Calorimetría isoterma de titulación

En termodinámica química, a calorimetría isoterma de titulación ou calorimetría isotérmica de titulación (CIT ou ITC na literatura inglesa) é unha técnica física usada para determinar os parámetros termodinámicos das interaccións nunha solución. A CIT é a única técnica con capacidade de caracterizar completamente os perfís termodinámicos e cinéticos dunha interacción molecular ao determinar simultaneamente as constantes de unión (), a estequiometría da reacción (), a entalpía (), a enerxía libre de Gibbs () e a entropía () cun só experimento. Consta de dúas células que están encerradas nunha cuberta adiabática. 

Os compostos que se van estudar sitúanse na célula de mostras, mentres que a outra célula, a célula de referencia, utilízase como control e contén o tampón no cal a mostra se disolve. A técnica cuantifica a calor liberada ou absorbida durante o proceso de unión ao engadir incrementalmente un reactivo (por medio dunha xeringa) a outro (na célula de mostras) mentres se mantén a temperatura e a presión constantes. Os aparellos sensibles á calor na CIT detectan as variacións de temperatura entre as dúas células, transmitindo esta información aos quentadores que se axustan en consecuencia para restaurar o equilibrio térmico entre as células. Esta enerxía convértese en entalpía de unión usando a información sobre as concentracións dos reactivos e o volume da célula. Comparado con outros calorímetros, a CIT non require ningún corrector, xa que non hai intercambio de calor entre o sistema e o ambiente. A CIT é tamén moi sensible e ten un rápido tempo de resposta e vantaxes polos seus modestos requirimentos de mostra. Aínda que a calorimetría de varrido diferencial pode tamén proporcionar información directa sobre a termodinámica das interaccións de unión, a CIT ofrece a capacidade engadida de cuantificar a termodinámica da unión de ións metálicos a proteínas.

 Historia da CIT 

A historia da CIT pode remontarse ata a década de 1930 cando se utilizou a calorimetría isoterma para o estudo de reaccións químicas. En 1965 Christensen e Izatt introduciron a calorimetría de titulación como método para deteminar simultaneamente a constante de equilibrio e a entalpía. As técnicas de CIT foron desenvolvidas por H. D. Johnston en 1968 como parte da súa tese de doutoramento na Universidade de Brigham Young, e foron consideradas unha área especializada ata que a introduciu comercialmente MicroCal Inc. en 1988. En 1978, Beaudette e Langerman realizaron un dos primeiros estudos de unión calorimétricos usando un calorímetro de titulación isoperibol de pequeno volume e unha década despois, en 1989, Wiseman, Williston, Brandts e Lin demostraron a súa aplicación en sistemas biolóxicos, marcando o comezo da calorimetría de titulación como feramenta valiosa para o estudo dos equilibrios biolóxicos. Orixinalmente, a CIT era principalmente usada para estudar a unión de pequenas moléculas (como os compostos medicinais) a macromoléculas máis grandes (proteínas, ADN etc.) nun ambiente sen etiquetaxe. Agora as súas aplicacións son máis amplas, grazas ás melloras modernas, o que fixo posible medir efectos da calor de tan só 0,1 μcal (0,4 μJ) e determinar constantes de unión (K) elevadas de ata 108–109 M−1.

 Medicións termodinámicas 
miniatura|400x400px|O termograma CIT; o panel superior esuerdo mostra a curva de titulación; o panel inferior esquerdo mostra o termograma CIT correspondente; o panel da dereita mostra o termograma CIT con diferentes valores c.
A CIT (ou ITC) é unha técnica cuantitativa que pode determinar a afinidade de unión (), entalpía de reacción (), e estequiometría de unión () da interacción entre dúas ou máis moléculas en solución. Isto conséguese medindo as entalpías dunha serie de reaccións de unión causadas por inxeccións dunha solución dunha molécula a unha célula de reacción que contén unha solución doutra molécula. Os valores de entalpía represéntanse graficamente en relación coas razóns molares resultantes das inxeccións. A partir da gráfica determínanse a entalpía da reacción molar , a constante de afinidade () e a estequiometría polo axuste de curvas. Poden determinarse o cambio de enerxía libre de Gibbs da reacción () e o cambio de entropía () usando as relacións:



(onde  é a constante dos gases e  é a temperatura absoluta).

