Transferencia de enerxía de resonancia de Förster

A transferencia de enerxía de resonancia de Förster ou FRET (do inglés Förster resonance energy transfer), tamén chamada transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia, transferencia de enerxía de resonancia ou RET (do inglés resonance energy transfer) ou transferencia de enerxía electrónica ou EET (do inglés electronic energy transfer) é un mecanismo que describe a transferencia de enerxía producida entre dúas moléculas sensibles á luz (cromóforos). Un cromóforo doante, inicialmente no seu estado electrónico excitado, pode transferir enerxía a un cromóforo aceptor por medio de acoplamento dipolo-dipolo non radiativo. A eficiencia desta transferencia de enerxía é inversamente proporcional á sexta potencia da distancia entre o doante e o aceptor, o que fai que a FRET sexa extremadamente sensible a pequenos cambios na distancia.

As medidas de eficiencia da FRET poden utilizarse para determinar se dous fluoróforos están a unha certa distancia un do outro. Tales medidas utilízanse como unha ferramenta de investigación en campos como a bioloxía e a química.

A FRET é análoga á comunicación de campo próximo en que o raio de interacción é moito menor que a lonxitude de onda da luz emitida. Na rexión do campo próximo, o cromóforo excitado emite un fotón virtual que é absorbido instantaneamente por un cromóforo receptor. Estes fotóns virtuais son indetectables, xa que a súa existencia viola a conservación da enerxía e do momento, e, por tanto, a FRET considérase un mecanismo sen radiación. Os cálculos de electrodinámicos cuánticos foron utilizados para determinar que a transferencia de enerxía sen radiación (FRET) e a radiativa son as asíntotas de curto e longo rango dun único mecanismo unificado.

 Terminoloxía 
miniatura|300px|Diagrama do concepto de transferencia de enerxía de resonancia de Förster (FRET).
A transferencia de enerxía de resonancia de Förster recibe ese nome polo científico alemán Theodor Förster. Cando ambos os cromóforos son fluorescentes, o termo que se adoita usar é "transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia", aínda que a enerxía non se transfire realmente por fluorescencia.FRET microscopy tutorial from Olympus  Para evitar interpretacións erróneas do fenómeno, que é sempre unha transferencia non radiativa de enerxía (incluso cando ocorre entre dous cromóforos fluorescentes), é preferible usar o nome "transferencia de enerxía de resonancia de Förster" mellor que "transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia"; porén, esta última denominación ten un uso común na literatura científica. A FRET non está restrinxida á fluorescencia e ocorre tamén en conexión coa fosforescencia.

 Base teórica 

A eficiencia da FRET () é o rendemento cuántico da transcición de transferencia de enerxía, é dicir, a probabilidade de que ocorra un evento de transferencia de enerxía por evento de excitación do doante:



onde  a taxa de decaimento radiativo do doante,  é a taxa de transferencia de enerxía, e  as taxas de calquera outra vía de desexcitación excluíndo as transferencias de enerxía a outros aceptores.

A eficiencia da FRET depende de moitos parámetros físicos, que se poden agrupar así: 1) a distancia entre o doante e o aceptor (tipicamente no rango de 1–10 nm), 2) o solapamento espectral do espectro de emisión do doante e o espectro de absorción do aceptor, e 3) a orientación relativa do momento dipolar da emisión do doante e do momento dipolar de absorción do aceptor.

 depende da distancia de separación entre doante e aceptor  cunha lei inversa á 6ª potencia debida ao mecanismo de acoplamento dipolo-dipolo:

sendo  a distancia de Förster deste par de doante e aceptor, é dicir, a distancia á cal a eficiencia da transferencia de enerxía é do 50 %.
A distancia de Förster depende da integral de solapamento do espectro de emisión do doante co espectro de absorción do aceptor e as súas mutuas orientacións moleculares como se expresan na seguinte ecuación, toda en unidades do SI:David L. Andrews Resonance Energy Transfer: Theoretical Foundations and Developing Applications



onde  é o rendemento cuántico da fluorescencia do doante en ausencia do aceptor,  é o factor de orientación do dipolo,  é o índice de refracción do medio,  é a constante de Avogadro, e  é a integral do solapamento espectral calculada como

