Citocalasina B

A citocalasina B (CB), cuxo nome procede do grego cytos ('célula') e chalasis ('relaxación'), é unha micotoxina que pode permear as células. Concentracións subestequiométricas de citocalasina B inhiben fortemente a formación de redes de filamentos de actina. Debido a isto, úsase con frecuencia en investigacións biolóxicas. Inhibe a división do citoplasma (citocinese) ao bloquear a formación de microfilamentos contráctiles. Inhibe o movemento celular e induce a extrusión nuclear. A citocalasina B acurta filamentos de actina ao bloquear a adición de monómeros no extremo de crecmento rápido dos polímeros. A citocalasina B inhibe o transporte de glicosa e a agregación de plaquetas. Bloquea a formación de corpos apoptóticos inducidos pola adenosina sen afectar a activación da ADP-ribosilación endóxena en células HL-60 de leucemia.
Tamén se usa na clonación por transferencia nuclear, na cal as células receptoras enucleadas son tratadas con citocalasina B. A citocalasina B fai que o citoplasma do ovocito sexa máis fluído e fai posible que se aspire o xenoma nuclear do ovocito dentro dunha pequena vesícula de membrana cunha microagulla. Polo tanto, o xenoma do ovocito é retirado de dita célula, á vez evitando a rotura da membrana plasmática.

Este alcaloide íllase do fungo Helminthosporium dematioideum.

 Historia 

 Década de 1960 
A citocalasina B (CB) foi descrita por primeira vez en 1967, cando o dr. W.B. Turner a illou de mofos. Smith et al. atoparon que a CB causa a multinucleación en células e afecta significativamente á mobilidade celular. As células multinucleadas orixínanse probablemente polo fallo do control mitótico, o que causa variacións de tamaño e forma dos núcleos en interfase.

 Década de 1970 
Na década de 1970 realizáronse investigacións sobre a mitose de células polinucleadas. Parece que estas células foron creadas pola adición progresiva de núcleos en vez de por división nuclear. O proceso polo cal isto ocorre chámase pseudomitose, que é unha mitose síncrona que resulta da división dun só núcleo. Os núcleos separados están unidos a unha ponte nuclear e en células binucleadas os centríolos están duplicados.
Ademais, atopoue que a CB causa a desorganización dos microfilamentos de 50 Å de células epiteliais de ratos, o que causa que as células perdan a súa forma. Tamén afecta a aparencia das glándulas novas en células e a formación de novas glándulas  noutras células.
Outro grupo encontrou que a CB inhibe a capacidade das células HeLa de realizaren a citocinese pola descomposición do seu anel contráctil.
Investigacións realizadas en 1971 mostraron que a CB interfire coa liberación de iodo derivado da tiroglobulina e bloquea a endocitose do coloide da tiroide. Ademais, a CB tiña un efecto inhibitorio sobre a captación de sacarosa tritiada (3H) en células hepáticas humanas da cepa Chang e en células tratadas con CB observáronse alteracións na aparencia e localización de microfilamentos.  Ademais, a CB inhibía reversiblemente o movemento de gránulos de melanina en melanocitos.
Un ano despois, fixéronse investigacións sobre a influencia da CB sobre os cloroplastos. Atopouse que o movemento orientado pola luz dos cloroplastos é reversiblemente inhibido pola citocalasina B.
En 1973 atopouse que a citocalasina B é un poderoso inhibidor non competitivo do transporte da glicosa. Unha das principais proteínas de membrana dos eritrocitos identificables electroforeticamente pode ser o sitio de unión da citocalasina B  dos eritrocitos.

 Desde 1980 
No seguintes anos aumentou o coñecemento sobre a citocalasina B. Como xa se tiña unha comprensión xeral sobre a molécula, realizáronse análises máis detalladas como, por exemplo, sobre o mecanismo de acción.