Para medidas exactas da afinidade de unión, a curva do termograma debe ser sigmoidal. Unha curva sigmoidal de moita pendente indica unha unión forte, mentres que se ten menos pendente a unión é máis débil. O perfil da curva determínase polo valor c, que se calcula usando a ecuación:



onde  é a estequiometría da unión,  é a constante de asociación e  é a concentración da molécula na célula.Quick Start: Isothermal Titration Calorimetry (ITC) (2016). TA Instrument. New Castle, DE.VP-ITC Instruction Manual (2001). Microcal Inc., Northampton, MA. O valor c debe estar entre 1 e 1000, idealmente entre 10 e 100. En termos de afinidade de unión, sería aproximadamente desde  ~  dentro do rango límite.Stevenson, M. J. (2016) Thermodynamic studies of Cu(I) and other d10 metal ions binding to proteins in the copper homeostasis pathway and the organomercurial detoxification pathway. Dartmouth College. Se non está entre o rango mencionado, os valores termodinámicos obtidos do experimento son menos robustos para facer unha interpretación.

 Medidas instrumentais 
miniatura|400x400px|Esquema dun instrumento de CIT que mostra a célula de referencia, a célula de mostras e a inxección do ligando.
Un calorímetro de titulación isoterma está composto por dúas células idénticas feitas dun material condutor térmico moi eficiente e quimicamente inerte, como a aliaxe Hastelloy ou ouro, rodeado por unha cuberta adiabática. Neste dispositivo, unha das células, a célula de mostras, contén a solución dun reactivo, e a outra célula, a célula de referencia, está chea cun tampón ou con auga. 

O segundo reactivo, que ten unha maior concentración que o primeiro, sitúase nunha xeringa e inxéctase gradualmente na célula de mostras en pequnas alicuotas durante o proceso de titulación. Este proceso está semiautomatizado e os circuítos termopila/termopar sensibles usados para detectar as diferenzas de temperatura entre a célula de referencia (chea con tampón ou con auga) e a célula de mostras que contén a macromolécula. Antes da adición do ligando, aplícase unha corrente constante (<1 mW) á célula de referencia. Isto dirixe un circuíto de retroalimentación, activando un quentador localizado na célula de mostras. Durante o experimento, o ligando titúlase na célula de mostras en alícuotas coñecidas con precisión, causando que se capte ou desprenda calor (dependendo da natureza da reacción). As medidas constan de entradas de corrente dependentes do tempo que cómpren para manter temperaturas iguais entre as células de mostras e de referencia.

miniatura|Titulación paso a paso dun reactivo (na xeringa) noutro reactivo (na célula de mostras).
Nunha reacción exotérmica, a temperatura na célula de mostras aumenta coa adición do ligando. Isto causa que a potencia de retroalimentación da célula de mostras decreza (lembremos: aplícase unha potencia de reference á célula de referencia) para manter unha temperatura igual entre as dúas células. Nunha reacción endotérmica ocorre o contrario; o circuíto de retroalimentación incrementa a potencia para manter unha temperatura constante (operación isotérmica).

As observacións represéntanse graficamente tendo en conta a corrente necesaria para manter a célula de referencia e a célula de mostras a temperatura idéntica fronte ao tempo. Como resultado, os datos brutos do experimento consisten nunha serie de picos de fluxo de calor, e cada pico corresponde a unha inxección de ligando. Eses picos/pulsos de fluxo de calor son integrados con respecto ao tempo, dando a calor total intercambiado por inxección. Integrando cada pico desde a liña base, obtense a calor total asociada con cada inxección, incluíndo tanto as contribucións específicas da reacción coma as non relacionadas coa reacción. O padrón deses efectos de calor en función da razón molar [ligando]/[macromolécula] poden analiarse despois para dar os parámetros termodinámicos da interacción estudada.

 Procedementos experimentais 
miniatura|381x381px|Un exemplo de configuración de parámetros experimentais para CIT, incluíndo o número de inxeccións, volume da inxección inicial, volumes das inxeccións seguintes, temperatura, potencia de referfencia, velocidade de axitación, atraso inicial e período de filtración.
Para medir con precisión os parámetros termodinámicos usando a CIT, deben seguirse certos procedementos que implican a instrumentación, a configuración de parámetros, cargado da mostra, selección do tampón e limpeza dos instrumentos. Para obter un resultado óptimo, a cada inxección debe dárselle o tempo suficiente para que se chegue ao equilibrio da reacción. Para obter boas medidas adoita ser necesaria a desgasificación da mostra, xa que a presenza de burbullas de gas dentro da mostra produce gráficas de datos anormais nos resultados rexistrados. O experimento enteiro ten lugar baixo o control dun computador.

