Glutamina sintetase

A glutamina sintetase (GS) () é un encima que xoga un papel esencial no metabolismo do nitróxeno catalizando a condensación do glutamato e o amoníaco para formar glutamina:

Glutamato + ATP + NH3 → Glutamina + ADP + fosfato 
esquerda|alt=Reacción da glutamina sintetase. |Reacción catalizada pola glutamina sintetase.

A glutamina sintetase usa o amoníaco producido pola redución de nitratos, degradación de aminoácidos e fotorrespiración. O grupo amida do glutamato é unha fonte de nitróxeno para a síntese de metabolitos da vía da glutamina.

Outras reaccións poden ter lugar tamén por medio da glutamina sintetase. A competición entre o ión amonio e a auga, as súas afinidades de unión e a concentración de ión amonio inflúen na síntese e na hidrólise de glutamina. A glutamina fórmase se un ión amonio ataca o intermediario acil-fosfato, mentres que se volve a formar glutamato se a auga ataca o intermediario. O ión amonio únese máis fortemente que a auga á glutamina sintetase debido ás forzas electrostáticas entre o catión e o peto cargado negativamente. Outra posible reacción é pola unión de NH2OH á glutamina sintetase, en vez de NH4+, o cal rende γ-glutamilhidroxamato.

 Estrutura 

miniatura|esquerda|225px| alt=Dodecámero de glutamina sintetase |Glutamina sintetase de 12 subunidades

A glutamina sintetase (GS) pode estar composta por 8, 10 ou 12 subunidades idénticas separadas en dous aneis enfrontados. As GS bacterianas son dodecámeros con 12 sitios activos entre os monómeros. Cada sitio activo crea un túnel que é o lugar de tres sitios de unión ao substrato distintos: nucleótidos, ión amonio e aminoácidos. O ATP únese á parte superior do bifunil que se abre na superficie externa da GS. O glutamato únese á parte inferior do sitio activo. A parte media do bifunil contén dous sitios nos cales se unen catións divalentes (Mn+2 ou Mg+2). Un sitio de unión a catións está implicado na transferencia do grupo fosforil do ATP ao glutamato, mentres que o segundo estabiliza a GS activa e axuda á unión do glutamato. 

Os enlaces de hidróxeno e as interaccións hidrofóbicas manteñen xuntos os dous aneis da GS. O C-terminal de cada subunidade (pinza helicoidal) estabiliza a estrutura da GS ao inserirse na rexión hidrófoba da subunidade do outro anel. O N-terminal de cada subunidade está exposto ao solvente. Ademais, a canle central está formada por seis follas β de catro febras compostas de bucles antiparalelos das doce subunidades.

 Mecanismo 

A GS cataliza a condensación dependente do ATP do glutamato con amoníaco para dar glutamina. A hidrólise do ATP impulsa o primeiro paso dun mecanismo concertado de dúas partes. O ATP fosforila o glutamato para formar ADP e un intermediario acil-fosfato chamado γ-glutamil fosfato, o cal reacciona co amoníaco, formando glutamina e fosfato inorgánico. O ADP e o Pi non se disocian ata que se se une o amoníaco e se libera a glutamina.

O ATP únese primeiro á parte superior do sitio activo preto do sitio de unión do catión, mentres que o glutamato se une preto do segundo sitio de unión de catións na parte inferior do sitio activo. A presenza de ADP causa un cambio conformacional na GS que estabiliza o residuo de γ-glutamil fosfato. O amonio só se une fortemente á GS se está presente o intermediario acil-fosfato. O amonio, en vez do amoníaco, é o que se une á GS porque o sitio de unión é polar e está exposto ao solvente. No segundo paso, a desprotonación do amonio permite que o amoníaco ataque o intermediario desde o sitio próximo para formar glutamina. O fosfato sae pola parte superior do sitio activo, mentres que a glutamina abandona o sitio activo pola parte inferior (entre os dous aneis).