onde  é o espectro de emisión do doante,  é o espectro de emisión do doante normalizado a unha área de 1, e  é o coeficiente de extinción molar do aceptor, obtido normalmente a partir dun espectro de absorción.
O factor de orientación  vén dado por

onde  denota o momento dipolar de transición normalizado do fluoróforo respectivo, e  denota o desprazamento interfluoróforo normalizado.
 = 2/3 é o que se adoita usar. Este valor obtense cando ambas as tinguiduras son libres de rotar e poden considerarse orientadas isotropicamente durante o tempo de vida do estado excitado. Se a tinguidura é fixa ou non é libre de rotar, entón  = 2/3 non se pode tomar como valor válido. Porén, na maioría dos casos, incluso unha lixeira reorientación das tinguiduras ten como resultado unha suficiente media orientacional para que  = 2/3 non supoña un grande erro na estimación da distancia de transferencia de enerxía debido á dependencia da sexta potencia do  sobre . Incluso cando  é bastante diferente de 2/3, o erro pode ser asociado cun cambio en , e así as determinacións dos cambios na distancia relativa para un sistema particular son aínda válidos. As proteínas fluorescentes non se reorientan nunha escala de tempo que sexa máis rápida que o seu tempo de vida de fluorescencia. Neste caso 0 ≤  ≤ 4.

As unidades dos datos non están xeralmente nas unidades do SI. Usar as unidades orixinais para calcular a distancia de Förster é moitas veces máis conveniente. Por exemplo, a lonxitude de onda adoita estar en nanómetros e o coeficiente de excitación en , onde  é a concentración en . O valor de  obtido a partir destas unidades virá dado en . Para usar como unidade o ángstrom (Å) () para , a ecuación é axustada a 
     (Å)

Para análises de FRET dependentes do tempo, pode usarse no seu lugar directamente a taxa de transferencia de enerxía ():



onde  é o tempo de vida media da fluorescencia do doante en ausencia do aceptor.

A eficiencia da FRET relaciónase co rendemento cuántico e o tempo de vida da fluorescencia da molécula doante como segue:

onde  e  son os tempos de vida da fluorescencia do doante en presenza e ausencia dun aceptor, respectivamente, ou como

onde  e  son as intensidades de fluorescencia do doante con e sen aceptor, respectivamente.

 Confirmación experimental da teoría da FRET 

A dependencia da distancia á inversa da sexta potencia da transferencia de enerxía de resonancia de Förster foi confirmada experimentalmente por Wilchek, Edelhoch e Brand usando péptidos triptofil. Stryer, Haugland e YguerabideStryer L, Haugland RP. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. agosto de 1967;58(2):719-26. doi: 10.1073/pnas.58.2.719.  ; PMCID: PMC335693.Yguerabide J. (1994). Theory for establishing proximity relations in biological membranes by excitation energy transfer measurements. Biophysical journal, 66(3 Pt 1), 683–693. https://doi.org/10.1016/s0006-3495(94)80842-2  tamén demostraron experimentalmente a dependencia teórica da transferencia de enerxía de resonancia de Förster na integral solapada. Os cálculos das distancias da FRET dalgúns exemplos de pares de tinguiduras poden atoparse aquí.
Con todo, observáronse moitas contradicións de experimentos especiais coa teoría en ambientes complicados cando as orientacións e rendementos cuánticos das moléculas son difíciles de estimar.

 Métodos de medida da eficiencia da FRET 
En microscopia de fluorescencia, a microscopia de varrido láser confocal de fluorescencia, así como en bioloxía molecular, a FRET é unha útil ferramenta para cuantificar as dinámicas moleculares en biofísica e bioquímica, como as interaccións proteína-proteína, interaccións proteína-ADN e os cambios conformacionais nas proteínas. Para monitorizar a formación complexa entre dúas moléculas, unha delas é etiquetada cun doante e a outra cun aceptor. A eficiencia da FRET é medida e usada para identificar as interacción entre os complexos etiquetados. Hai varios xeitos de medir a eficiencia da FRET monitorizando os cambios na fluorescencia emitida polo doante e o aceptor.