A titulación directa realízase normalmente con CIT para obter os datos termodinámicos, unindo os dous compoñentes da reacción directamente. Porén, moitas das reacción químicas e interaccións de unión poden ter unha maior afinidade de unión que a que é conveniente coa ventá c. Para solcionar esta limitación da ventá c e as condicións para certas interaccións de unión, poden utilizarse varios métodos de titulación. Nalgúns casos, o problema pode resolverse simplemente facendo unha titulación inversa de cambio de mostras entre a xeringa de inxección e a célula de mostras, dependendo do mecanismo de unión. Porén, o proceso de introducir un ligando nunha macromolécula é distinto do proceso de engadir macromoléculas a un ligando. Aínda que o equilibrio de unión non cambia tanto na titulación directa coma na inversa, a ruta ao equilibrio e os estados de unión accesibles varían, especialmente cando unha molécula posúe moitos sitios de unión para a outra. A maioría das unións de alta ou baixa afinidade requiren quelación ou titulación competitiva. Este método faise cargando a solución do complexo pre-unión na célula de mostras e quelando un dos compoñentes cun reactivo de maior afinidade de unión observada dentro da ventá c conveniente.

Para asegurar unha estabilidade óptima do instrumento da CIT, este debería conectarse polo menos un día antes do seu uso. As mostras idealmente deberían ser pre-equilibradas a aproximadamente 2 °C por debaixo da temperatura experimental buscada para reducir o tempo de estabilización despois de cargar, aínda que empezar á temperatura experimental exacta é tamén unha opción. Para a limpeza dos instrumentos, a célula de mostras debería lavarse co tampón experimental e secarse ao baleiro, e calquera resto de solución que puidese quedar debería ser eliminada manualmente cunha xeringa. Entón, a célula de mostras énchese coa solución experimental e a célula de referencia con auga de alta pureza ou co mesmo tampón. Para impedir a contaminación do aire, utiízanse as xeringas de Hamilton impermeables aos gases, asegurando que a agulla está situada preto do fondo da célula de mostras antes de deitar o líquido lentamente. Os parámetros experimentais como o número de inxeccións, volume da inxección inicial, volumes das inxeccións seguintes, temperatura, potencia de referencia, velocidade de axitación, espazado, atraso inicial e período de filtración debería axustarse de acordo do estudo específico que se vai realizar.

Se o experimento se debe repetir, a xeringa debería baleirarse, e a solución se tírase ou gárdase para posteriores análises. Antes de volver a encher a xeringa coa mesma solución, a agulla da xeringa debería lavarse externamente e secarse con papel sen peluxe, sen necesidade de facer un lavado interno. Porén, cando se cambia a un reactivo ou concentración diferente, a xeringa debe lavarse ben con chorros de etanol e metanol, e secarse coidadosamente no baleiro, usando un ThermoVac para VP-ITC ou os sistemas de baleiro integrados noutros modelos. A célula de mostras debe baleirarse usando a xeringa de cargado e lavarse moitas veces con auga.

 Análise e interpretación 

 Análise a posteriori e inventario de protóns 

Para determinar o tampón ou a entalpía independente do solvente a partir da termodinámica experimental cómpre realizar unha análise a posteriori (ou post-hoc). Os datos obtidos experimentalmente non só reflicten a termodinámica de unión das interaccións de interese, senón calquera contribución de equilibrio de competencia asociado. Unha análise deste tipo pode realizarse para determinar o tampón ou a entalpía independente do solvente a partir da termodinámica experimental, simplemente seguindo o proceso da lei de Hess. O exemplo seguinte mostra unha interacción simple entre un ión metálico (M) e un ligando (L). B representa o tampón usado para esta interacción e H+ representa protóns.M - B  <=> M + B                  -\Delta H_{MB}

L - H <=> L + H+                 

 H+ + B <=> H - B                

M + L <=> M - L                   
miniatura|230x230px|Un exemplo dun gráfico de inventario de protóns dunha interacción de unión. Preséntanse os valores medios de entalpía obtidos con tres condicións de tampón diferentes (TAPSO, bis-Tris e HEPES). Os eixes X e Y corresponden á entalpía de protonación do tampón e a entalpía observada nos experimentos realizados, respectivamente.
Por tanto,o cal pode ser operado para calcular a entalpía da interacción metal-ligando. Aínda que este exemplo é entre un metal e un ligando, é aplicable a calquera experimento de CIT que teña que ver con interaccións de unión.