miniatura|Dúas imaxes da glutamina sintetase  

 Función biolóxica 

A GS está presente predominantemente no cerebro, riles e fígado. No cerebro a GS participa na regulación metabólica do glutamato, a detoxificación do amoníaco cerebral, a asimilación do amoníaco, a reciclaxe de neurotransmisores e na terminación dos sinais neurotransmisores. A GS, no cerebro, atópase principalmente en astrocitos. Os astrocitos protexen as neuronas da excitotoxicidade ao captaren o exceso de amoníaco e glutamato. En ambientes hiperamónicos (con altos niveis de amoníaco), ocorre un inchazo astroglial. O problema deste inchazo astroglial foi enfocado desde diferentes perspectivas. Un estudo mostra que hai cambios morfolóxicos que incrementan a expresión da GS en áreas glutamatérxicas ou outras adaptacións que alivian os altos niveis de glutamato e amoníaco. Outra perspectiva é que o inchazo dos astrocitos débese á acumulación de glutamina. Para previr o aumento dos niveis do contido cortical de glutamato e de auga, realizouse un estudo para impedir a actividade da GS en ratas co uso de metionina sulfoximina (MSO).

 Clases 

Existen tres clases de GS:

 Os encimas da clase I (GSI) son específicos de procariotas e son oligómeros de 12 subunidades idénticas. A actividade dos encimas do tipo GSI está controlada pola adenilación dun residuo de tirosina. O encima adenilado é inactivo.InterPro:IPR001637 Glutamine synthetase class-I, adenylation site 
 Os encimas da clase II (GSII) atópanse en eucariotas e en bacterias que pertencen ás familias Rhizobiaceae, Frankiaceae e Streptomycetaceae (estas bacterias teñen tamén GS de clase I). As GSII son decámeros de subunidades idénticas..

As plantas teñen dous ou máis isocimas de GSII, un dos isocimas traslócase ao cloroplasto. Outra forma é citosólica. A tradución do xene da GS citosólica está regulada pola súa rexión non traducida 5' (5' UTR), mentres que a súa 3' UTR xoga un papel na renovación (turnover) de transcritos.

 Os encimas da clase III (GSIII) polo momento só se atoparon en Bacteroides fragilis e Butyrivibrio fibrisolvens. Son dodecámeros de dobre anel de cadeas idénticas. Son moito máis grandes (uns 700 aminoácidos en total) que os GSI (de 450 a 470 aminoácidos) ou os GSII (350 a 420 aminoácidos).

Aínda que as tres clases de GS están claramente relacionadas estruturalmente, a similitude de secuencias non é moi grande.

 Regulación e inhibición 

A GS está sometida a modificación covalente reversible. A Tyr397 de cada unha das 12 subunidades pode sufrir adenililación ou desadenililación pola adenilil transferase (AT), un encima regulador bifuncional. A adenililación é unha modificación postraducional que implica a unión covalente de AMP a unha cadea lateral dunha proteína. Cada adenililación require un ATP, e a completa inhibición da GS require 12 ATP. A desadenililación polo encima AT supón a remoción fosforolítica de grupos adenilil unidos a Tyr en forma de ADP. A actividade do encima AT está influenciada pola proteína reguladora que está asociada con ela: PII, un trímero de 44 kD. A PII tamén sofre modificación postraducional pola uridilil transferase, así a PII ten dúas formas. O estado de PII determina a actividade da adenilil transferase. Se a PII non está uridililada, entón toma a forma PIIA. O complexo AT:PIIA desactiva a GS por adenililación. Se PII está uridililada, entón toma a forma PIID. O complexo AT:PIID activa a GS por desadenililación. Os complexos AT:PIIA e AT:PIID están regulados alostericamente de modo recíproco polo α-cetoglutarato  e a glutamina (Gln). A glutamina promove a actividade da AT:PIIA e inhibe AT:PIID, o que conduce á adenililación e subseguinte desactivación da GS. Ademais, a glutamina favorece a conversión de PIID a PIIA. Os efectos do α-cetoglutarato sobre os complexos son os opostos. Na maioría das bacterias gramnegativas a GS pode ser modificada por adenililación.

