Mutaxénese

A mutaxénese é o proceso polo cal a información xenética dun organismo cambia debido a que se orixinou unha mutación.  Pode ocorrer espontaneamente na natureza ou como resultado da exposición a mutáxenos. Pode conseguirse experimentalmente usando procedementos de laboratorio. Un mutáxeno é un axente causante de mutacións (axente mutaxénico), que pode ser químico ou físico, que dá lugar a un incremento na taxa de mutación na información xenética dun organismo. Na natureza a mutaxénese pode conducir á formación dun cancro e a diversas doenzas herdables, pero é tamén unha forza que pula a evolución. A mutaxénese como ciencia desenvolveuse baseándose nos traballos que fixeron Hermann Muller, Charlotte Auerbach e J. M. Robson na primeira metade do século XX.

 Historia 

O ADN pode ser modificado de forma natural ou artificialmente por diversos axentes físicos, químicos e biolóxicos, orixinándose mutacións. Hermann Muller atopou a inicios da década de 1920 que as "altas temperaturas" teñen a capacidade de facer mutar xenes, e en 1927 demostrou a existencia dunha ligazón causal da irradiación con raios X coa mutación experimentando cunha máquina de raios X, notando cambios xenéticos cando irradiaba moscas do vinagre cunha dose relativamente alta. Muller observou varios rearranxos cromosómicos neste experimento e suxeriu que as mutacións poden ser causa do cancro. A asociación da exposición á radiación co cancro fora observada xa en 1902, seis anos despois do descubrimento dos raios X por Wilhelm Röntgen, e o descubrimento da radioactividade por Henri Becquerel.   Lewis Stadler, contemporáneo de Muller, tamén mostrou o efecto dos raios X sobre as mutacións na cebada en 1928, e da radiación ultravioleta (UV) no millo en 1936. Na década de 1940, Charlotte Auerbach e J. M. Robson descubriron que o gas mostaza pode tamén causar mutacións nas moscas do vinagre.

Aínda que os cambios nos cromosomas causados polos raios X e o gas mostaza eran doadamente observables polos primeiros investigadores, outros cambios no ADN inducidos por outros mutáxenos non eran tan fáciles de observar; o mecanismo polo cal ocorren pode ser complexo e levar moito tempo descubrilo. Por exemplo, suxeriuse que o feluxe causa cancro xa en 1775, e demostrouse que o alcatrán de hulla causa tamén cancro en 1915. Os compostos químicos implicados en ambos os casos foron despois identificados como hidrocarburos aromáticos policíclcicos (HAPs).  Os HAPs por si sós non son carcinoxénicos e propúxose en 1950 que as formas carcinoxénicas dos HAPs son os óxidos producidos como metabolitos nos procesos celulares. O proceso metabólico identificouse na década de 1960 como unha catálise do citocromo P450, que produce especies reactivas, que poden interaccionar co ADN para formar adutos, ou moléculas produto resultantes da reacción; o mecanismo polo cal os adutos HAPs dan lugar a mutacións está aínda investigándose.

 Distinción entre mutación e danos no ADN 

Os danos no ADN son alteracións anormais na estrutura do ADN que non poden, por si sós, ser replicados cando se produce a replicación do ADN. En contraste, unha mutación é un cambio na secuencia dun ácido nucleico que pode ser replicada; por tanto, unha mutación pode herdarse dunha xeración á seguinte. Os danos poden ocorrer pola adición dun axente químico (aduto), ou pola alteración estrutural dunha base do ADN (creando un nucleótido anormal ou fragmento de nucleótido) ou unha rotura nunha das febras do ADN ou en ambas. Ditos danos no ADN poden ter como resultado unha mutación. Cando se replica un ADN que contén danos, pode inserirse unha base incorrecta na nova febra complementaria a medida que se sintetiza (ver reparación do ADN § Síntese translesión). A inserción incorrecta na nova febra ocorre en fronte do sitio danado na febra molde e esta inserción incorrecta pode converterse nunha mutación (é dicir, un par de bases cambiado) na seguinte rolda de replicación. Ademais, as roturas de dobre febra no ADN poden ser reparadas por un proceso de reparación inexacto, como é a unión de extremos non homólogos, que produce mutacións. As mutacións poden normalmente evitarse se sistemas precisos de reparación do ADN recoñecen o dano no ADN e repárano antes de que se complete a seguinte rolda de replicación. Empréganse directa ou indirectamente polo menos 169 encimas na reparación do ADN oun inflúen nos procesos de reparación do ADN. Deles, 83 son empregados directamente nos cinco tipos de procesos de reparación (ver reparación do ADN).

