo do ADN, as tres subunidades desensámblanse e o encima permanece inactivo por unha hora ou máis; unha molécula de RecBCD que actuou na secuencia Chi non ataca outra molécula de ADN. (2) Se os ións Mg2+ están en exceso, RecBCD corta ambas as febras do ADN endonucleoliticamente, aínda que a cola 5' se corta menos frecuentemente (Figura 3). Cando RecBCD encontra sitios Chi na fibra acabada en 3', hai unha pausa no desenrolamento e redúcese a dixestión da cola 3'. Cando RecBCD volve comezar o desenrolamento, agora corta a febra oposta (é dicir, a cola 5') e carga a proteína RecA sobre a febra que acaba en 3’. Despois de completar a reacción nunha molécula de ADN, o encima ataca rapidamente un segundo ADN, sobre a cal ocorren as mesmas reaccións que sobre o primeiro ADN.

Aínda que ningunha das reaccións foi verificada por análises de ADN intracelular, debido á natureza transitoria dos intermediarios de reacción, as evidencias xenéticas indican que a primeira reacción imita máis fielmente a das células. Por exemplo, a actividade de Chi está influenciada por nucleótidos situados no seu lado 3', tanto nas células coma nas reaccións con ATP en exceso pero non con exceso de Mg2+. Os mutantes en RecBCD que carecen de actividade de exonuclease detectable manteñen unha alta actividade de punto quente Chi en células e fan amosegas en Chi fóra das células. Un sitio Chi nunha molécula de ADN en células reduce ou elimina a actividade Chi noutro ADN, quizais reflectindo a desensamblaxe dependente de Chi de RecBCD observada in vitro en condicións de exceso de ATP e creación de amosega no ADN en Chi.

En ambas as condicións da reacción, a febra 3' permanece intacta augas abaixo de Chi. A proteína RecA é despois cargada activamente sobre a cola 3' por RecBCD. En certo momento indeterminado RecBCD disóciase do ADN, aínda que RecBCD pode desenrolar polo menos 60 kb do ADN sen soltarse. RecA inicia o intercambio da febra do ADN á cal se une coa febra idéntica ou case idéntica nun dúplex intacto; este intercambio de febra xera unha molécula de ADN unida, como o bucle D (Figura 2). A molécula de ADN unida pénsase que se resolve por replicación cebada pola febra invasora acabada en 3’ que contén Chi ou por corte do bucle D e a formación dunha unión de Holliday. A unión de Holliday pode resolverse no ADN liñal polo complexo RuvABC ou ser disociado pola proteína RecG. Cada un destes eventos pode xerar ADN intacto con novas combinacións de marcadores xenéticos polos cales os ADNs parentais poden diferenciarse. Este proceso, a recombinación homóloga, completa a reparación de roturas de dobre febra do ADN.

 RecD1 e RecD2 

Os encimas RecD divídense en dous grupos: RecD1 (coñecido como RecD) e RecD2. Moitos organismos teñen o xene recD incluso se non están presentes os outros membros co complexo RecBCD, é dicir Rec B e RecC. Por exemplo, a bacteria Deinococcus radiodurans, que ten unha extraordinaria capacidade de reparación do ADN, é un exemplo dun organismo que non posúe un xene recB ou recC pero si ten un xene recD. Na bacteria Escherichia coli, a proteína RecD forma parte do ben estudado complexo RecBCD neceasario para a  reparación do ADN recombinacional (como se describiu máis ariba). Na bacteria Bacillus subtilis, a proteína RecD2 ten un papel de modulador do reinicio da replicación e tamén un modulador da recombinase RecA.  RecD2 pode inhibir episodios de recombinación non desexados cando as forcadas de replicación están detidas, e tamén pode ter un papel no desprazamento da proteína RecA dos intermediarios de recombinación para permitir o avance da forcada de replicación.

 Aplicacións 
RecBCD é un encima modelo para o uso de fluorescencia dunha soa molécula como na técnica experimental usada para comprender a función das interaccións proteína-ADN. O encima é tamén útil para eliminar ADN liñal, tanto monocatenario coma bicatenario, en preparacións de ADN bicatenario circular, xa que require un extremo de ADN para a súa actividade.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Ligazóns externas 




Categoría:Hidrolases
Categoría:Xenes procariotas
Categoría:Reparación do ADN