Paleoxenómica

A paleoxenómica é un campo da ciencia dedicado á reconstrución e análises de información xenómica de especies extintas. A mellora nos métodos de extracción de ADN antigo (ADNa ou aDNA) de mostras gardadas en museos, núcleos de xeo, sitios arqueolóxicos e paleontolóxicos, e as tecnoloxías de secuenciación de seguinte xeración aceleraron os avances neste campo. Agora é posible detectar a deriva xenética, a migración de poboacións antigas e as súas interrelacións, a historia evolutiva de plantas, animais e especies de Homo extintas e a identificación de características fenotípicas en distintas rexións xeográficas. A paleoxenómica pode utilizarse para comparar os antepasados antigos con humanos actuais. A crecente importancia da paleoxenómica é evidente polo feito da concesión do premio Nobel de Medicina e Fisioloxía de 2022 ao xenetista sueco Svante Pääbo [1955-], que traballou en paleoxenómica.

 Introdución 

Inicialmente, a secuenciación de ADNa requiría clonar pequenos fragmentos de ADN en bacterias, o cal se producía con baixa eficiencia debido aos danos oxidativos sufridos polo ADNa ao longo dos milenios. O ADNa é difícil de analizar debido á súa doada degradación por encimas nucleases, pero os ambientes específicos e certas condicións post-mortem melloraron o illamento e a análise. Eran necesarios estritos protocolos de extracción e evitación da contaminación para poder facer análises fiables. Co desenolvemento da reacción en cadea da polimerase (PCR) en 1983, os científicos podían estudar mostras de ADN de ata aproximadamente 100.000 anos de antigüidade, unha limitación debida aos fragmentos relativamente curtos illados. Cos avances en illamento, amplificación, secuenciación e reconstrución de datos, puideron analizarse mostras cada vez máis antigas. Nos últimos 30 anos, a análise do ADN mitocondrial de alto número de copias serviu para responder moitas preguntas; a chegada das técnicas de secuenciación de seguinte xeración permitiu ir máis lonxe. Ademais, esta revolución tecnolóxica permitiu a transición da paleoxenética á paleoxenómica.

 Métodos de secuenciación 

 Dificultades e técnicas 
A PCR, a secuenciación de seguinte xeración e varios métodos de biblioteca de ADN están dispoñibles para a secuenciación do ADNa, ademais de moitas ferramentas bioinformáticas. Cando se utiliza calquera destes métodos é importante considerar que o ADNa pode ser alterado post-mortem. As alteracións específicas orixínanse por:
 Datos de secuencias de padróns mutacionais de bases (mutación C→T).
 Enlaces cruzados.
 Desaminación de citosinas.
 Despurinación.
 Fragmentación do xenoma.

Os padróns específicos e o comezo destas alteracións axudan aos científicos a estimar a idade da mostra.

Anteriormente, os científicos diagnosticaban os danos post-mortem usando reaccións encimáticas ou cromatografía de gas asociadas con espectrometría de masas; en anos máis recentes empezouse a detectalos aproveitando os datos de secuencias mutacionais. Esta estratexia permite identificar o exceso de mutacións C→T despois do tratamento con uracilo ADN glicosilase. Hoxe en día, úsase a secuenciación de alto rendemento (HTS) para identificar a despurinación (un proceso que orixina fragmentación do ADN post-mortem, no que as mostras máis novas presentan máis adenina que guanina), roturas de febra simple na dobre hélice do ADN e sitios abásicos (creados por mutacións C→T).
Un fragmento de ADNa pode secuenciarse en toda a súa lonxitude con HTS. Con estes datos pode crearse unha distribución que represente unha curva de dacaemento de tamaño que permita unha comparación cuantitativa directa da fragmentación en espécimes analizados en diversas condicións. Por medio desta curva é posible obter a lonxitude media dun determinado fragmento de ADNa. Esta lonxitude reflicte o nivel de fragmentación despois da morte, que se incrementa xeralmente coa temperatura deposicional.Orlando L., Gilbert MT., Willerslev E. 2015. Reconstructing ancient genomes and epigenomes. Nat. Rev. Genet. 16(7):395-408.

 Bibliotecas 

Poden realizarse dous tipos de bibliotecas para a secuenciación de ADNa usando a PCR para a amplificación do xenoma:
 Biblioteca de ADNa bicatenario.
 Biblioteca de ADNa monocatenario.