 Emisión sensibilizada 
Un método de medir a eficiencia da FRET é medir a variación na intensidade de emisión do aceptor. Cando o doante e o aceptor están próximos (a 1–10 nm) debido á interacción das dúas moléculas, increméntase a emisión do aceptor debido á FRET intermolecular desde o doante ao aceptor. Para monitorizar os cambios conformacionais de proteínas, etiquétase a proteína diana cun doante e un aceptor en dous loci. Cando un torcemento ou dobramento da proteína causa un cambio na distancia ou orientación relativa do doante e o aceptor, obsérvase un cambio na FRET. Se unha interacción molecular ou un cambio conformacional da proteína é dependente da unión do ligando, esta técnica de FRET é aplicable aos indicadores fluorescentes para a detección do ligando.

 FRET de fotobranqueamento 
As eficiencias da FRET poden tamén inferirse a partir das taxas de fotobranqueamento do doante en presenza e ausencia dun aceptor. Ese método pode realizarse coa maioría dos microsocopios de fluorescencia; un destes microscopios simplemente fai brillar a luz de excitación (dunha frecuencia que excita o doante pero non o aceptor significativamente) sobre espécimes con e sen o fluoróforo aceptor e monitoriza a fluorescencia co paso do tempo do doante (tipicamente separada da fluorescencia do aceptor usando un filtro pasa-banda). A escala de tempo é a do fotobranqueamento, que é de segundos ou minutos, e a fluorescencia en cada curva vén dada por

onde  é a constante de tempo de decadencia do fotobranqueamento e depende de se o aceptor está presente ou non. Como o fotobranquemento consiste na inactivación permanente de fluoróforos excitados, a transferencia de enerxía de resonancia desde un doante excitado a un fluoróforo aceptor impide o fotobranqueamento dese fluoróforo doante, e así unha eficiencia de FRET alta orixina unha constante de tempo de decaimento de fotobranqueamento máis longa:

onde  e  son as constantes de tempo de decaimento do fotobranqueamento do doante en presenza e en ausencia do aceptor, respectivamente. (Nótese que a fracción é a recíproca da usada para as medidas do tempo de vida).

Esta técnica foi introducida por Jovin en 1989. O seu uso dunha curva de puntos completa para extraer as constantes de tempo pode ter a vantaxe dunha maior exactitude que os outros métodos. Ademais, o feito de que os tempos de medida sexan da orde de segundos en vez de nanosegundos fai máis fácil as medidas de tempo de vida de fluorescencia, e como as taxas de decaimento do fotobranqueamento non dependen xeralmente da concentración de doantes (a non ser que a saturación de aceptor sexa un problema), non é necesario o coidadoso control das concentracións necesarias para as medidas de intensidade. Porén, é importante manter a mesma iluminación para as medidas con e sen aceptor, xa que o fotobranqueamento se incrementa marcadamente con luz incidente máis intensa.

 Medidas de tempo de vida 

A eficiencia da FRET pode tamén ser determinada a partir do cambio no tempo de vida da fluorescencia do doante. O tempo de vida do doante diminuirá na presenza do aceptor. As medidas do tempo de vida da FRET-doante utilízanse na microscopia de imaxes de tempo de vida de fluorescencia (FLIM, do inglés fluorescence-lifetime imaging microscopy).

 FRET de molécula única (smFRET) 
A smFRET (single-molecule FRET) é un grupo de métodos que usa varias técnicas de microscopia para medir un par de fluoróforos doante e aceptor que son excitados e detectados ao nivel dunha soa molécula. En contraste coa "FRET conxunto" ou a "FRET en masa" que proporcionan o sinal de FRET dun alto número de moléculas, a FRET de molécula única pode resolver o sinal de FRET de cada molécula individual. As variacións do sinal da smFRET son útiles para revelar información cinética que un conxunto de medidas non pode proporcionar, especialmente cando o sistema está en equilibrio. Pode observarse tamén a heteroxeneidade entre diferentes moléculas. Este método foi aplicado en moitas medidas de dinámica biomolecular como o pregmento/despregamento do ADN/ARN/proteínas e outros cambios conformacionais, e a dinámica intermolecular como a reacción, unión, adsorción e desorción, que son especialmente útiles en detección química, bioensaios e biodetección.

 Fluoróforos usados na FRET 

miniatura|250px|Se o enlazador (linker) está intacto, a excitación á lonxitude de onda da absorbancia da CFP (414 nm) causa a emisión pola YFP (525 nm) debido á FRET. Se unha protease corta o enlazador, a FRET é abolida e a emisión é á lonxitude de onda da CFP (475 nm).