 Produción 
As citocalasinas poden illarse dos fungos nas que aparecen de reforma natural. Orixinalmente, foron illadas de Helminthosporium dematioideum. Outros produtores son fungos dos xéneros Phoma e Hormiscium e os da especie Curvularia lunata.
Ademais, poden sintetizarse no laboratorio. Hai varias estratexias que se poden seguir. Primeiramente, é posible para formar o anel de seis membros do núcleo da isoindolona e o anel macrocíclico máis grande simultaneamente nunha ciclación de Diels-Adler intramolecular nunha fase tardía. En segundo lugar, é posible formar primeiro o núcleo de isoindolona na reacción de Diels-Alder intermolecular e nun segundo paso engadir o macrociclo en varios pasos.

 Propiedades 
A citocalasina B contén varios grupos ceto e hidroxilo moi polares e unha unidade bencilo lipofílica periférica.

 Mecanismo 
Suxeriuse que o mecanismo predominante da citocalasina B (CB) é a inhibición da polimerización dos filamentos de actina ao unirse ao extremo de crecemento rápido ("con pugas") dos filamentos de actina F. Unha alternativa podería ser a intervención de proteínas caparuza. Ao facer isto, a CB non só inhibe a polimerización da actina senón tamén procesos consecutivos como a construción da rede de filamentos.
Esta inhibición pode afectar aos tres pasos principais da polimerización da actina, que son:
 Nucleación: Fórmase un núcleo inicial mínimo de 3 monómeros de actina.
 Elongación: Este núcleo úsase para a elongación engadindo máis monómeros de actina.
 Estado estacionario/anelamento: Chégase a un equilibrio entre a polimerización e a despolimerización  (estado estacionario ou estable). O filamento de actina F deixa de medrar e os dous extremos de crecemento rápido fusiónanse para crear un filamento.

A nucleación é esencial para a acumulación de filamentos. A oligomerización é o paso limitante da velocidade, considerando a formación do filamento de actina no seu conxunto. A chamada fase retardada da polimerización da actina orixínase neste paso. A polimerización tarda bastante e comezar, mais unha vez que o fai, o proceso é autocatalítico ata que se chega ao máximo da velocidade de polimerización fisiolóxica.

A elongación está favorecida no extremo de crecemento rápido do filamento en crecemento. Aquí, a influencia da citocalasina B depende fortemente das condicións globais da elongación. Se se dan as condicións fisiolóxicas ideais, a influencia inhibitoria da citocalasina B é minúscula. Se as condicións son menos óptimas, a elongación pode ser inhibida ata nun 90 %.

O anelamento (annealing) é o último paso da polimerización. Os experimentos indican que nesta fase as células tratadas con citocalasina B e as células do grupo de control non se poden distinguir, o cal indica que a CB non exerce un efecto significativo nesta etapa.

A CB contén un éster beta-insaturado que pode sufrir unha conxugación de tipo Michael con nucleófilos. Se ese é o caso, a adución do ADN podería ser unha reacción posterior plausible. Unha reacción máis axeitada parece ser entre grupos tiol de varias  biomoléculas. Os grupos tiol xa non estarían dispoñibles despois para crear pontes disulfuro para unha ulterior polimerización da actina e así inhíbese un paso crucial na polimerización da actina a medida que se bloquean os extremos de crecemento rápido dos filamentos. Un principio análogo úsano as ben estudadas proteínas de caparuza que constitúen un factor limitante natural da polimerización da actina.
O primeiro paso na polimerización da actina, unha vez que se iniciou a polimerización, é a desprotonación do grupo tiol da actina G. Isto deixa o átomo de xofre cargado, o cal queda dispoñible para a polimerización da actina. Se está presente a citocalasina B na célula, a desprotonación do tiol é completa. O grupo éster beta-insaturado reactivo da citocalasina B reacciona co grupo tiol da actina por medio dun ataque nucleofílico do xofre cargado sobre o átomo do carbono beta. Isto forza o enlace π a desprazarse ao lado esquerdo do carbono beta. En consecuencia, prodúcese mesomería, desprazando a carga negativa entre o carbono alfa e o átomo de oxíxeno. Este paso é seguido dun paso de protonación para contrarrestar a carga negativa. O ión hidronio necesario para facelo produciuse durante a activación do átomo de xofre nun paso anterior.

