Fluoróforo

Un fluoróforo ou fluorocromo (termo similar a cromóforo) é un composto químico fluorescente que pode reemitir luz cando é excitado pola luz. Os fluoróforos conteñen caracteristicamente varios grupos aromáticos combinados ou moléculas planas ou cíclicas con varios enlaces π.

Os fluoróforos son ás veces usados sós, como trazadores en fluídos, como tinguiduras para tinguir certas estruturas, como substratos dun encima, ou como sondas ou indicadores (cando a súa fluorescencia é afectada por aspectos ambientais como a polaridade ou ións). Pero o máis xeral é que se usen unidos covalentemente a macromoléculas, funcionando como marcadores (ou tinguiduras ou etiquetas ou reporteiros) para reactivos de afinidade ou bioactivos (anticorpos, péptidos, ácidos nucleicos). Os fluoróforos son usados para tinguir tecidos, células ou materiais nunha variedade de métodos analíticos, como na obtención de imaxes fluorescentes e na espectroscopia de fluorescencia.

A fluoresceína, por medio do seu derivado aminorreactivo de isotiocianato, o isotiocianato de fluoresceína (FITC), foi un dos fluoróforos máis utilizados. Desde a súa aplicación inicial para o etiquetado de anticorpos, as aplicacións ampliáronse aos ácidos nucleicos grazas á utilización da carboxifluoresceína. Outros fluoróforos historicamente comúns son os derivados da rodamina (TRITC), coumarina e cianina. As novas xeracións de fluoróforos, moitos dos cales son de marcas comerciais, adoitan ter unhas prestacións mellores, como ser máis fotoestables, máis billantes ou menos sensibles ao pH que as tingjuiduras tradicionais cunha excitación e emisión comparables.

 Fluorescencia 
O fluoróforo absorbe enerxía da luz dunha lonxitude de onda específica e reemite luz dunha lonxitude de onda máis longa. As lonxitudes de onda absorbidas, a eficiencia da transferencia de enerxía, e o tempo antes da emisión dependen da estrutura do fluoróforo e do seu ambiente químico, xa que a molécula no seu estado excitado interacciona coas moléculas que o rodean. As lonxitudes de onda de absorción máxima (≈ excitación) e emisión (por exemplo, Absorión/Emisión = 485 nm/517 nm) son as propiedades típicas usadas para referirse a un fluoróforo determinado, pero o espectro completo pode ser tamén algo importante a considerar. O espectro de lonxitudes de onda de excitación pode ser unha banda moi estreita ou moi ancha ou pode estar todo máis alá do nivel límite. O espectro de emisión é xeralmente máis  nítido que o espectro de excitación, e é dunha lonxitude de onda mais longa e, en consecuencia, dunha enerxía menor. As enerxías de excitación van desde o ultravioleta ata o espectro visible, e as enerxías de emisión poden continuar desde a luz visible á rexión do infravermello próximo.

As principais características dos fluoróforos son:
 Lonxitudes de onda de máxima excitación e emisión (expresada en nanómetros (nm)): corresponde ao pico nos espectros de excitación e emisión (usualmente un pico para cada un).
 Coeficiente de absorción molar (en mol−1cm−1): liga a cantidade de luz absorbida, a unha lonxitude de onda dada, á concentración de fluoróforo en solución.
 Rendemento cuántico: eficiencia da enerxía transferida desde a luz incidente á fluorescencia emitida (o número de fotóns emitidos por fotóns absorbidos).
 Tempo de vida (en picosegundos): duración do estado excitado dun fluoróforo antes de volver ao seu esatado fundamental. Refírese ao tempo que tarda unha poboación de fluoróforos excitados en decaer a 1/e (≈0,368) da cantidade orixinal.
 Desprazamento de Stokes: a difernza entre as lonxitudes de onda de excitación máxima e emisión máxima.
 Fracción escura: a proporción das moléculas non activas na emisión de fluorescencia. Para puntos cuánticos, a microscopia de molécula única prolongada mostrou que o 20-90 % de todas as partículas nunca emiten fluorescencia. Por outra parte, as nanopartículas poliméricas conxugadas (Pdots) non mostran case ningunha fracción escura na súa fluorescencia. As proteínas fluorescentes poden ter unha fración escura por mal pregamento da proteína ou formación defectuosa do cromóforo.