O ADN nuclear de mamífero pode sufrir máiss de 60.000 episodios de danos por célula e día (ver danos no ADN (por causas naturais)). Se se deixan sen corrixir, estes adutos, despois dunha replicación incorrecta dos sitios danados, pode orixinarse unha mutación. Na natureza as mutacións que se orixinan poden ser beneficiosas ou deletéreas e isto é unha forza que pula a evolución. Un organismo pode adquirir novas características por medio de mutacións xenéticas, mais as mutacións poden tamén ter como resultado  a alteración ou perda de función dun xene e, en casos graves, causan a morte do organismo. A mutación é tamén unha fonte principal para a adquisición de resistencia a antibióticos en bacterias, e a axentes antifúnxicos en lévedos e mofos. Nun laboratorio, a mutaxénese é unha técnica útil para xerar mutacións que permitan examinar a función dos xenes e produtos xénicos en detalle, producindo proteínas ou cepas con funcións e propiedades útiles melloradas ou novas. Inicialmente a capacidade das radiacións e os mutáxenos químicos de causar mutacións foi aproveitada para xerar mutacións ao chou, pero técnicas posteriores permitiron crear mutacións específicas.

Nos humanos tansmítense unha media de 60 novas mutacións de proxenitores a descendentes. Os varóns tenden a pasar máis mutacións dependendo da súa idade, transmitindo como media dúas novas mutacións á súa proxenie por cada ano adicional de idade.

 Mecanismos 

A mutaxénese pode ser de orixe endóxena (por exemplo, hidrólise espontánea), por medio de procesos celulares que poden xerar especies reactivas do oxíxeno e adutos do ADN ou por erros na replicación e reparación do ADN. A mutaxénese pode tamén ocorrer como resultado da presenza de mutáxenos ambientais que inducen cambios no ADN dun organismo. O mecanismo polo cal ocorre a mutación varía de acordo co mutáxeno ou o axente causal implicado. A maioría dos mutáxenos actúan directa ou indirectamente por medio de metabolitos mutaxénicos sobre o ADN dun organismo, producindo lesións. Porén, algúns mutáxenos poden afectar a replicación ou o mecanismo de repartición cromosómica e outros procesos celulares.

A mutaxénese pode tamén ser autoinducida por organismos unicelulares cando as condicións ambientais son restritivas para o crecemento do organismo, como o crecemento bacteriano en presenza de antibióticos, o crecemento de lévedos en presenza de axentes antifúnxicos ou o crecemento doutros organismos unicelulares nun ambiente que carece dun nutriente esencial.

Moitos mutáxenos químicos necesitan activación biolóxica para ser mutaxénicos. Un grupo importante de encimas que interveñen na xeración de metabolitos mutaxénicos é o citocromo P450. Outros encimas que poden tamén producir metabolitos mutaxénicos son a glutatión S-transferase e a epóxido hidrolase microsomal. Os mutáxenos que non son mutaxénicos de seu senón que necesitan activación biolóxica denomínanse promutáxenos.

Aínda que a maioría dos mutáxenos producen efectos que finalmente dan lugar a erros na replicación, por exemplo creando adutos que interfiren coa replicación, algúns mutáxenos poden afectar directamente o proceso de replicación ou reducen a súa fidelidade. Análogos de bases como o 5-bromouracilo poden substituír a timina na replicación. Os metais como o cadmio, cromo e níquel poden incrementar a mutaxénese de diversas maneiras ademais do dano directo ao ADN, por exemplo reducindo a capacidade de reparar erros, así como producindo cambios epixenéticos.