 Metabolismo 
Hai dez sitios posibles comprobados para a degradación in vitro da citocalasina B. Aínda non hai probas de que eses mesmos sitios se usen para a degradación in vivo.
A degradación por unha clivaxe de per-iodato do composto, que ten lugar nos carbonos 14 e 21. Como resultado, libéranse ácido carbónico, formaldehido, 5-metilhexano-1,1,6-triol e unha gran molécula restante. O 5-metilhexano-1,1,6-triol e a gran molécula restante son despois oxidados por medio da reacción de Kuhn Roth, o que leva á formación de 7-hidroxiheptanal, ácido acético e ácido benzoico. Unha vez máis, queda unha molécula máis grande. Por outra parte, o 7-hidroxiheptanal, o ácido acético e o ácido benzoico poden experimentar a reacción de Schmidt, se non se degradan por medio da degradación ácida por alcohol deshidroxenase (ADH) a metilamina e dióxido de carbono. O 7-hidroxiheptano é oxidado a 3-ácido metilheptanedioico. Reaccións metabólicas adicionais levan á formación de varias moléculas orgánicas máis pequenas como as aminas, dióxido de carbono e ácido acético. Este último é agora metabolizado pola ADH a metilamina e dióxido de carbono. A molécula restante grande clívase dando varios compostos pequenos como o ácido acético, a metilamina e o dióxido de carbono, e unha serie de compostos metilados pequenos.

 Eficacia e efectos adversos 

 Interaccións 
Cando se engade citocalasina B (CB) e o agonista beta-adrenérico (-)-isoproterenol, prostaglandina E1 ou a toxina do cólera a células de linfoma S49 de tipo salvaxe, acumúlase adenosín monofosfato cíclico (AMPc). A CB non pode transformar células tumorais similares ás 3T3, pero si incrementa a frecuencia de transformación celular polo poliomavirus multiplicándoa por entre 8 e 40. Ademais, a CB pode intensificar a pinocitose, que é inducida pola concanavalina A en Amoeba proteus. A CB pode tamén interaccionar co ácido indol-3-acético do grupo das auxinas, o cal ocorre en segmentos do coleóptilo de trigo e raíces de millo. Isto orixina a inhibición do transporte de vesículas e a secreción de compoñentes da parede celular e, dese modo, bloquea a elongación e o crecemento.

 Eficacia 

Os estudos in vitro mostraron que unha concentración de 30 μM de citocalasina B reducía significativamente a viscosidade relativa dunha solucion de filamentos de actina 20 μM normal, así como diminuía en 20 μMm a da solución de filamentos de glutationil-actina.
A concentración efectiva in vivo é aínda menor. Parece que unha concentración de 2 μM é dabondo en células vivas para ter unha influencia medible na polimerización da actina. A fase de nucleación tardaba 2-4 veces máis nos grupos de control. Na elongación, os efectos eran mínimos; no anelamento eran insignificantes. Isto podería deberse a que hai unha diferenza real nas interaccións moleculares da CB durante eses tres pasos ou simplemente deberíase a que a fase retardada é o paso limitante da velocidade na polimerización global.

 Aplicacións 
 Estudos sobre a polimerización da actina 
Como a citocalasina B inhibe a polimerización dos filamentos de actina, quedan afectados moitos procesos celulares que dependen do funcionamento dos filamentos de actina. Inhíbese a citocinese, aínda que a mitose non se ve afectada. Debido aos efectos sobre varias funcións celulares pero a falta de toxicidade xeral, a CB aplícase nos estudos da polimerización da actina, métodos de obtención de imaxes das células, estudos do ciclo celular e posiblemente pode usarse como fármaco anticancro.

 Inhibe a división celular 
A citocalasina B úsase para tstar a xenotoxicidade de substancias. Para facelo, aplícase o ensaio de micronúcleos e bloqueo da citocinese (ensaio CBMN, do inglés cytokinesis-block micronucleus assay) con linfocitos humanos. Isto funciona in vitro.
Os micronúcleos poden detectarse durante a anafase da mitose e meiose. Estes son núcleos pequenos que conteñen un cromosoma ou parte dun cromosoma que non chega a un dos polos da célula durante a división celular. O test CBMN está baseado en que só as células en división poden expresar micronúcleos, o cal significa que só nesas células se poden detectar os danos cromosómicos. Como a xenotoxicidade causa anormalidades na célula en división, poden detectarse micronúcleos en células binucleadas. A citocinese, que é o seguinte paso, é inhibida pola citocalasina B. Unha vantaxe clave deste método é que permite a detección simultánea de múltiples eventos moleculares que orixinan danos nos cromosomas e inestabilidade cromosómica.
O ensaio CBMN foi aplicado con éxito a linfocitos humanos normais, linfocitos do bazo de ratos, fibroblastos de rato e fibroblastos do hámster chinés.