Destas carcterísticas derivan outras propiedades, como o fotobranqueamento ou a fotorresistencia (perda de fluorescencia despois dunha excitación continua pola luz). Deberían considerarse igualmente outros parámetros, como a polaridade da molécula fluoróforo, o tamaño e forma do fluoróforo (é dicir, para o padrón de fluorescencia de polarización), e outros factores poden cambiar o comportamento dos fluoróforos.

Os fluoróforos poden usarse tamén para atenuar (quench) a fluorescencia doutras tinguiduras fluorescentes ou para transmitir a súa fluorescencia a lonxitudes de onda incluso máis longas.

 Tamaño (peso molecular) 
A maioría dos fluoróforos son pequenas moléculas orgánicas de 20–100 átomos (200–1000 daltons (Da); o peso molecular pode ser maior dependendo das modificacións aplicadas e as moléculas conxugadas), pero hai tamén fluoróforos naturais moito máis grandes que son proteínas: a proteína fluorescente verde (GFP) é de 27 kDa, e varias ficobiliproteínas (PE, APC...) son de 240 kDa. En 2020 o fluoróforo máis pequeno coñecido era o 3-hidroxiisonicotinaldehido, un composto de só 14 átomos e só 123 Da.

As partículas fluorescentes como puntos cuánticos (2–10 nm de diámetro, 100–100.000 átomos) son tamén considerdas fluoróforos.

O tamaño do fluoróforo podería ocultar estericamante a molécula etiquetada e afectar a polaridade de fluorescencia.

 Familias 
miniatura|Fluorescencia de diversas substancias baixo a luz UV. O composto que dá cor verde é a fluoresceína, o vermello é a Rodamina B, o amarelo é a Rodamina 6G, o azul é a quinina, o púrpura é unha mestura de quinina e Rodamina 6g. As solucións son aproximadamente dunha concentración do 0,001 % en auga.

As moléuculas fluoróforos poden ser utilizadas soas ou servir como motivo fluorescente dun sistema funcional. Baseándose na complexidade molecular e métodos sintéticos, as moléculas fluoróforas poderían ser xeralmente clasificadas en catro categorías: proteínas e péptidos, pequenos compostos orgánicos, oligómeros e polímeros sintéticos, e sistemas multicompoñentes.

As proteínas fluorescentes GFP, YFP e RFP (verde, amarela e vermella, respectivamente) poden ser unidas a outras proteínas específicas para formar unha proteína de fusión, sintetizada en células despois da transfección dun plásmido transportador axeitado.

Os fluoróforos orgánicos non proteicos pertencen ás seguintes familias químicas principais:
 Derivados do xanteno: fluoresceína, rodamina, verde Oregón, eosina e vermello Texas
 Derivados da cianina: cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina e merocianina
 Derivados da escuaraína e escuaraínas de anel susbstituído, incluíndo as tinguiduras Seta e Square
 Derivados da escuaraína rotaxano: Ver tinguiduras Tau
 Derivados do naftaleno (derivados do dansilo e prodán)
 Derivados da coumarina
 Derivados do oxadiazol: piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol, e benzoxadiazol
 Derivados do antraceno: antraquinonas, incluídas DRAQ5, DRAQ7 e CyTRAK Orange
 Derivados do pireno: Cascade Blue, etc.
 Derivados da oxazina: vermello Nilo, azul Nilo, violeta de cresilo, oxazina 170, etc.
 Derivados da acridina: proflavina, laranxa de acridina, amarelo de acridina etc.
 Derivados do arilmetino: auramina, cristal violeta, verde malaquita
 Derivados do tetrapirrol: porfina, ftalocianina, bilirrubina
 Derivados do dipirrometeno: BODIPY, aza-BODIPY

Estes fluoróforos fluorescen debido a electróns deslocalizados que poden saltar unha banda e estabilizar a enerxía absorbida. Por exemplo, o benceno, un dos hidrocarburos aromáticos máis simples, é excitado a 254 nm e emite a 300 nm.Omlc.ogi.edu Isto discrimina os fluoróforos dos puntos cuánticos, que son nanopartículas semicondutoras fluorescentes.