As mutacións orixínanse como resultado de problemas causados por lesións do ADN durante a replicación, o que ten como resultado erros na replicación. Nas bacterias, os grandes danos no ADN debidos a mutáxenos causan ocos nunha das febras do ADN durante a replicación. Isto induce a resposta SOS, un proceso de reparación de emerxencia que é tamén tendente ao erro, xerando así mutacións. En células de mamíferos a detención da replicación nos sitios danados induce varios mecanismos de rescate que axudan a sortear a zona das lesións no ADN; porén, isto pode tamén causar erros. A familia Y das ADN polimerases está especializada en sortear a zona da lesión no ADN por un proceso denominado síntese translesión, no que estas polimerases de bypass da lesión substitúen as ADN polimerases replicativas de alta fidelidade que quedaron detidas, transitando pola lesión e alongando o ADN ata que se pasa da zona da lesión para que a replicación normal poida recomezar; estes procesos poden ser tendentes ao erro ou libres de erro.

 Danos no ADN e mutación espontánea 

O número de episodios de danos no ADN que ocorren nunha célula de mamíferos por día é alto (máis de 60.000 por día) e supón un problema para os organismos vivos que deben minimizar.

A maioría das mutacións espontáneas orixínanse xeralmente por síntese translesión tendente ao erro ao pasar por un sitio con danos na febra molde durante a replicación do ADN. Este proceso pode potencialmente superar os bloqueos letais no ADN, pero co custo de introducir inexactitudes no ADN fillo. As relacións causais dos danos no ADN coa mutación espontánea ilústrase polo crecemento aeróbico da bacteria Escherichia coli, na cal o 89% das mutacións de substitución de bases que ocorren espontaneamente son causadas por efecto de especies reactivas do oxíxeno. Nos lévedos máis do 60% de substitucións dun só par de bases espontáneas e as delecións son probablemente causadas por síntese translesión.

Unha fonte adicional significativa de mutacións en eucariotas é a inexactitude do proceso de reparación do ADN da unión de extremos non homólogos, que se emprega a miúdo na reparación de roturas de dobre febra.

En xeral parece que a principal causa subxacente de mutacións espontáneas é a síntese translesión tendente ao erro durante a replicación do ADN e que a reparación por unión de extremos non homólogos pode ser un importante contribuínte en eucariotas.

 Hidrólise espontánea 

O ADN non é completamente estable en solución acuosa e pode ocorrer a despurinación do ADN. En condicións fisiolóxicas o enlace glicosídico pode ser hidrolizado espontaneamente e estímase que 10.000 sitios de purina no ADN son despurinados cada día nunha célula.  Existen numerosas vías de reparación do ADN; porén, se o siio apurínico non é reparado, pode ocorrer unha incorporación incorrecta de nucleótidos durante a replicación. A adenina incorpórase preferentemente polas ADN polimerases nun sitio apurínico.

A citidina pode tamén ser desaminada a uridina a unha taxa que é un 5% da taxa de despurinación e pode orixinar unha transición de G a A. As células eucariotas poden tamén conter 5-metilcitosina, que se cre está implicada no control da transcrición xénica, a cal pode ser desaminada a timina.

 Tautomería 

A tautomerización é o proceso polo cal os compostos se rearranxan espontaneamente para adoptar as súas formas de isómero estrutural. Por exemplo, as formas ceto (C=O) da guanina e timina poden rearranxarse nas súas raras formas enol (-OH), mentres que as formas amino (-NH2 ) da adenina e citosina poden orixinar as máis raras formas imino (=NH). Na replicación do ADN, a tautomerización altera os sitios de emparellamento de bases e pode causar o emparellamento impropio das bases dos ácidos nucleicos.

 Modificación de bases 

As bases dos ácidos nucleicos poden ser modificadas endoxenamente por moléculas celulares normais. Por exemplo, o ADN pode ser metilado pola S-adenosilmetionina, que así altera a expresión do xene marcado pola metilación sen causar ningunha mutación na secuencia do ADN. A modificación de histonas é un proceso relacionado no cal as proteínas histonas arredor das cales se enrosca o ADN poden ser tamén modificadas por metilación, fosforilación, ou acetilación; estas modificacións poden actuar para alterar a expresión xénica do ADN local e poden tamén actuar para sinalar localizacións onde hai ADN danado que se debe reparar. O ADN pode tamén ser glicosilado por azucres redutores. Todos estes cambios son de tipo epixenético, xa que non afectan a secuencia de bases.