 Inhibe o movemento de células 

A citocalasina B pode facer diminuír o número de células móbiles cando se engade a células de sarcoma de Yoshida. Pode tamén facer diminuír a motilidade das células e inhibe dependendo da dose o seu crecemento.
Como a citocalasina B penetra desigualmente nas células, promove contraccións focais da rede rota de filamentos de actina cortical pola acción da miosina. Isto causa superprecipitación, que require contraccións activas e, xa que logo, un metabolismo enerxético activo. As contraccións corticais desorganizadas distorsionan a ensamblaxe dos pseudópodos que interveñen no movemento celular.

 Induce a extrusión nuclear 
A extrusión nuclear inducida pola citocalasina B empeza co movemento do núcleo en dirección á membrana plasmática, seguido da formación dun avultamento na membrana. Despois, o núcleo móvese ao exterior da membrana, pero permanece conectado coa célula por unha ponte citoplásmica con forma de fío. Se a célula se mantén nun medio que contén citocalasina B por varias horas, o proceso faise irreversible. A extrusión podería ser axudada polo debilitamento da membrana plasmática inducido pola citocalasina B.

 Inhibe o transporte de glicosa 

A citocalasina B únese covalentemente a proteínas tansportadoras de glicosa de mamíferos cando se irradia con luz UV. Únese máis estreitamente á AraE e GalP que os seus substratos habituais. A citocalasina B inhibe GLUT1, 2, 3 e 4. A unión a GLUT1 acontece no interior a medida que a citocalasina B actúa como inhibidor competitivo da saída de glicosa. Probas adicionais proceden de estudos de fotoetiquetado nos cales o Trp388 e o Trp412 da proteína purificada son etiquetados despois de expoñelos a citocalasina B etiquetada. Como os Trp388 e Trp412 mutados non reducen completamente a inhibición de GLUT1, suponse que hai outros sitios adicionais implicados na unión da citocalasina B.

 Usos terapéuticos 
Tamén se realizaron investigacións sobre a citocalasina B con fins terapéuticos.
Por exemplo, examináronse os efectos da citocalasina B en células tumorais causados por macrófagos activados polo BCG (Bacilo Calmette-Guerin). Observouse que a citocalasina B potencia a lise celular do tumor e a stasis debido á acción de macrófagos activados a unha concentración de 10−7 M. A citocalasina B non actúa directamente sobre os propios macrófagos, senón que exerce o seu efecto predominanemente sobre a célula tumoral. Unha razón podería ser que a citocalasina B inhibe a formación de filamentos de actina, que podería ser importante para a destrución das células tumorais polos macrófagos activados.

 Outros efectos 
A citocalasina B ten un efecto sobre a secreción de hormona tiroide e hormona do crecemento.
A biosíntese de fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina é inhibida pola citocalasina B, como demostraron George et al. Faino ao inhibir a conversión da fosfoetanolamina a CDP-etanolamina. Propúxose que o mecanismo está asociado con alteracións dos ións de calcio intracelulares. A citocalasina B tamén ten efectos sobre microorganismos. Por exemplo, o crecemento e diferenciación de Entamoeba histolytica é inhibida. Ademais, a citocalasina B ten un efecto inhibitorio sobre o crecemento celular sen causar efectos inmunosupresores polongados ou profundos.

 Contexto natural 
Na natureza, a citocalasina B intervén na virulencia fúnxica, estrago de alimentos e no mentemento da simbiose entre o hóspede e o simbionte.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
Merck Index 13, 2819.

Categoría:Inhibidores da actina
Categoría:Lactonas
Categoría:Micotoxinas
Categoría:Compostos de vinilideno
Categoría:Compostos heterocíclicos