Como parte da análise, son necesarios un número de protóns para calcular a termodinámica independente do solvente. Isto pode facerse doadamente cunha representación gráfica como se mostra abaixo.

A ecuación linear desta gráfica é a versión arranxada da ecuación de arriba a partir da análise a posteriori en forma de y = mx + b:

 Constante de equilibrio 
A constante de equilibrio da reacción é tamén independente doutros equilibrios en competencia. A competición incluíría as interaccións do tampón e outras reaccións dependentes do pH que dependen das condicións experimentais. A competición de especies distintas das especies de interese está incluída no factor de competición, Q na seguinte ecuación:onde,  representa a especie, como o tampón ou protóns,  representa as súas constantes de equilibrio, cando,

 Aplicacións 

Nos últimos 30 anos, a CIT foi utilizada en moitos campos, que van desde os estudos de unión de metais ao descubrimento de fármacos e a investigación de nanomateriais. Nos primeiros tempos, esta técnica utilizábase para determinar valores termodinámicos fundamentais para interaccións moleculares pequenas básicas. En anos máis recentes, a CIT utilizouse en áreas con máis aplicacións industriais, como o descubrimento de fármacos e o testado de materiais sintéticos. Se ben aínda se usa moito en química fundamental, a tendencia de aplicación cambiou á área da bioloxía, onde os valores libres de etiquetaxeLaboratory notes: Biotechniques  Label-Free Analysis of Biological Interaction e independentes de tampón son relativamente máis difíciles de obter.

 Cinética encimática 

Usando datos termodinámicos de CIT, é posible deducir a cinética encimática incluíndo a transferencia de electróns e protóns, alostería e cooperatividade e a inhibición encimática. Os instrumentos modernos de CIT poden medir valores de calor de só 0,1 μcal/sec, o que permite unha determinación precisa das velocidades de reacción no rango de 10−12 mol/sec e a CIT pode determinar valores para a Km e a kcat, nos rangos de 10−2–103 μM e 0,05–500 sec−1, respectivamente. A CIT recolle datos ao longo do tempo que son útiles para calquera experimento cinético, pero especialmente coas proteínas debido ás alícuotas constantes de inxeccións. En canto ao cálculo, as constantes de equilibrio e as pendentes de unión poden utilizarse directamente para determinar a alostería e a transferencia de carga, comparando datos experimentais de diferentes condicións (pH, uso de cadeas de péptido e sitios de unión mutados, etc.). Comprobouse que os datos cinéticos obtidos a partir da CIT se aliñan estreitamente cos resultados  doutros métodos puramente cinéticos, como a resonancia plasmónica de superficie.

 Estudos de membranas e autoensamblaxe de pétidos 
As proteínas de membrana e as propiedades de autoensamblaxe de certas proteínas poden estudarse con esta técnica debido a que é un calorímetro libre de etiquetaxe. Coas proteínas de membrana hai a dificultade da selección dos protocolos axeitados de solubilización e purificación. Como a CIT é unha ferramenta calorimétrica non destrutiva, pode utilizarse como detector para localizar a fracción da proteína cos sitios de unión desexados, unindo á proteína un ligando de unión coñecido. Esta característica tamén se aplica en estudos de proteínas que se autoensamblan, especialmente no uso de medir a termodinámica da súa transformación estrutural.

 Desenvolvemento de fármacos 

A CIT pode proporcionar ideas para o desenvolvemento de fármacos ao carcterizar a afinidade, selectividade, cambios conformacionais inducidos por ligando e repartición de fármacos en mambranas. A afinidade de unión ten unha grande importancia en química medicinal, xa que os fármacos deben unirse de forma efectiva ás proteínas dentro do rango desexado. Un proceso de unión exotérmico cunha entalpía favorable considérase unha característica conveniente para moléculas que se unen a proteínas específicas, como indica o seu forte potencial para a optimización e alta selectividade. Porén, determinar os cambios de entalpía e a optimización de parámetros termodinámicos é moi difícil cando se están deseñando fármacos. A CIT soluciona este problema facilmente ao deducir a afinidade de unión, as contrbucións entálpicas/entrópicas e a súa estequiometría de unión.

