Hidroxenase

Unha hidroxenase é un encima que cataliza a oxidación reversible do hidróxeno molecular (H2), tal como se mostra aquí:

A captación de hidróxeno (ecuación 1) está acoplada coa redución de aceptores de electróns como o oxíxeno, nitrato, sulfato, dióxido de carbono (CO2), e fumarato. Por outra parte, a redución de protóns (ecuación 2) está acoplada coa oxidación de doantes de electróns como a ferredoxina (FNR), e serve para dispoñer dun exceso de electróns nas células (esencial na fermentación do piruvato). Poden actuar como doantes ou aceptores de electróns fisiolóxicos para as hidroxenases tanto os compostos de baixo peso molecular coma as proteínas, como as FNRs, citocromo c3, e citocromo c6.

 Clasificación estrutural 
Estimouse que un 99% dos organismos utilizan o hidróxeno, H2. A maioría destas especies son microbios e a súa capacidade de usar o H2 como metabolito débese á expresión de metaloencimas chamados hidroxenases. As hidroxenases clasifícanse en tres tipos baseándose no metal contido no seu sitio activo, que son: ferro-ferro-hidroxenases, niquel-ferro-hidroxenases e ferro-hidroxenases. 
miniatura |centro|x160px|Estruturas dos sitios activos dos tres tipos de encimas hidroxenases.

As hidroxenase catalizan, ás veces reversiblemente, a captción de H2. As [FeFe]- e [NiFe]-hidroxenases son verdadeiros catalizadores redox, que impulsan a oxidación do H2 e a redución de protóns (H+) (ecuación 3); as [Fe]-hidroxenases catalizan a rotura heterolítica reversible de H2 mostrada na reacción (ecuación 4).

Aínda que se cría orixinalmente que carecían de metais, as [Fe]-só-hidroxenases conteñen Fe no sitio activo e non grupos de ferro-xofre. As [NiFe]- e [FeFe]-hidroxenases teñen algunhas características comúns nas súas estruturas: cada encima ten un sitio activo e algúns grupos Fe-S que están enterrados na proteína. O sitio activo, que se cre é o lugar onde ten lugar a catálise, é tamén unha agrupación de metais, e cada ferro está coordinado polos ligandos monóxido de carbono (CO) e cianuro (CN−).

 [NiFe]-hidroxenase 
miniatura|esquerda|Estrutura cristalina da [NiFe]-hidroxenase.
As [NiFe]-hidroxenases son proteíns heterodímeras que constan dunha subunidade pequena e outra grande. A subunidade pequena contén tres grupos ferro-xofre, mentres que a subunidade grande contén o sitio activo, un centro de níquel-ferro que está conectado co solvente por un túnel molecular. Nalgunhas [NiFe]-hidroxenases, un dos residuos de cisteína unido a Ni é substituído por selenocisteína. Porén, baseándose na similitude de secuencia, as [NiFe]- e [NiFeSe]-hidroxenases deberían considerarse unha soa superfamilia.
Ata agora, atopáronse hidroxenases periplásmicas, citoplásmicas e citoplásmicas unidas a membrana. As [NiFe]-hidroxenases, cando se illan, catalizan tanto a evolución coma a captación do H2, con citocromos multihemo de baixo potencial como o citocromo c3, que actúan como doantes ou aceptores de electróns, dependendo do estado de oxidación. Con todo, falando en xeral, as [NiFe]-hidroxenases son máis activas na oxidación do H2. Tamén se observou un amplo espectro de afinidades polo H2 nas hidroxenases que oxidan o H2.