 Pares CFP-YFP 
Un  par de fluoróforos común para usos biolóxicos é o formado pola proteína fluorescente ciano (CFP) e a proteína fluorescente amarela (YFP). Ambas son variantes de cor da proteína fluorescente verde (GFP). Para a etiquetaxe con tinguiduras fluorescentes cómpre a purificación, modificación química e inxección intracelular dunha proteína hóspede. O máis conveniente pode ser que as variantes da GFP se unan a unha proteína hóspede por enxeñaría xenética. Ademais, a fusión da CFP e a YFP ("dímero tándem") que quedan ligadas por unha secuencia de aminoácidos de corte recoñecida por unha protease, poden usarse nun ensaio de clivaxe proteolítico.

 BRET 
Unha limitación da FRET realizada con doantes fluoróforos é a necesidade dunha iluminación externa para iniciar a transferencia de fluorescencia, a cal pode orixinar un ruído de fondo nos resultados debido á excitación directa do aceptor ou ao fotobranqueamento. Para evitar este inconveniente, desenvolveuse a transferencia de enerxía de resonancia de bioluminescencia ou BRET polas súas siglas en inglés. Esta técnica usa unha luciferase bioluminescente (normalmente a luciferase de Renilla reniformis) en lugar da CFP para producir a emisión fotónica inicial compatible con YFP.

A BRET foi tamén aplicada usando outros encimas luciferase diferentes, obtidos por enxeñaría a partir do camarón de augas profundas Oplophorus gracilirostris. Esta luciferase é máis pequena (19 kD) e máis 
brillante que a luciferase de uso máis común de Renilla reniformis, e denominouse NanoLuc ou NanoKAZ. Promega desenvolveu un substrato patentado para NanoLuc chamado furimazine, aínda que se publicaron tamén outros valiosos substratos de coelenterazina para NanoLuc. Unha versión de proteína dividida de NanoLuc desenvolvida por Promega utilizouse tamén como doante da BRET en experimentos que miden as interaccións proteína-proteína.

 Homo-FRET 

En xeral, o termo "FRET" refírese a situacións nas que as proteínas (ou "fluoróforos") doantes e receptoras son de tipos diferentes. Porén, en moitas situacións biolóxicas pode haber a necesidade de examinar as interaccións entre dúas ou máis proteínas do mesmo tipo, ou incluso de moléculas da mesma proteína, por exemplo se a proteína sofre pregamento ou forma parte dunha cadea de proteínas polimérica, ou por outras cuestións de cuantificación en células biolóxicas ou experimentos in vitro. 

Obviamente, as diferenzas espectrais non serán nestes casos a ferramenta usada para detectar e medir a FRET, xa que tanto a proteína aceptora coma a doante emiten luz da mesma lonxitude de onda. Aínda así poden detectarse as diferenzas na polarización entre a luz que excita os fluoróforos e a luz que é emitida, nunha técnica chamada imaxes de anisotropía de FRET; o nivel de anisotropía cuantificado (diferenza na polarización entre os feixes de excitación e emisión) convértese entón nunha guía indicativa de cantos eventos de FRET ocorreron.

No campo da nanofotónica, a FRET pode ser prexudicial se canaliza enerxía excitónica aos sitios defectuosos, mais é tamén esencial para cargar captación en células solares sensibilizadas de punto cuántico e orgánicas, e propuxéronse varias estratexias que permiten a FRET para diferentes aparellos optoelectrónicos. É entón esencial para comprender como se comportan os nanoemisores illados cando están empillados nunha capa densa. As nanoplaquiñas son candidatos especialmente prometedores para unha difusión excitón de homo-FRET forte debido ao seu forte acoplamento de dipolo en plano e baixo desprazamento de  Stokes. O estudo con microscopia de fluorescencia de ditas cadeas individuais demostrou que a transferencia de enerxía por FRET entre plaquiñas veciñas causa que a enerxía difunda a unha lonxitude típica de 500 nm (aproximadamente 80 nanoemisores), e o tempo de transferencia entre plaquiñas é da orde de 1 ps.

 Outros 
Utilízanse varios compostos máis ademais das proteínas fluorescentes.

