Ribonuclease pancreática bovina

A ribonuclease pancreática bovina, a miúdo tamén denominada ribonuclease A pancreática bovina ou, simplemente, RNase A, é un encima ribonuclease pancreática que corta ARN  monocatenario. A ribonuclease pancreática bovina é un dos sistemas modelo clásicos no estudo de proteínas. Outorgáronse dous Premios Nobel de Química en recoñecemento de traballos realizados sobre a ribonuclease pancreática bovina: en 1972 o premio recibírono Christian Anfinsen polo seu traballo sobre o pregamento de proteínas e Stanford Moore e William Stein polos seus traballos sobre as relacións entre a estrutura terciaria das proteínas e o seu mecanismo químico; en 1984 o premio foille concedido a Robert Bruce Merrifield polo desenvolvemento da síntese química de proteínas.

 Historia 
A ribonuclease pancreática bovina converteuse nun sistema modelo común no estudo de proteínas principalmente porque era extremadamente estable e podía purificarse en grandes cantidades. Na década de 1940 Armour and Company purificou un quilogramo da proteína, o que era unha gran cantidade, especialmente para os estándares de purificación de proteínas daquel tempo, e ofreceu mostras a baixo custo aos científicos interesados.  A capacidade de ter un só conxunto de encimas purificados fixo desta proteína un sistema modelo predominante para estudos de proteínas. Adoitaba denominárselle ribonuclease A ou RNase A como o membro máis prominente da súa familia de proteínas, coñecida tamén como ribonuclease pancreática ou ribonuclease I.

Os estudos de Christian Anfinsen do proceso do pregamento oxidativo da ribonuclease pancreática bovina estableceron os fundamentos básicos para comprender a relación entre a secuencia de aminoácidos e a estrutura tridimensional pregada dunha proteína e consolidou a hipótese termodinámica do pregamento das proteínas, segundo a cal a forma pregada dunha proteína representa o seu mínimo de enerxía libre.

A RNase A foi o primeiro encima para o cal se propuo un mecanismo catalítico correcto, mesmo antes de que se decubrise a súa estrutura. A RNase A foi a primeira proteína que mostraba os efectos de isomerizacións non nativas de enlaces peptídicos que preceden a residuos de prolina no pregamento de proteínas.

A ribonuclease pancreática bovina foi tamén a proteína modelo usada para poñer a punto moitos métodos espectroscópicos para ensaiar a estutura das proteínas, como a absorbance, dicroísmo circular, as espectroscopias de Raman, resonancia paramagnética de electróns e  resonancia magnética nuclear. Foi a primeira proteína modelo para o desenvolvemento de métodos químicos para o estudo de proteínas, tales como a modificación química de cadeas laterais expostas, recoñecemento antixénico e proteólise limitada de segmentos desordenados. A ribonuclease S, a cal é unha RNase A que foi tratada coa protease subtilisina, foi a terceira proteína da que se obtivo a estrutura cristalográfica en 1967.

 Estrutura e propiedades 
miniatura|esqauerda|300px|Diagrama de fitas etiquetado da ribonuclease A pancreática bovina (). O esqueleto molecular de fitas da proteína está coloreado do azul (N-terminal) ao vermello (C-terminal). As cadeas laterais das catro cisteínas enlazadas por pontes disulfuro móstranse en amarelo, cos átomos de xofre representados como pequenas esferas. Os residuos importantes para a catálise móstranse en maxenta.

A RNase A é unha proteína relativamente pequena (124 residuos, ~13,7 kDa). Pode caracterizarse como unha proteína de dúas capas α + β cunha profunda fenda para a unión co substrato ARN.  A primeira capa está composta por tres hélices alfa (residuos 3-13, 24-34 e 50-60) da metade N-terminal da proteína. A segunda capa consiste en tres forquitas β (residuos 61-74, 79-104 e 105-124 desde a metade C-terminal) dispostas en dúas láminas β. As forquitas 61-74 e 105-124 forman unha folla β antipralela de catro febras, que se sitúa sobre a hélice 3 (residuos 50-60). A forquita β 79-104 máis longa asóciase cunha fibra β curta (residuos 42-45) para formar unha folla β antiparalela de tres febras que descansa sobre a hélice 2 (residuos 24-34).