 Química quiral 

Aplicando as ideas mencionadas, con esta técnica pode deducirse a quiralidade de compostos organometálicos. Cada composto quiral ten as súas propias propiedades características e mecanismos de unión que se poden comparar entre si, o cal orixina diferenzas nas propiedades termodinámicas. Unindo solucións quirais nun sitio de unión pode deducirse o tipo de quiralidade e, dependendo do propósito, qué composto quiral é o máis axeitado para unirse.

 Interaccións de unións de metais 
Unir ións metálicos a proteínas e outros compoñentes do material biolóxico é un dos usos máis populares da CIT, como o estudo da unión da ovotransferrina ao ferro férrico publicado por Lin et al. de MicroCal Inc. Isto débese a que algúns dos ións metálicos utilizados en sistemas biolóxicos teñen configuracións electrónicas d10 que non se poden estudar con outras técnicas comúns como a espectrometría UV-Vis ou a resonancia paramagnética de electróns. Tamén está estreitamente relacionada a estudos bioquímicos e medicinais debido á grande abundancia de encimas que se unen a metais en sistemas biolóxicos.

 Nanotubos de carbono e materiais relacionados 
A técnica foi moi utilizada no estudo de nanotubos de carbono para determinar as interaccións de unión termodinámicas con moléculas biolóxicas e interaccións de compositos de grafeno. Outro uso notable da CIT con nanotubos de carbono é a optimización da preparación de nanotubos de carbono a partir de compostos de grafeno e alcohol polivinílico (PVA). O proceso de ensamblaxe do PVA pode medirse termodinamicamente, xa que mesturar os dous ingredientes é unha reacción exotérmica, e a súa unión adoita poder observarse ben coa CIT.

 Interaccións nanopartícula-proteína 

A CIT é cada vez máis utilizada para estudar as interaccións proteína-nanopartícula que proporcionan datos clave sobre a afinidade de unión (en forma de constantes de asociación), mecanismos de interacción (cuantificados por medio da entalpía de unión, entropía de unión e enerxía libre de Gibbs), e estequiometría de unión. Estes parámetros termodinámicos obtidos pola CIT poden axudar a avaliar as modificacións estruturais en proteínas despois da adsorción á superficie de nanopartículas.

 Limitacións 

Unha das principais limitacións da CIT é que ten tendencia a permitir só a detección de conformacións de unión de forza moderada, o que a fai menos efectiva na detección de eventos de unión moi febles ou extremadamente fortes. Por tanto, cóstalle traballo proporcionar parámetros termodinámicos exactos de procesos de cinética lenta con constantes de tempos longos, xa que estas interaccións poden ser enmascaradas polo ruído de base e a variabilidade. Por outra parte, medir as interaccións de alta afinidade pode ser todo un reto cando tardan varios minutos ou máis en desenvolverse totalmente, ou se o sinal medido depende da entalpía de reacción. Cando a entalpía de unión está próxima a cero, a CIT pode non conseguir xerar datos de interacción significativos, e produce no seu lugar unha serie de picos uniformes pequenos que resultan en termogramas planos e pouco informativos.

A CIT tamén é susceptible á interferencia de sinais de calor non relacionadas, facendo difícil illar e interpretar os cambios de calor asociados coa interacción de interese. Outras limitacións son as restricións de solubilidade, as dificultades á hora de determinar con precisión a concentración de proteínas e a necesidade de preparar o ligando nas mesmas condicións de solución que a proteína para ter medidas fiables.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Calorimetría de varrido diferencial
 Interferometría de polarización dual
 Calorimetría de sorción
 Calorimetría de perturbación de presión
 Resonancia plasmónica de superficie

 Bibliografía 
 Obdulio López Mayorga. Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC). Departamento de Química Física. Universidade de Granada. 

Categoría:Técnicas de laboratorio
Categoría:Métodos bioquímicos
Categoría:Biofísica
Categoría:Termodinámica química
Categoría:Calorimetría