Como as [FeFe]-hidroxenases, as [NiFe]-hidroxenases son xeralmente desactivadas polo oxíxeno molecular (O2). A hidroxenase da bacteria Ralstonia eutropha (tamén chamada Cupriavidus necator), e outras especies chamadas bacterias Knallgas, son tolerantes ao oxíxeno. A [NiFe]-hidroxenase soluble de Ralstonia eutropha H16 pode ser producida nun medio de crecemento heterótrofo. Este descubrimento aumentou a esperanza de que as hidroxenases poidan utilizarse na produción fotosintética de hidróxeno molecular a partir da escisión da auga.
Outra [NiFe]-hidroxenase, chamada Huc ou Hyd1 ou hidroxenase de captación de tipo cianobacteriano, atopouse que é insensible ao oxíxeno mentres que ten unha afinidade moi alta polo hidróxeno. O hidróxeno pode penetrar por estreitas canles do interior do encima polas que as molécula de oxíxeno non poden entrar. Isto permite que bacterias como Mycobacterium smegmatis utilicen a pequena cantidade de hidróxeno da atmosfera como fonte de enerxía cando se carece doutras fontes.

 [FeFe]-hidroxenase 
miniatura|Estrutura cristalina da [FeFe]-hidroxenase.
As hidroxenases que conteñen un centro di-ferro cun cofactor ditiolato que fai de ponte denomínanse [FeFe]-hidroxenases. Recoñécense tres familias de [FeFe]-hidroxenases:
 Hidrooxenases monómeras solubles citoplasmáticas, atopadas en anaerobios estritos como Clostridium pasteurianum e Megasphaera elsdenii. Catalizan tanto a evoución do H2 como a captación.
 Hidroxenases heterodímeras periplásmicas de Desulfovibrio spp., que se poden purificar aerobicamente.
 Hidroxenase monómera soluble, atopada en cloroplastos da alga verde Scenedesmus obliquus, que cataliza a evolución do H2. A [Fe2S2] ferredoxina funciona como doante natural de electróns que liga o encima coa cadea de transporte electrónico fotosintética.

A diferenza das [NiFe]-hidroxenases, as [FeFe]-hidroxenases son xeralmente máis activas na produción de hidróxeno molecular. Informouse dunha frecuencia de recambio (turnover) da orde de 10.000 s−1 para as [FeFe]-hidroxenases de Clostridium pasteurianum. Isto xerou unha intensa investigación sobre o uso da [FeFe]-hidroxenase para a produción sostible de H2.

O sitio activo da hidroxenase di-ferro é o H-cluster. O H-cluster consiste nun [4Fe4S] con estrutura con forma cubana, acoplada co cofactor di-ferro de valencia baixa por un tiol derivado de cisteína. O cofactor di-ferro comprende dous átomo de ferro conectados por un ligando ponte aza-ditiolato (-SCH2-NH-CH2S-, adt); os átomos de ferro están coordinados por ligandos carbonilo e cianuro.

As [FeFe]-hidroxenases poden ser separadas en catro grupos filoxenéticos denominados do A ao D. O grupo A consta das [FeFe]-hidroxenases prototípicas e bifurcantes. Na natureza as [FeFe]-hidroxenases prototípicas realizan o recambio do hidróxeno usando a ferredoxina como un compañeiro redox, mentres que os tipos bifurcantes realizan a mesma reacción usando tanto a ferredoxina coma o NAD(H) como doante ou aceptor de electróns (por exemplo, a hidroxenase (NAD+, ferredoxina)). Para conservar a enerxía, as bacterias anaerobias usan a bifurcación de electróns na que as reaccións redox exergónicas e endergónicas están acopladas para sortear as barreira termodinámicas. O grupo A comprende os encimas máis activos cataliticamente e mellor cracterizados, como a [FeFe]-hidroxenase de Chlamydomonas reinhardtii (CrHydA1), Desulfovibrio desulfuricans (DdHydAB ou DdH), e Clostridium pasteurianum e Clostridium acetobutylicum (CpHydA1 e CaHydA1, denominadas CpI e CaI). Non se carcterizou ningún exemplo representativo do grupo B polo momento, pero é filoxeneticamente distinto incluso se comparte motivos de aminoácidos similares arredor do H-cluster como os das [FeFe]-hidroxenases do grupo A. O grupo C foi clasificado como "sensorial" baseándose na presenza dun dominio Per-Arnt-Sim. Un exemplo de [FeFe]-hidroxenase do grupo C é a de Thermotoga maritima (TmHydS), que só mostra unha modesta velocidade catalítica comparada cos encimas do grupo A e unha alta sensibilidade aparente cara ao hidróxeno (H2). Unha subclase esteitamente relacionada do grupo D ten unha localización similar do xene bacteriano e comparte unha estrutura de dominio similar á dunha subclase do grupo Ech, pero carece de dominio PAS.