Poden ser unidos a proteínas a grupos funcionais específicos, como grupos amino (éster activo, carboxilato, isotiocianato, hidrazina), gruos carboxilo (carbodiimida), tiol (maleimida, bromuro de acetilo) e azida orgánica (por medio de química click ou non especificamente (glutaraldehido)).

Ademais, varios grupos funcionais poden estar presentes para alterar as súas propiedades, como a solubilidade, ou conferir propiedades especiais, como o ácido borónico que se une a azucres ou múltiples grupos carboxilo para enlazar certos catións. Cando a tinguidura contén un doante de electóns e un grupo aceptor de electróns en extremos opostos dun sistema aromático, esta tinguidura probablemente será sensible á polaridade do ambiente (solvatocrómica), polo que se chama sensible ao ambiente. A miúdo as tinguiduras utilízanse dentro das células, que son impermeables a 
moléculas cargadas; como resultado disto, os grupos carboxilo son convertidos nun éster, que é retirado por esterases dentro das células; por exemplo, fura-2AM e fluoresceína-diacetato.

As seguintes familias de tinguiduras son grupos de marcas comerciais e non necesariamente comparten semellanzas estruturais.
 Tinguidura CF (Biotium)
 Sondas DRAQ e CyTRAK (BioStatus)
 BODIPY (Invitrogen)
 EverFluor (Setareh Biotech)
 Alexa Fluor (Invitrogen)
 Bella Fluor (Setareh Biotech)
 DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce)
 Atto e Tracy (Sigma Aldrich)
 FluoProbes (Interchim)
 Tinguiduras Abberior (Abberior)
 Tinguiduras DY e MegaStokes (Dyomics)
 Tinguiduras Sulfo Cy (Cyandye)
 HiLyte Fluor (AnaSpec)
 Tinguiduras Seta, SeTau e Square (SETA BioMedicals)
 Tinguiduras Quasar e Cal Fluor (Biosearch Technologies)
 Tinguiduras SureLight (APC, RPEPerCP, ficobilisomas) (Columbia Biosciences)
 APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
 Tinguiduras Vio (Miltenyi Biotec)

miniatura|Núcleos de células endoteliais de arteria pulmonar bovina tinguidas de azul con DAPI, mitocondrias tinguidas de vermello con MitoTracker Red CMXRos, e F-actina tinguida de verde con Alexa Fluor 488 faloidina nunha imaxe obtida con microscopio de fluorescencia.

 Aplicacións 

Os fluoróforos teñen especial importancia no campo de bioquímica e estudos de proteínas, por exemplo, en inmunofluorescencia, análise de células, inmunohistoquímica, e sensores de pequenas moléculas.

 Usos fóra das ciencias da vida 
miniatura|Tinguidura mariña fluorescente
As tinguiduras fluorescentes, que utilizan o nome de "colores neon", atoparon unha ampla variedade de usos na industria, como:
 Usos de escala multitón en tiguiduras téxtiles e abrillantadores ópticos en deterxentes de lavandaría
 Formulacións cosméticas avanzadas
 Roupa e equipos de seguridade
 Díodos orgánicos emisores de luz (OLEDs)
 Arte e deseños refinados (pósters e pinturas)
 Sinerxistas de insecticidas e drogas experimentais
 Tinguiduras en rotuladores marcadores ou resaltadores de texto para dar un efecto de resplandor
 Paneis solares para captar máis luz / lonxitudes de onda
 Tinguiduras mariñas fluorescentes usadas para axudar aos equipos de busca e rescate aéreo a localizar obxectos na auga