A primeira créase usando a estratexia de extremos romos. Esta técnica usa diferentes adaptadores: estes adaptadores únense aleatoriamente ao fragmento e este pode despois ampliarse. O fragmento que non contén ambos os adaptadores non pode ser ampliado xerando unha fonte de erros. Para reducir este erro introduciuse a ligazón T/A da empresa Illumina: este método consiste en inserir unha cola A na mostra de ADN para facilitar a ligazón da T da cola dos adaptadores. Nestes métodos optimízase a amplificación do ADNa.

Para obter libraría de ADN bicatenario, primeiro desnaturalízase o ADN con calor. O ADN bicatenario obtido lígase despois a dous adaptadores para xerar a febra complementaria e finalmente aplícase a PCR.

 Enriquecemento de ADNa 
Como o ADNa pode conter ADN bacteriano ou doutros microorganismos, o proceso require o seu enriquecemento. Para separar as fraccións endóxenas e exóxenas, empréganse varios métodos: 
 Enriquecemento de molde danado: Usado cando se constrúen bibliotecas de ADN bicatenario porque este método ten como diana o ADN danado. Cando a polimerase Bst enche a mosega, a mostra trátase con uracilo ADN glicosilase e endonuclease VIII. Estes compostos atacan o sitio abásico. O ADN non danado permanece unido ás bólas paramagnéticas cubertas de estreptavidina e pode ser separado da mostra. Este método é específico para mostras de neandertais do Plistoceno tardío.
 Enriquecemento de diana libre de extensión en solución: este método está baseado na hibridación diana-sonda. Este método require a desnaturalización do ADN e despois insire  sondas como tellas solapadas ao longo das rexións diana. Despois, úsase unha PCR para a amplificación do ADN e finalmente o ADN lígase a un adaptador biotinilado. É útil para mostras de antepasados homininos arcaicos.
 Enriquecemento de diana de fase sólida: neste método utilízanse os microarrays e o método da PCR en tempo real en paralelo cun cribado de secuenciación de escopeta (shotgun).
 Enriquecemento de xenoma completo: usado para a secuenciación de xenomas enteiros de determinados indviduos. Utilízase a captura en solución de xenoma completo (WISC, Whole-genome In-Solution Capture). Este método empeza coa preparación dunha biblioteca de sonda de ARN de todo o xenoma dunha especie que está estreitamente relacionada co xenoma diana da mostra de ADN.

 Diversificación das poboacións non africanas actuais e humanos anatomicamente modernos 

Polo momento, moitos estudos en diferentes campos chegaron á conclusión de que as poboacións actuais humanas non africanas son o resultado da diversificación en varias liñaxes dunha metapoboación ancestral ben estruturada, que foi a protagonista da expansión fóra de África, a cal portaba un subconxunto de herdanza xenética africana. Neste contexto, a análise do ADN antigo foi fundamental para comprobar a hipótese xa formulada e proporcionar novas ideas. Primeiro, permitiu estreitar o momento e a estrutura deste fenómeno de diversificación ao proporcionar a calibración da taxa de mutación autosómica e mitocondrial.Skoglund P. and Mathieson I. 2018. Ancient genomics of modern humans: the first decade. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 19:1, 381-404. A análise de mestura xenética demostrou que ocorreron polo menos dous episodios de fluxo xenético independentes entre os devanceiros dos humanos modernos e os humanos arcaicos, como as poboacións neandertais e denisovanas, testemuñando o modelo de "substitución permeable" ("leaky replacement") da historia da poboación humana de Eurasia. Segundo todos estes datos, a diverxencia humana das liñaxes non africanas ocorreu arredor de hai 45.000 – 55.000 anos. Ademais, en moitos casos o ADN antigo permitiu rastrexar os procesos históricos que levaron, co tempo, á estrutura xenética da poboación actual, que sería difícil de establecer contando só coa análise dos xenomas actuais. Entre estas cuestións aínda sen resolver, algunhas das máis estudadas son a identidade dos primeiros habitantes de América, o poboamento de Europa e a orixe da agricultura en Europa.Lan T. and Lindqvist C. 2018. Paleogenomics: Genome-Scale Analysis of Ancient DNA and Population and Evolutionary Genomic Inferences. In: Population Genomics, Springer, Cham. pp 1-38.

 Variación fenotípica en humanos 

A análise do ADN antigo permite estudar as mutacións de trazos fenotípicos consecuencia dos cambios no ambiente e no comportamento humano. A migración a novos hábitats, novos cambios na dieta (despois da transición á agricultura) e a constución de grandes comunidades levou á exposición dos humanos ás novas condicións que finalmente terían como resultado unha adaptación biolóxica.

