Complexo de pre-replicación

Un complexo de pre-replicación (pre-RC) é un complexo proteico que se forma na orixe de replicación durante a etapa de inicio da replicación do ADN. A formación do complexo de pre-replicación é necesaria para que se produza a replicación do ADN e é unha parte moi importante do ciclo celular. Unha replicación completa e fiel do xenoma asegura que cada célula filla levará a mesma información xenética que a célula parental.

 Compoñentes 

A medida que os organismos evolucionan e se fan cada vez máis complexos, tamén o fan os seus complexos de pre-replicación. A continuación resúmense os compoñentes do complexo de pre-replicación en diferentes dominios da vida. 

En bacterias, o principal compoñente do complexo de pre-replicación é a proteína DnaA. O complexo complétase cando a DnaA ocupa todos os seus sitios de unión na orixe de replicación bacteriana (oriC). Os sitios concretos de oriC aos que se une a DnaA determinan se a célula ten un bORC (complexo de recoñecemento da orixe bacteriano) ou un complexo de pre-replicación.

O complexo de pre-replicación arqueano é moi diferente do bacteriano e pode servir como modelo simplificado do complexo eucariota. Está composto por unha soa proteína do complexo de recoñecemento da orixe (ORC), Cdc6/ORC1, e un homohexámero da proteína de mantemento do minicromosoma (MCM). Sulfolobus islandicus tamén usa un homólogo de Cdt1 para recoñecer unha das súas orixes de replicación. 

O complexo de pre-replicación eucariota é o máis complexo e máis regulado de todos. Na maioría dos eucariotas está composto por seis proteínas ORC (ORC1-6), Cdc6, Cdt1, e un heterohexámero de seis proteínas MCM (MCM2-7). O heterohexámero MCM pode dicirse que se orixina por eventos de duplicación do xene MCM e unha posterior evolución diverxente. O complexo de pre-replicación do lévedo Schizosaccharomyces pombe é notablemente diferente do doutros eucariotas; nel Cdc6 é substituído pola proteína Cdc18 homóloga. Sap1 tamén está incluída no complexo de S. pombe porque é necesaria para a unión de Cdc18. O complexo de pre-replicación do anfibio Xenopus laevis tamén ten unha proteína adicional, MCM9, que axuda a cargar o heterohexámero MCM na orixe de replicación. Resolveuse a estrutura da ORC, MCM, así como a do complexo intermediario ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM).

 Recoñecemento da orixe de replicación 
O recoñecemento da orixe de replicación é un primeiro paso crítico na formación do complexo de pre-replicación. En diferentes dominios da vida este proceso realízase de xeito diferente.

En procariotas o recoñecemento da orixe realízase pola DnaA. A DnaA únese estreitamente a unha secuencia consenso de 9 pares de bases en oriC; 5' – TTATCCACA – 3'. Hai cinco desas secuencias de 9 pares de bases (R1-R5) e 4 secuencias non consenso (I1-I4) en oriC ás que se une DnaA con diferentes afinidades. A DnaA únese a R4, R1 e R2 con alta afinidade e a R5, I1, I2, I3 e R3 con menor afinidade. In vivo observouse que a unión de DnaA aos sitios de recoñecemento ocorre na orde: R1, R2, R4, o cal forma o bORC. Despois, DnaA únese aos outros sitios de recoñecemento de 9 pares de bases de menor afinidade, o cal forma o complexo de pre-replicación.

As arqueas teñen 1–3 orixes de replicación. As orixes son xeralmente tramos ricos en AT que varían baseándose na especie arqueana. A única proteína arqueana ORC recoñece os tramos ricos en AT e únese ao ADN de maneira dependente do ATP.

Os eucariotas teñen moitas orixes de replicación; polo menos un por cromosoma. Saccharomyces cerevisiae é o único eucariota coñecido cunha secuencia de inicio definida TTTTTATG/ATTTA/T. Esta secuencia de inicio é recoñecida por ORC1-5. ORC6 non se sabe se se une ao DNA en S. cerevisiae. As secuencias de inicio de S. pombe e eucariotas superiores non están ben definidas. Porén, as secuencias de inicio son xeralmente ricas en AT ou presentan unha topoloxía do ADN dobrada ou curvada. A protéina ORC4 únese á porción rica en AT da orixe de replicación en S. pombe usando motivos de gancho AT. O mecanismo do recoñecemento da orixe en eucariotas superiores non se comprende ben, mais pénsase que as proteínas ORC1-6 dependen para a súa unión dunha topoloxía do ADN pouco común.

 Carga 

miniatura|Esquema da duplicación dos cromosomas no ciclo celular

A ensamblaxe do complexo de pre-replicación soamente ocorre durante a fase M tardía e a principios da fase G1 do ciclo celular cando a actividade da quinase dependente de ciclina (CDK) é baixa. Esta temporalización e outros mecanismos reguladores aseguran que a replicación do ADN se producirá unha vez por ciclo celular. A ensamblaxe do complexo de pre-replicación depende do previo recoñecemento da orixe, feita por DnaA en procariotas ou por ORC en arqueas e eucariotas. 