 Aplicacións 

As aplicacións da transferencia de enerxái de resonancia (FRET) ampliáronse tremendamente nos últimos 25 anos, e a técnica converteuse en básica en moitos campos biolóxicos e biofísicos. A FRET pode usarse como unha regra espectroscópica para medir distancias e detectar interaccións moleculares en varios sistemas e ten aplicacións en bioloxía e bioquímica.

 Proteínas 
A FRET úsase a miúdo par detectar e rastrear interaccións entre proteínas. Adicionalmente, a FRET pode usarse para medir distancias entre dominios dunha mesma proteína etiquetando diferentes rexións da proteína con fluoróforos e medindo a emisión para determinar a distancia. Isto proporciona información sobre a conformación da proteína, incluíndo as estruturas secundarias e o pregamento das proteínas. Isto amplíase ao rastreo de cambios funcionais na estrutura da proteína, como os cambios conformacionais asociados coa actividade da miosina. Aplicada in vivo, a FRET foi usada para detectar a localización e interaccións de estruturas celulares como as integrinas e as proteínas de membrana.

 Membranas 

A FRET pode usarse para obsevar a fluidez da membrana, o movemento e dispersión de proteínas de membrana, interaccións entre proteínas e lípidos de membrana e entre proteína e proteína, e a mestura de diferentes membranas. A FRET tamén se usou para estudar a formación e propiedades de dominios de membrana e balsas lipídicas en membranas celulares e para determinar a densidade de superficie en membranas.

 Quimiosensor 
miniatura|Sonda baseada en FRET que se activa pola interacción con Cd2+.

As sondas baseadas en FRET poden detectar a presenza de varias moléculas: a estrutura da sonda é afectada pola unión ou actividade de pequenas moléculas, que pode acender ou apagar o sistema FRET. Isto utilízase a miúdo para detectar anións, catións, moléculas pequenas non cargadas e tamén algunhas biomacromoléculas máis grandes. De xeito similar, os sistemas FRET foron deseñados para detectar cambios no ambiente celular debido a factores tales como o pH, hipoxia ou potencial de membrana mitocondrial.

 Vías de sinalización 
Outro uso da FRET é no estudo de vías de sinalización ou metabólicas. Por exemplo, a FRET e a BRET utilizáronse en varios experimentos para carcterizar a activación do receptor acoplado á proteína G e os consecuentes mecanismos de sinalización. Outros exemplos son o uso da FRET para analizar procesos tan diversos como a quimiotaxe bacteriana e a actividade da caspase na apoptose.

 Cinética de pregamento de proteínas e nucleótidos 

As dinámicas de pregamento de proteínas, ADNs, ARNs e outros polímeros medíronse utilizando a FRET. Usualmente, estes sistemas están nun equilibrio cuxa cinética está oculta. Porén, poden cuantificarse medindo con FRET de molécula única coas  tinguiduras aceptora e doante na situación apropiada sobre as moléculas. Ver FRET de molécula única para unha descrición máis detallada.

 Outras aplicacións 
Ademais dos usos comúns antes mencionados, a FRET e a BRET son tamén efectivas no estudo da cinética de reaccións bioquímicas. A FRET úsase cada vez máis para monitorizar a ensamblaxe e desensamblaxe dependentes do pH e é valiosa na análise da encapsulación de ácidos nucleicos. Esta técnica pode utilizarse para determinar factores que afectan varios tipos de formación de nanopartículas así como os mecanismos e efectos das nanomedicinas.

 Outros métodos 

Un mecanismo diferente, pero relacionado, é a transferencia de electróns de Dexter.

Un método alternativo para detectar a proximidade entre proteínas é a complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), na cal cada unha de dúas partes dunha proteína fluorescente é fusionada con outras proteínas. Cando estas dúas partes se encontran, forman un fluoróforo nunha escala de tempo de minutos ou horas.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
Transferencia de electróns de Dexter
Acoplamento de Förster
Transferencia de enerxía de superficie
Transferencia de enerxía de fluorescencia resolta no tempo

 Ligazóns externas 

 FRET Imaging (Tutorial do páxina web de Becker & Hickl)

Categoría:Fluorescencia
Categoría:Métodos bioquímicos
Categoría:Biofísica
Categoría:Técnicas de fluorescencia
Categoría:Bioloxía celular
Categoría:Técnicas de laboratorio
Categoría:Técnicas de bioloxía molecular