A inhibición da GS está centrada principalmente en ligandos do sitio amino. Outros inhibidores son o resultado do metabolismo da glutamina: triptófano, histidina, carbamoíl fosfato, glicosamina-6-fosfato, citidín trifosfato (CTP) e adenosín monofosfato (AMP). Outros inhibidores/reguladores son a glicina e alanina. A alanina, glicina e serina únense ao sitio do substrato glutamato. O GDP, AMP e ADP únense ao sitio do ATP. A L-serina, L-alanina e glicina únense ao sitio do L-glutamato na GS non adenililada. Os catro aminoácidos únense ao sitio polos átomos que todos teñen en común, “a cadea principal” +NH3-CH-COO-, nas mesmas posicións. O glutamato é outro produto do metabolismo da glutamina; porén, o glutamato é un substrato para a GS, o que o inhibe para actuar como regulador da GS. Cada inhibidor pode reducir a actividade do encima; unha vez que todos os metabolitos finais están unidos á GS, a actividade da GS é case completamente inhibida. Moitos sinais de entrada inhibidores permiten o axuste fino da GS reflectindo os niveis de nitróxeno do organismo.

A regulación por retroalimentación distingue a diferenza entre dous tipos de GS eucariotas: cerebro e tecidos non cerebrais. A GS non cerebral responde a unha inhibición por retroalimentación por produto final, mentres que a GS do cerebro non. Altas concentracións de metabolitos depenedentes da glutamina deberían inhibir a actividade da GS, mentres que as baixas concentracións deberían activar a actividade da GS.

miniatura| alt=MSO. |A metionina sulfoximina (MSO) actuando como un inhibidor no sitio de unión do glutamato.

Inhibidores:
 A metionina sulfoximina (MSO): A MSO é un inhibidor que se une ao sitio do glutamato. Unida á GS, a MSO é fosforilada polo ATP que ten como un resultado unha inhibición irreversible, non covalente da GS. A configuración do isómero S é máis inhibidora. A entrada do glutamato está bloqueada no sitio activo pola estabilización do bucle flexible do sitio activo pola MSO.
 Fosfinotricina(PPT, glufosinato): A fosfinotricina é un inhibidor que se une ao sitio do glutamato. O glufosinato é utilizado como herbicida. As plantas tratadas con glufosinato morren debido a unha acumulación de amoníaco e o cesamento da fotosíntese.
 Hoxe en día disponse de moitos inhibidores sintéticos.
Investigacións en E. coli revelaron que a GS se regula a través da expresión xénica. O xene que codifica a subunidade da GS desígnase glnA. A transcrición de glnA depende de NRI (un amplificador ou enhancer transcricional específico). A transcrición activa ocorre se o NRI está en forma fosforilada, denominada NRI-P. A fosforilación de NRI é catalizada por NRII, unha proteína quinase. Se NRII está en complexo con PIIA entón funciona como unha fosfatase e NRI-P é convertido de novo en NRI. Neste caso, a transcrición de glnA cesa.

A GS está sometida a mecanismos reguladores completamente diferentes en cianobacterias. En vez do sistema común NtrC-NtrB de dous compoñentes, as cianobacterias posúen o regulador transcricional NtcA que está restrinxido a este clado e controla a expresión da GS e unha multitude de xenes implicados no metabolismo do nitróxeno. Ademais, a GS de cianobacterias non é modificada covalentemente para aumentar a sensibilidade á inhibición por retroalimentación. En lugar diso, a GS cianobacteriana é inhibida por pequenas proteínas, denominadas factores inactivantes da GS, cuxa transcrición está regulada negativamente por NtcA. Eses actores inactivadores son ademais regulados por diferentes ARN non codificantes: o ARN pequeno NsiR4 interacciona coa 5' UTR do ARNm do factor inactivador da GS IF7 (ARNm de gifA) e reduce a súa expresión. A expresión de NsiR4 está baixo control positivo do factor de transcrición para o control do nitróxeno NtcA. Ademais, a expresión do factor inactivador do GS IF17 está controlado por un riboswitch para a unión da glutamina.

 Notas 

 Ligazóns externas 
entrada de InterPro
RCSB PDB molécula do mes
 PDBe-KB proporciona un resumo de toda a información estrutural dispoñible en PDB para a glutamina sintetase humana.

2