 Exemplos de fluoroforos que se usan frecuentemente 
 Tinguiduras reactivas e conxugadas 
 Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM Notas Hidroxicoumarina 325 386 331 Succinimidil éster Aminocoumarina 350 445 330 Succinimidil éster Metoxicoumarina 360 410 317 Succinimidil éster Cascade Blue (375);401 423 596 Hidrazida Pacific Blue 403 455 406 Maleimida Pacific Orange 403 551   3-Hidroxiisonicotinaldehido 385 525 123 QY 0.15; sensible ao pH Amarelo Lucifer 425 528   NBD 466 539 294 NBD-X R-Ficoeritrina (PE) 480;565 578 240 k  Conxugdos PE-Cy5  480;565;650 670  tamén coñecidos como Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red Conxugados PE-Cy7 480;565;743 767   Red 613 480;565 613  PE-Texas Red PerCP 490 675 35kDa Proteína peridinina clorofila TruRed 490,675 695  Conxugados PerCP-Cy5.5 FluorX 494 520  587 (GE Healthcare) Fluoresceína 495 519 389 FITC; sensible ao pH BODIPY-FL 503 512  G-Dye100498524axeitado para a etiquetaxe de proteínas e electroforeseG-Dye200554575axeitado para a etiquetaxe de proteínas e electroforeseG-Dye300648663axeitado para a etiquetaxe de proteínas e electroforeseG-Dye400736760axeitado para a etiquetae de proteínas e electroforese Cy2 489 506  714 QY 0.12 Cy3 (512);550 570;(615)  767 QY 0.15 Cy3B 558 572;(620)  658 QY 0.67 Cy3.5 581 594;(640)  1102 QY 0.15 Cy5 (625);650 670  792 QY 0.28 Cy5.5 675 694  1272 QY 0.23 Cy7 743 767  818 QY 0.28 TRITC 547 572 444 TRITC X-Rhodamine 570 576 548 XRITC Lissamine Rhodamine B 570 590   Texas Red 589 615 625 Cloruro de sulfonilo Aloficocianina (APC) 650 660 104 k  Conxugados APC-Cy7 650;755 767  Far Red

Abreviaturas:
Ex (nm): Lonxitude de onda de excitación en nanómetros
Em (nm): Lonxitude de onda de emisión en nanómetros
PM: Peso molecular
QY: Rendemento cuántico (Quantum yield)

 Tinguiduras de ácidos nucleicos 

 Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM Notas Hoechst 33342 343 483 616 Selectivo para AT  DAPI 345 455  Selectivo para AT  Hoechst 33258 345 478 624 Selectivo para AT  SYTOX Blue 431 480 ~400 ADN  Cromomicina A3 445 575  Selectivo para CG  Mitramicina 445 575    YOYO-1 491 509  1271   Bromuro de etidio 210;285 605 394 En solución acuosaGelRed290;5205951239Substituo non tóxico do brumuro de etidio  Laranxa de acridina 503 530/640  ADN/ARN  SYTOX Green 504 523 ~600 ADN  TOTO-1, TO-PRO-1 509 533  Tinguidura vital, TOTO: dímero de cianina  TO-PRO: monómero de cianina  Laranxa de tiazol 510 530   CyTRAK Orange 520 615 - (Biostatus) (excitación vermella escura)  Ioduro de Propidium (PI) 536 617 668.4   LDS 751 543;590 712;607  472  DNA (543ex/712em), RNA (590ex/607em)  7-AAD 546 647  7-aminoactinomicina D, selectivo para CG  SYTOX Orange 547 570 ~500 ADN  TOTO-3, TO-PRO-3 642 661    DRAQ5 600/647 697 413 (Biostatus) (excitación usable por debaixo de 488) DRAQ7 599/644 694 ~700 (Biostatus) (excitación usable por debaixo de 488)

 Tinguiduras da función celular 
 Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM NotasIndo-1 361/330 490/405 1010 AM éster, calcio baixo/alto (Ca2+) Fluo-3 506 526 855 AM éster. pH > 6 Fluo-4 491/494 516 1097 AM éster. pH 7.2  DCFH 505 535 529 2'7'Dicorodihidrofluoresceína, forma oxidada  DHR 505 534 346 Dihidrorodamina 123, forma oxidada, a luz cataliza a oxidación  SNARF 548/579 587/635  pH 6/9