 [Fe]-só-hidroxenase 
miniatura|esquerda|Estrutura cristalina da [Fe]-hidroxenase.
A 5,10-meteniltetrahidrometanopterina hidroxenase (EC 1.12.98.2) atopada en arqueas metanóxenas non contén nin níquel nin grupos de ferro-xofre, senón un cofactor que contén ferro que foi recentemente cracterizado por difracción de raios X.

A diferenza doutros dous tipos, as [Fe]-só-hidroxenases atópanse só nalgunhas arqueas metanóxenas hidroxenotróficas. Tamén presentan un mecanismo encimático fundamentalmente diferente en canto aos compañeiros redox e en como se entregan os electróns ao sitio activo. Nas [NiFe]- e [FeFe]-hidroxenases, os electróns viaxan por unha serie de agrupamentos metaloorgánicos que abranguen unha gran distancia; as estruturas do sitio activo permanecen sen cambios durante todo o proceso. Porén, nas [Fe]-só-hidroxenases os electróns se entregan directamente ao sitio activo a través dunha curta distancia. O cofactor metenil-H4MPT+ acepta directamente o hidruro do H2 no proceso. A [Fe]-só-hidroxenase tamén se coñece como metilenetetrahidrometanopterina (metileno-H4MPT) deshidroxenase formadora de H2, porque a súa función é a redución reversible do metenil-H4MPT+ a metileno-H4MPT. Prodúcese a hidroxenación dun metenil-H4MPT+ en vez da oxidación/produción de H2, que é o caso nos outros dous tipos de hidoxenases. Se ben o mecanismo exacto da catálise aínda se está a estudar, descubrimentos recentes suxiren que o hidróxeno molecular é primeiro dividido heteroliticamente polo Fe(II), seguido da transferencia do hidruro ao carbocatión do aceptor.

 Mecanismo 

O mecanismo molecular polo cal os protóns e converten en moléculas de hidróxeno dentro das hidroxenases aínda está estudándose. Unha estratexia común emprega a mutaxénese para dilucidar as funcións dos aminoácidos e os ligandos en diferentes etapas da catálise, como o transporte molecular de substratos. Por exemplo, Cornish et al. realizaron estudos de mutaxénese e atoparon que catro aminoácidos localizados ao longo da proposta canle que conecta o sitio activo e  superficie da proteína son fundamentais para a función encimática da [FeFe]-hidroxenase de Clostridium pasteurianum (CpI). Por outra parte, pódense utilizar tamén análises e simulacións computacionais. Nilsson Lill e Siegbahn adoptaron recentemente esta estratexia para investigaren o mecanismo polo cal as [NiFe]-hidroxenases catalizan a escisión do H2. As dúas estratexias son complementarias e poden beneficiarse entre si. De feito, Cao e Hall combinaron ambas para desenvolver o modelo que describe como se oxidan ou se producen as moléculas de hidróxeno no sitio activo das [FeFe]-hidroxenases. Aínda que cómpre facer máis experimentos e obter máis datos para ter unha comprensión completa do mecanismo, estes descubrimentos permitiron aplicar estes coñecementos en, por exemplo, construír catalizadores artificiais que imiten os sitios activos das hidroxenases.

 Función biolóxica 
Asumindo que a atmosfera da Terra era inicialmente rica en hidróxeno, hipotetizouse que as hidroxenases evolucionaron para xerar enerxía do/como H2 molecular. As hidroxenases podían axudar aos microorganismos a proliferar en tales condicións, ou establecerían un ecosistema impulsado enerxeticamente polo H2. As comunidades microbianas impulsadas polo hidróxeno molecular foron, de feito, atopadas en lugares do fondo mariño profundo, onde non se dispón doutras fontes da enerxía útiles para a fotosíntese. Baseándose nestes feitos, o papel primario das hidroxenases crese que sería a xeración de enerxía, e isto pode ser suficiente para manter un ecosistema.