 Cor da pel 
A migración dos humanos fóra de África a latitudes máis altas supuxo unha menor exposición á luz solar. Como os raios ultravioleta A e B son esenciais para a síntese de vitamina D, a cal regula a absorción de calcio e é fundamental para a saúde ósea, vivir en latitudes altas significaría unha substancial redución na síntese de vitamina D. Isto puxo unha nova presión selectiva sobre o carácter da cor da pel, favorecendo cores da pel máis claras nas latitudes máis altas.
Os dous xenes máis importantes implicados na pigmentación da pel son SLC24A5 e SLC45A2. Hoxe en día, os alelos de “pel clara” destes xenes están fixados en Europa, pero adquiriron unha frecuencia relativamente maior máis recentemente (hai uns 5.000 anos). Este lento proceso de despigmentación suxire que os europeos antigos puideron sufrir os inconvenientes dunha baixa produción de vitamina D, como a aparición de condicións patolóxicas musculoesqueléticas e cardiovasculares. Outra hipótese é que os europeos previos á etapa agrícola puideron conseguir a vitamina D que precisaban da súa dieta, xa que a carne e peixe conteñen certa cantidade de vitamina D.Marciniak S., Perry G. H. Harnessing ancient genomes to study the history of human adaptation. Nature Reviews Genetics volume 18, pages 659–674 (2017)

 Adaptación á dieta agrícola 

Un dos maiores exemplos de adaptación despois do cambio á dieta agrícola e gandeira é a persistencia da produción do encima lactase durante a etapa adulta. Este encima é esencial para dixerir a lactosa, azucre presente no leite e produtos lácteos, e a ausencia deste encima pode causar diarrea despois de consumir estes produtos. A persistencia da lactase está determinada predominantemente por unha mutación dunha soa base no xene MCM6 e os datos de ADN antigo mostran que esta mutación fíxose común só nos últimos 5.000 anos, miles de anos despois do comezo das prácticas de obtención de leite dos animais. Así, incluso no caos da persistencia da lactase hai un enorme atraso temporal entre o comezo dun novo hábito e o espallamento do alelo adaptativo, polo que pode que o consumo de leite estivese daquela restrinxido aos nenos ou a produtos que tiñan pouca lactosa.

Outro exemplo de mutación seleccionada positivamente polo cambio á agricultura é o número de copias do xene AMY1. O AMY1 codifica o encima amilase, que dixire o amidón, o cal está presente na saliva e os humanos modernos teñen un número maior de copias dese xene comparados cos chimpancés.

 O sistema inmunitario 

O sistema inmunitario humano sufriu unha intensa selección no decurso dos milenios, adaptándose a diferentes paisaxes de patóxenos. Varios cambios ambientais e culturais impuxeron unha presión selectiva sobre diferentes xenes asociados á inmunidade. As migracións, por exemplo, expuxeron os humanos a novos hábitats traendo novos patóxenos e vectores (por exemplo, mosquitos). Ademais, o cambio á agricultura e gandería implicou a exposición a diferentes patóxenos e doenzas, tanto debido ao incremento da pobaoción coma ao feito de vivir preto do gando.
Porén, é difícil correlacionar directamente cambios xenómicos concretos a unha resistencia mellorada a determinados patóxenos, dada a vastedade e complexidade do sisteme inmunitario humano.
Ademais de estudar directamente cambios no sistema inmunitario humano, tamén é posible estudar os xenomas antigos dos propios patóxenos, como os causantes da tuberculose, lepra, peste bubónica, varíola ou malaria. Por exemplo, os investigadores descubriron que todas as cepas do axente causante da peste, Yersinia pestis, antes de hai 3.600 anos carecían do xene ymt, o cal é esencial para que sobreviva o patóxeno no intestino das pulgas. Isto suxire que nun pasado remoto a peste puido ser menos virulenta comparada cos gromos máis recentes de Y. pestis.

Un estudo de ADN antigo apoiou ou confirmou que a evolución humana recente para resistir á infección de patóxenos tamén incrementou o risco de enfermidade inflamatoria nos europeos do post-Neolítico nos últimos 10.000 anos, estimando a natureza, forza e tempo de comezo das seleccións debidas a patóxenos.