 Proteínas fluorescentes 
 Tinguidura Ex (nm) Em (nm) PM  QY BR PS Notas GFP (mutación Y66H) 360 442       GFP (mutación Y66F) 360 508       EBFP 380 440  0,18 0,27  monómero  EBFP2 383 448   20  monómero  Azurita 383 447   15  monómero  GFPuv 385 508       T-Sapphire 399 511  0,60 26 25 dímero débil  Cerulean 433 475  0,62 27 36 dímero débil  mCFP 433 475  0,40 13 64 monómero  mTurquoise2 434 474  0,93 28  monómero  ECFP 434 477  0,15 3    CyPet 435 477  0,51 18 59 dímero débil  GFP (mutación Y66W) 436 485       mKeima-Red 440 620  0,24 3  monómero (MBL)  TagCFP 458 480   29  dímero (Evrogen)  AmCyan1 458 489  0,75 29  tetrámero, (Clontech)  mTFP1 462 492   54  dímero  GFP (S65A mutación) 471 504       Midoriishi Cyan 472 495  0,9 25  dímero (MBL)  Wild Type GFP 396,475 508 26k 0,77     GFP (mutación S65C) 479 507       TurboGFP 482 502 26 k 0,53 37  dímero, (Evrogen)  TagGFP 482 505   34  monómero (Evrogen)  GFP (mutación S65L) 484 510       Esmeralda 487 509  0,68 39 0,69 dímero débil, (Invitrogen)  GFP (mutación S65T) 488 511       EGFP 488 507 26k 0,60 34 174 dímero débil, (Clontech)  Azami Green 492 505  0,74 41  monómero (MBL)  ZsGreen1 493 505 105k 0,91 40  tetrámero, (Clontech)  TagYFP 508 524   47  monómero (Evrogen)  EYFP 514 527 26k 0,61 51 60 dímero débil, (Clontech)  Topacio 514 527   57  monómero  Venus 515 528  0,57 53 15 dímero débil  mCitrine 516 529  0,76 59 49 monómero  YPet 517 530  0,77 80 49 dímero débil  TurboYFP 525 538 26 k 0,53 55,7  dímero, (Evrogen)  ZsYellow1 529 539  0,65 13  tetrámero, (Clontech)  Kusabira Orange 548 559  0,60 31  monómero (MBL)  mOrange 548 562  0,69 49 9 monómero Aloficocianina (APC) 652 657,5 105 kDa 0,68   heterodímero, con enlaces cruzados  mKO 548 559  0,60 31 122 monómero  TurboRFP 553 574 26 k 0,67 62  dímero, (Evrogen)  tdTomato 554 581  0,69 95 98 dímero en tándem  TagRFP 555 584   50  monómero (Evrogen)  DsRed monómero 556 586 ~28k 0,1 3,5 16 monómero, (Clontech)  DsRed2 ("RFP") 563 582 ~110k 0,55 24  (Clontech)  mStrawberry 574 596  0,29 26 15 monómero  TurboFP602 574 602 26 k 0,35 26  dímero, (Evrogen)  AsRed2 576 592 ~110k 0,21 13  tetrámero, (Clontech)  mRFP1 584 607 ~30k 0,25   monómero, (Tsien lab)  J-Red 584 610  0,20 8,8 13 dímero R-ficoeritrina (RPE) 565 >498 573 250 kDa 0,84    heterotrímero B-ficoeritrina (BPE) 545 572 240 kDa 0,98   heterotrímeromCherry 587 610  0,22 16 96 monómero  HcRed1 588 618 ~52k 0,03 0,6  dímero, (Clontech)  Katusha 588 635   23  dímero P3  614 662 ~10.000 kDa   Complexo de ficobilisoma Peridinina clorofila (PerCP) 483 676 35 kDa    trímero  mKate (TagFP635) 588 635   15  monómero (Evrogen)  TurboFP635 588 635 26 k 0,34 22  dímero, (Evrogen)  mPlum 590 649 51,4 k 0,10 4,1 53   mRaspberry 598 625  0,15 13  monómero, fotobranqueamento mais rápido que mPlummScarlet5695940,7071277monómero

Abreviaturas:
Ex (nm): Lonxitude de onda de excitación en nanómetros
Em (nm): Lonxitude de onda de emisións en nanómetros
MW: Peso molecular
QY: Rendemento cuántico (Quantum yield)
BR: Brillantez: Coeficiente de absorción molar * rendemento cuántico / 1000
PS: Fotoestabilidade: tempo [seg] para reducir a brillantez nun 50 %

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Fluorescencia nas ciencias da vida
 Quenching (fluorescencia)
 Recuperción da fluorescencia despois do fotobranqueamento (FRAP) - unha aplicación para cuantificar a mobilidade de moléculas en bicapas lipídicas.

 Ligazóns externas 
 The Database of fluorescent dyes
 Táboa de fluorocromos
 The Molecular Probes Handbook - un recurso completo para a tecnoloxía da fluorescencia e as súas aplicacións.

Categoría:Tinguiduras
Categoría:Luminescencia