Estudos recentes revelaron outras funcións biolóxicas das hidroxenases. Para empezar, as hidroxenases bidireccionais poden tamén actuar como "válvulas" para controlar o exceso de equivalentes de redución, especialmente en microorganismos fotosintéticos. Dita función fai que as hidroxenases teñan un papel vital no metabolismo anaerobio. Ademais, as hidroxenases poden tamén estar implicadas na conservación de enerxía ligada a membranas por medio da xeración dunha forza protón-motriz transmembrana. Existe a posibilidade de que as hidroxenases sirvan para a biorremediación de compostos clorados. As hidroxenases eficaces na captación de H2 poden contribuír a a que os metais pesados contaminantes sexan recuperados. Estas hidroxenases de captación descubríronse recentemente en bacterias patóxenas e parasitos e crese que están implicadas na súa virulencia.

 Aplicacións 
As hidroxenases descubríronse na década de 1930,Thauer, R. K., "Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson", Microbiology, 1998, 144, 2377-2406. e desde entón espertaron o interese de moitos investigadores, incluíndo a dos químicos inorgánicos que sintetizaron unha variedade de imitadores das hidroxenases. A [NiFe]-hidroxenase soluble de Ralstonia eutropha H16 é un encima que é un prometedor candidato para aplicacións na produción de biocombustible baseado no H2, xa que favorece a oxidación do H2 e é relativamente tolerante ao oxíxeno. Pode producirse en medios de crecemento heterótrofos e purificarse por intercambio aniónico e matrices de cromatografía de exclusión por tamaño. A comprensión do mecanismo catalítico da hidroxenase podería axudar a deseñar fontes de enerxías limpas, como as algas, que producen hidróxeno.

 A produción de hidróxeno biolóxico 

Varios sistemas poden escindir a molécula de auga en O2 e H+ utilizando a luz solar incidente. Igualmente, numerosos catalizadores, sexan químicos ou biolóxicos, poden reducir o H+ producido a H2. Diferentes catalizadores requiren sobretensións desiguais para que teña lugar esta reacción de redución. As hidroxenases son interesantes porque necesitan unha sobretensión relativamente baixa. A súa actividade catalítica é máis efectiva que a do platino, que é o mellor catalizador para a reacción de evolución do H2. Entre os tres tipos de hidroxenases, as [FeFe]-hidroxenases considéranse como as candidatas máis fortes a ser unha parte integral do sistema de produción solar de H2, xa que ofrecen a vantaxe adicional dunha alta frecuencia de recambio (uns 9000 s−1).

A baixa sobretensión e alta actividade catalítica das [FeFe]-hidroxenases están acompañadas dunha alta sensibilidade ao O2. É necesario facelas por enxeñaría tolerantes ao O2 para o seu uso na produción de H2 solar, xa que o O2 é un subproduto da reacción de descomposición da auga. Diversas investigacións de varios grupos de todo o mundo enfocáronse no estudo dos mecanismos implicados na inactivación polo O2 das hidroxenases. Por exemplo, Stripp et al. utilizaron electroquímica de película de proteínas e descubriron que o O2 convértese primeiro nunha especie reactiva no sitio activo das [FeFe]-hidroxenases, e despois causa danos no seu dominio [4Fe-4S]. Cohen et al. investigaron como o oxíxeno pode chegar ao sitio activo, o cal está enterrado na parte interna da proteína, usando simulacións da dinámica molecular; os seus resultados indican que o O2 difunde principalmente a través de dúas pasaxes que se forman polo agrandamento e interconexión entre cavidades durante o movemento dinámico. Estes traballos, combinados con outros informes, indican que a inactivación está gobernada por dous fenómenos: difusión de O2 ao sitio activo, e modificación destrutiva do sitio activo.