 Plantas e animais 
Moitos vertebrados non homininos, como antigos mamuts, osos polares, cans e cabalos, foron reconstruídos extraendo e analizando ADNa de fósiles e mostras conservadas a baixa temperatura ou alta altitude. Os estudos sobre mamuts fanse frecuentemente grazas á abundante presenza de tecido brando e pelo no permafrost e son utilizados para identificar as relacións e cambios demográficos con elefantes máis recentes. Os estudos sobre osos polares realizáronse para identificar o impacto dos cambios climáticos na evolución e biodiversidade. Os estudos sobre cans e cabalos serviron para comprender mellor a súa domesticación. En plantas illouse ADNa de sementes, pole e cebada antiga e moderna. Outra aplicación foi a detección da domesticación e proceso de adaptación do millo, que inclúe xenes para a tolerancia á seca e contido de azucre.

 Retos e perspectivas de futuro 

A análise de xenomas antigos de humanos anatomicamente modernos revolucionou completamente, en anos recentes, o noso xeito de estudar as migracións, transformacións e evolución de poboacións. Non obstante, aínda queda moito por saber. O primeiro e máis obvio problema relacionado con este tipo de estratexia, a cal está sendo parcialemnte superada pola continua mellora das técnicas de extracción de ADN antigo, é a dificultade de extraer xenomas antigos ben preservados, un reto que é especialmente maior en África e Asia, onde as temperaturas son maiores que noutras rexións máis frías do mundo. Ademais, África é, de todos os continentes, o que alberga unha maior diversidade xenética. Ademais da degradación do ADN, tamén a contaminación exóxena limita a secuenciación paleoxenómica e proceso de ensamblaxe. Como non posuímos ADN antigo da época e rexión habitada polos devanceiros orixinais da poboación actual non africana, aínda sabemos pouco sobre a súa estrutura e localización. O segundo e máis importante reto que esta disciplina ten que afrontar é a obtención de ADN dos primeiros humanos modernos (hai 100.000 – 200.000 anos). Estes datos, xunto cun maior número de xenomas arcaicos para analizar e co coñecemento do momento e distribución da mestura xenética arcaica, permitirá facer unha reconstrución máis fácil da historia da nosa especie. De feito, obter máis datos ou historias xenéticas permitiranos trazar a evolución humana non só en canto ás migracións e selección natural, pero tamén en canto á cultura. Na seguinte década o eido da investigación paleoxenómica vai centrar a súa atención principalmente en tres tópicos: a definición, a escala de gran detalle, das interaccións humanas pasadas por medio dunha mostraxe máis densa, a compreensión de como estas interaccións contribuíron á transición agrícola por medio da análise de ADN de rexións infraestudadas e, finalmente, a cuantificación da contribución da  selección natural aos fenotipos do día de hoxe. Para interpretar todos estes datos os xenetistas terán que cooperar, como xa fixeron os antropólogos e arqueólogos cos historiadores.

 Bioética 
A bioética en paleoxenómica formula cuestións éticas que se orixinan do estudo de restos humanos antigos, debido ás complexas relacións entre científicos, gobernos e poboacións indíxenas. Ademais, os estudos paleoxenómicos teñen o potential de facer dano á historia da comunidade ou historias ou identidades individuais, así como revelar información sobre os seus descendentes. Por estas razóns, este tipo de estudos son aínda un asunto delicado.
Os estudos paleoxenómicos poden ter consecuencias negativas principalmente a causa das discrepancias entre a articulación de principios éticos e as prácticas. De feito, os restos dos antepasados son xeralmente considerados legalmente e cientificamente como “artefactos”, en vez de como “suxeitos humanos”, o cal xustifica comportamentos cuestionables e a falta de implicación polas comunidades. Os tests sobre restos dos antepasados son, por tanto, usados en disputas, reclamacións en acordos, repatriacións ou outros casos legais.
O coñecemento da importancia e susceptibilidade deste suxeito está dirixíndonos cara a un compromiso ético e directrices aplicables a diferentes contextos, para conservar a dignidade dos restos dos antepasados e evitar problemas éticos.Advancing the ethics of paleogenomics: Ancestral remains should not be regarded as "artifacts" but as human relatives who eserve respect - Jessica Bardill, Alyssa C. Bader, Nanibaa' A. Garrison, Deborah A. Bolnick, Jennifer A. Raff, Alexa Walker, Ripan S. Malhi, and the Summer Internship for INdigenous peoples in Genomics (SING) Consortium Finalmente, outra área pioneira de interese é o denomindado “proxecto des-extinción”, que pretende a resurrección de especies extintas, como o mamut. Este proxecto, que parece será posible grazas á tecnoloxía CRISPR/Cas9, está, porén, fortemente conectado con moitos aspectos éticos.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Paleoxenética
 Arqueoxenética

Categoría:ADN antigo
Categoría:ADN
Categoría:Xenómica
Categoría:Paleoxenética