ARN en forquita curto

Un ARN en forquita curto ou ARN en forquita pequeno (shRNA/Vector Forquita, do inglés short hairpin RNA) é unha molécula artificial de ARN cun xiro en forquita moi cerrado que se pode usar para silenciar a expresión xénica por medio de interferencia de ARN. A expresión do shRNA en células realízase normalmente pola entrega de plásmidos ou por medio de vectores virais ou bacterianos. O shRNA é un mediador vantaxoso da interferencia de ARN porque ten unha velocidade de degradación e de recambio relativamente baixa. Porén, require o uso dun vector de expresión, que ten o potencial de causar efectos secundarios nas aplicacións medicinais.

A elección de promotor é esencial para conseguir unha expresión robusta de shRNA. Primeiramente, utilizáronse os promotores da ARN polimerase III, como U6 e H1; porén, estes promotores carecen de control espacial e temporal. Entón, pasouse a usar promotores da ARN polimerase II, que son inducibles, para regular a expresión do shRNA.

 Entrega 
A expresión do shRNA en células pode obterse por medio de entrega por plásmidos ou por medio de vectores virais ou bacterianos.

A entrega de plásmidos ás células por transfección para obter a expresión de shRNA pode realizarse usando rectivos dispoñibles comercialmente in vitro. Porén, este método non é aplicable in vivo e ten, pois, unha limitada utilidade.

O uso dun vector bacteriano para obter a expresión do shRNA nas células é unha estratexia relativamente recente. Baséase nunha investigación que mostra que a Escherichia coli recombinante, que contén un plásmido con shRNA, administrada a ratos pode knock-down a expresión do xene diana no epitelio intestinal. Esta estratexia foi utilizada en 2012 en ensaios clínicos para intentar tratar pacientes de polipose adenomatosa familiar.

Poden utilizarse diversos vectores virais para conseguir a expresión dun shRNA en células, como os virus adeno-asociados, adenovirus, e lentivirus. Cos virus adeno-asociados e os adenovirus, os xenomas permanecen episomais. Isto é vantaxoso xa que se evita a mutaxénese insercional. É vantaxoso porque a proxenie da célula perde o virus rapidamente nas divisións celulares a non ser que a célula se divida moi lentamente. Os virus adeno-asociados diferéncianse dos adenovirus en que se lles eliminaron os xenes virais e teñen unha capacidade de empaquetamento diminuída. Os lentivirus intégranse en seccións da cromatina activas transcricionalmente e deste xeito pasan ás células fillas. Con esta estratexia aumenta o risco de mutaxénese insercional; porén, o risco poden reducirse usando un lentivirus deficiente en integrase.

miniatura|esquerda|A proteína Dicer de Giardia intestinalis.

 Mecanismo de acción 
Unha vez que o vector se integrou no xenoma do hóspede, o shRNA é entón transcrito no núcleo pola ARN polimerase II ou ARN polimerase III dependendo do promotor elixido. O produto imita o pri-microRNA (pri-miRNA) e é procesado por Drosha. O pre-shRNA resutante é exportado desde o núcleo pola exportina 5. Este produto é despois pocesado por Dicer e cargado no complexo silenciador inducido por ARN (RISC). A febra con sentido (pasaxeira) é degradada. A febra antisentido (guía) dirixe o RISC ao ARNm que ten unha secuencia complementaria. No caso dunha perfecta complementariedade, o RISC corta o ARNm. No caso dunha complementariedade imperfecta, o RISC reprime a tradución do ARNm. En ambos os casos, o shRNA orixina o silenciamento do xene diana.

 Aplicacións en terapia xénica 
Debido á capacidade do shRNA de proporcionar un silenciamento de xenes específico e de longa duración, houbo moito interese en usar o shRNA para aplicacións terapéuticas. Tres exemplos das terapias baseadas en shRNA explícanse máis abaixo.

Gradalis Inc. desenvolveu a vacina FANG, que se usa no tratamento de cancros avanzados. FANG depende de shRNA bifuncionais (bi-shRNA) contra os factores de crecemento transformantes inmunosupresores TGF β1 e β2. Recolléronse células tumorais autólogas dos pacientes e introduciuse ex vivo por electroporación un plásmido que codifica o shRNA bifuncional e o factor estimulante das colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF). Estas células foron despois irradiadas e inxectadas de novo no paciente.

Marina Biotech desenvolveu CEQ508, que se usa para tratar a polipose adenomatosa familiar. A CEQ508 usa un vector bacteriano para entregar o shRNA contra a β-catenina.

Gradalis Inc. desenvolveu o shRNA bifuncional STMN1 (pbi-shRNA STMN1), que se utiliza para tatar cancros metastáticos ou avanzados. Este pbi-shRNA STMN1 é contra a stathmina 1 e entrégase intratumoralmente por medio da tecnoloxía de vesículas invaxinadas bilamelares (BIV) lipoplex (LP).

A terapia baseada en sh-RNA ten que enfrontarse a varios retos. O máis significativo é a entrega da molécula. O shRNA entrégase normalmente usando un vector, e, aínda que adoitan ser eficientes, supoñen significativos riscos de seguridade. En particular, a terapia xénica baseada en virus demostrou ser perigosa en pasados ensaios clínicos. Na primeira xeración da terapia xénica retroviral, algúns pacientes tratados con vectores virais para a síndrome de Wiskott–Aldrich desenvolveron leucemia de células T aguda. Determinouse que a causa disto foi a localización da inserción do vector viral. A sobresaturación potencial do RISC é tamén un problema. Se o shRNA se expresa a niveis que son demasiado altos, a célula podería ser incapaz de procesar correctamente o ARN endóxeno, o cal causaría problemas significativos. Outro desafío é a posibilidade de que o paciente orixine unha resposta inmunitaria contra a terapia. Finalmente, podería haber efectos fóra de diana e o shRNA podería silenciar outros xenes que non se pretendía tocar. Para desenvolver con éxito novas terapéuticas baseadas no shRNA, todos estes desafíos deben ser tidos en conta.

 Notas 

 Véxase tmén 
 Outros artigos 
 ARN interferente pequeno
 VIRsiRNAdb

Categoría:ARN
Categoría:Interferencia de ARN