Malia todos estes descubrimentos, as investigacións aínda terán que progresar para poder preparar por enxeñaría unhas hidroxenases cunha axeitada tolerancia ao oxíxeno. Aínda que se atoparon [NiFe]-hidroxenases tolerantes ao oxíxeno, son só eficientes na captación de hidróxeno e non na produción. O éxito recente de Bingham et al. en preparar por enxeñaría a [FeFe]-hidroxenase de Clostridium pasteurianum estivo tamén limitado pola retención da actividade (durante a exposición ao oxíxeno) para o consumo de H2.

 Células de biocombustible baseadas en hidroxenases 

Nas células de biocombustible encimáticas típicas utilízanse encimas como electrocatalizadores tanto no cátodo coma no ánodo ou só nun eléctrodo. Nas células de biocombustible baseadas en hidroxenases, estes [[encima]s están presentes no ánodo para a oxidación do H2.

 Principio 

A reacción reversible ou bidireccional catalizada pola hidroxenase permite a captura e almacenamento de enerxíaa renovable como combustible para o seu uso a demanda. Isto pode demostrarse co almacenamento químico de electricidade obtida dunha fonte renovable (por exemplo, solar, eólica, hidrotermal) como H2 durante períodos de baixa demanda de enerxía. Cando se desexa enerxía, o H2 pode ser oxidado para producir electricidade.

 Vantaxes 
Esta é unha solución ao reto do desenvolvemento de tecnoloxías para a captura e almacenamento de enerxía renovable como combustible para uso a demanda. A xeración de electricidade a partir de H2 é comparable coa funcionalidade similar dos catalizadores de platino pero sen envelenamento do catalizador e así é moi eficiente. No caso das células de combustible de H2/O2, nas que o produto final é auga, non hai emisión de gases de invernadoiro.

 Clasificación bioquímica 
EC 1.12.1.2 
hidróxeno deshidroxenase (hidróxeno:NAD+ oxidorredutase)
 H2 + NAD+  H+ + NADH

EC 1.12.1.3 
hidróxeno deshidroxenase (NADP) (hidróxeno:NADPH+ oxidorredutase)
 H2 + NADP+  H+ + NADPH

EC 1.12.2.1 
citocromo-c3 hidroxenase (hidróxeno:ferricitocromo-c3 oxidorredutase)
 2H2 + ferricitocromo c3  4H+ + ferrocitocromo c3

EC 1.12.5.1 
hidróxeno:quinona oxidorredutase
 H2 + menaquinona  menaquinol

EC 1.12.7.2 
ferredoxina hidroxenase (hidróxeno:ferredoxina oxidorredutase)
 H2 + ferredoxina oxidada  2H+ + ferredoxina reducida

EC 1.12.98.1 
coencima F420 hidroxenase (hidróxeno:coencima F420 oxidorredutase)
 H2 + coencima F420  coencima F420 reducida

EC 1.12.99.6 
hidroxenase (aceptor) (hidróxeno:aceptor oxidorredutase)
 H2 + A  AH2

EC 1.12.98.2 
5,10-meteniltetrahidrometanopterina hidroxenase (hidróxeno:5,10-meteniltetrahidrometanopterina oxidorredutase)
 H2 + 5,10-meteniltetrahidrometanopterina  H+ + 5,10-metilenetetrahidrometanopterina

EC 1.12.98.3 
Methanosarcina-fenazina hidroxenase [hidróxeno:2-(2,3-dihidropentapreniloxi)fenazina oxidorredutase]
 H2 + 2-(2,3-dihidropentapreniloxi)fenazina  2-dihidropentapreniloxifenazina

 Notas 

 Véxase tamén 
 Ligazóns externas 
 2B0J  - PDB Structure of the Apoenzyme of the Iron-sulphur cluster-free hydrogenase from Methanothermococcus jannaschii
 1HFE  - PDB structure of [FeFe]-hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans
 1C4A  - PDB structure of [FeFe]-hydrogenase from Clostridium pasteurianum
 1UBR  - PDB structure of [NiFe]-hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris
 1CC1  - PDB structure of [NiFeSe]-hydrogenase from  Desulfomicrobium baculatum
 Animación - Mecanismo da [NiFe]-hidroxenase

Categoría:Proteínas de ferro-xofre
Categoría:Oxidorredutases