O complexo de pre-replicación en procariotas está completo cando a DnaA ocupa todos os posibles sitios de unión en oriC. A DnaA só pode unirse a sitios de baixa afinidade en oriC unha vez que se retira a proteína fis de oriC. Retirada fis, a proteína IHF (factor de hóspede integrado) únese ao sitio entre R1 e R2, o cal permite que a DnaA se una aos sitios de baixa afinidade en oriC. Isto completa o complexo de pre-replicación.

O complexo de pre-replicación de arqueas require a unión de ORC na orixe. Despois disto, únense Cdc6 e o complexo MCM homohexamérico de maneira secuencial. 

Os eucariotas teñen o complexo de pre-replicación máis complicado. Despois da unión de ORC1-6 na orixe de replicación, recrútase Cdc6. Despois, Cdc6 recruta o factor autorizador Cdt1 e MCM2-7. A unión de Cdt1 e a hidrólise de ATP por ORC e Cdc6 carga MCM2-7 no ADN. Hai un exceso estequiométrico de proteínas MCM sobre o ORC e as proteínas Cdc6, o que indica que podería haber múltiples heterohexámeros MCM unidos a cada orixe de replicación.

 Inicio da replicación 

Despois de que se forma, o complexo de pre-replicación debe ser activado e o replisoma ensamblado para que se produza a replicación do ADN. 

En procariotas a DnaA hidroliza ATP para desenrolar o ADN en oriC. Esta rexión desnaturalizada é accesible á helicase DnaB e ao cargador helicase DnaC. As proteínas que se unen á febra monocatenaria (SSB) estabilizan a burbulla de replicación acabada de formar e interaccionan coa primase DnaG. DnaG recruta a ADN polimerase III replicativa e empeza a replicación.

En eucariotas o heterohexámero MCM é fosforilado por CDC7 e CDK, o cal despraza Cdc6 e recruta MCM10. MCM10 coopera con MCM2-7 no recrutamento de Cdc45. Cdc45 despois recruta compoñentes clave do replisoma; a ADN polimerase α replicativa e a súa primase. A replicación do ADN pode entón comezar.

 Prevención da reensamblaxe do complexo de pre-replicación 

En cada ciclo celular é importante que o xenoma se replique completamente e só unha vez. Para a replicación do xenoma cómpre a formación do complexo de pre-replicación durante a fase M tardía e inicio da fase G1, pero despois de que se replicou o xenoma o complexo de pre-replicación non se debe formar outra vez ata o seguinte ciclo celular. 

En procariotas varios estudos demostraron que o complexo de pre-replicación só está presente durante unha fracción do ciclo celular. Unha vez que se produce a división, o complexo debe reverterse ao bORC para asegurar que só se produce unha rolda de replicación do ADN durante a división. En Escherichia coli, hai 11 sitios GATC en oriC que sofren hemimetilación durante a replicación do ADN. A proteína SeqA únese a estes sitios impedindo a remetilación e bloqueando a unión do DnaA a sitios de baixa afinidade durante aproximadamente un terzo do ciclo celular. Porén, SeqA non bloquea a unión de DnaA aos sitios R1, R2 e R4. Así, o bORC é restablecido e prepárase para sufrir outra conversión a complexo de pre-replicación.

En S. cerevisiae, as CDKs impiden a formación do complexo de replicación durante o final de G1, fase S e fase G2 ao excluíren MCM2-7 e Cdt1 do núcleo, etiquetando Cdc6 para a degradación polo proteasoma, e disociando ORC1-6 da cromatina por fosforilación. A prevención da re-replicación en S. pombe é lixeiramente diferente; Cdt1 degrádase no proteasoma en vez de ser simplemente excluída do núcleo. A regulación proteolítica de Cdt1 é compartida polos eucariotas superiores, incluíndo Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, X. laevis, e os mamíferos. Os metazoos teñen un cuarto mecanismo para impediren a re-replicación do ADN; durante as fases S e G2 a xeminina únese a Cdt1 e inhibe que Cdt1 cargue MCM2-7 na orixe de replicación.

 Síndrome de Meier-Gorlin 
Defectos en compoñentes do complexo de replicación eucariota sábese que causan a síndrome de Meier-Gorlin, que se caracteriza polo ananismo, rótulas ausentes ou hipoplásticas, orellas pequenas, alteración do crecemento pre- e posnatal e microcefalia. As mutacións coñecidas que a causan están nos xenes ORC1, ORC4, ORC6, CDT1 e CDC6. O fenotipo da enfermidade orixínase probablemente pola reducida capacidade das células de proliferaren, o que xera un número baixo de células e unha insuficiencia xeral do crecemento.

 Notas 

Categoría:Replicación do ADN