A RNase A ten catro enlaces disulfuro no seu estado nativo: Cys26-Cys84, Cys58-110, Cys40-95 e Cys65-72.  Os primeiros dous (26-84 e 58-110) son esenciais para o pregamento convencional; cada un deles une unha hélice alfa da primeira capa a unha folla β da segunda capa, formando un pequeno núcleo hidrófobo na súa veciñanza. Os últimos dous enlaces disulfuro (40-95 e 65-72) son menos esenciais para o pregamento; ambos poden ser reducidos (pero non ambos á vez) sen afectaren a estrutura nativa en condicións fisiolóxicas. Estes enlaces disulfuro conectan segmentos bucle e están relativamente expostos ao solvente. O enlace disulfuro 65-72 ten unha propensión moi grande a formarse, significativamente máis do que sería de esperar pola súa entropía de bucle, tanto como péptido coma na proteína na súa lonxitude completa. Isto suxire que a forquita β 61-74 ten unha alta propensión a pregarse conformacionalmente.

A RNase A é unha proteína básica (pI = 9,63); as súas moitas cargas positivas son consistentes coa súa unión ao ARN, o cal é un polianión. Máis xeralmente, a RNase A adoita ser máis polar do habitual ou, mellor dito, cunha infrecuente carencia de grupos hidrófobos, especialmente dos alifáticos. Isto pode explicar a súa necesidade de ter catro enlaces disulfuro que estabilicen a súa estrutura.
O baixo contido hidrófobo pode tamén servir para reducir a repulsión física entre os grupos altamente cargados (os seus propios e os dos seu substrato ARN) e rexións da baixa constante dieléctrica (os residuos non polares).

A hélice α N-terminal da RNase A (residuos 3-13) está conectda ao resto da RNase A por un segmento enlazador flexible (residuos 16-23). Como demostrou F. M. Richards, este enlazador porde ser cortado pola subtilisina entre os residuos 20 e 21 sen causar que a hélice N-terminal se disocie do resto da RNase A. O complexo péptido-proteína chámase "RNase S", o péptido (residuos 1-20) chámase "péptido S" e o restante (residuos 21-124) chámase "proteína S". A constante de disociación do péptido S da proteína S é de aproximadamente 30 pM; esta forte unión pode ser aproveitada para a purificación de proteínas ao unir o péptido S a proteínas de interese e pasar unha mestura por unha columna de afinidade coa proteína S unida. [Un péptido C máis pequeno (residuos 1-13) tamén funciona.]  O sistema modelo da RNase S tamén foi usado para estudar o pregamento de proteínas ao acoplar o pregamento coa asociación. O péptido S foi o primeiro péptido procedente da proteína nativa que mostrou ter unha estrutura secundaria (intermitente) en illamento (por Klee e Brown en 1967).

A RNase A corta especificamente despois de nucleótidos de pirimidina. Esta clivaxe ten lugar en dous pasos: primeiro, o enlace 3’,5’-fosfodiéster é cortado para xerar un intermediario 2’,3’-fosfodiéster cíclico; segundo, o fosfodiéster cíclico é hidrolizado a un 3’-monofosfato. Pode ser inhibido pola proteína inhibidor da ribonuclease, por ións metálicos pesados, e por complexos uridina-vanadato.

 Mecanismo encimático 
As cargas positivas da RNase A están principalmente nunha fenda profunda entre dous lobos. O substrato ARN sitúase nesta fenda e é clivado por dous residuos catalíticos de histidina, His12 e His119, para formar un intermediarios 2',3'-fosfato cíclco que é estabilizado pola Lys41 próxima.

 Regulación do encima 
Esta proteína pode usar o modelo da morfeína de regulación alostérica.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Ribonuclease

 Bibliografía 



 Ligazóns externas 


Categoría:Ribonucleases
Categoría:Hidrolases