Moitos compostos como os hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), aminas aromáticas, aflatoxina e alcaloides de pirrolizidina, poden formar especies reactivas do oxíxeno catalizadas polo citocromo P450. Estes metabolitos forman adutos no ADN, os cales poden causar erros na replicación, e os voluminosos adutos aromáticos poden formar intercalacións estables entre as bases e bloquear a replicación. Os adutos poden tamén inducir cambios conformacionais no ADN. Algúns adutos ademais poden orixinar a despurinación do ADN;  porén, non se sabe a importancia da despurinación causada polos adutos na xeración de mutacións.

A alquilación e arilación de bases poden causar erros na replicación. Algúns axentes alquilantes, como as N-nitrosaminas poden requirir a reacción catalítica do citocromo P450 para a formación dun catión alquílico reactivo. O N7 e o O6 da guanina e o N3 e o  N7 da adenina son máis susceptibles ao ataque. Os aduntos no N7 da guanina forman a maioría dos adutos do ADN, pero parece que non son mutaxénicos. Porén, a alquilación en O6 da guanina é daniña porque a reparación por escisión do aduto en O6 da guanina pode ser deficiente nalgúns tecidos como o do cerebro. A metilación en O6 da guanina pode ter como resultado unha transición de G a A, mentres que a metilamina en O4 pode ser emparellada incorrectamente coa guanina. O tipo de mutación xerada pode, non obstante, depender do tamaño e tipo de aduto así como da secuencia do ADN.

As radiacións ionizantes e as especies reactivas do oxíxeno oxidan con frecuencia a guanina producindo 8-oxoguanina.

miniatura|180px|As frechas indican roturas cromosómicas debidas a danos no ADN.

 Danos no esqueleto molecular do ADN 

A radiación ionizante pode producir radicais libres moi reactivos que poden romper os enlaces no ADN. As roturas de dobre febra son especialmente nocivas e difíciles de reparar, producindo translocacións e delecións de partes dun cromosoma. Os axentes alquilantes como o gas mostaza poden tamén causar roturas no esqueleto do ADN. O estrés oxidativo pode tamén xerar potentes  especies reactivas do oxíxeno que poden danar o ADN. A reparación incorrecta doutros danos inducidos polas especies do oxíxeno altamente reactivas pode orixinar mutacións.

 Enlaces cruzados 

Os enlaces covalentes entre as bases dos nucleótidos do ADN da mesma febra ou de febras opostas denomínanse enlaces cruzados no ADN; o estableceento de enlaces cruzados pode afectar tanto a replicación coma a transcrición do ADN e pode ser causado pola exposición a diversos axentes. Algúns son compostos químicos que aparecen na natureza e que tamén promoven os enlaces cruzados, como os psoralenos despois da activación pola radiación UV e o ácido nitroso. Os enlaces cruzados entre febras opostas causan máis danos, xa que bloquean a replicación e transcrición e poden causar roturas cromosómicas e rearranxos. Algúns compostos que facilitan os enlaces cruzados, como a ciclofosfamida, a mitomicina C e o cisplatino utilízanse na quimioterapia anticancro debido ao seu alto grao de toxicidade para as células proliferantes.

 Dimerización 

A dimerización consiste na unión de dous monómeros para formar un oligómero, como a formación de dímeros de pirimidinas como resultado da exposición a radiación UV, o cal promove a formación dun anel ciclobutilo entre timinas adxacentes no ADN. En células humanas poden formarse miles de dímeros ao día debido á exposición normal á luz solar. A ADN polimerase η pode tamén axudar a sortear estas lesións pero dun modo tendente ao erro; porén, os individuos cunha función de reparación do ADN derfectuosa, como os que sofren xeroderma pigmentosum, son sensibles á luz do sol e teñen máis risco de ter cancro de pel. miniatura|250px|Etidio intercalado entre dous pares de bases adenina-timina. Clinicamente pode distinguirse se se formou un tumor como consecuencia directa da radiación UV por análise de secuenciación do ADN para o padrón de dimerización específico de contexto caracteístico que aparece debido á excesiva exposición ao sol.

 Intercalación entre bases 

A estrutura planar de compostos químicos como o bromuro de etidio e a proflavina permítelles inserirse entre as bases do ADN. Esta inserción causa que o esqueleto da molécula de ADN se estire e fai que ocurra con maior probabilidade o deslizamente (slippage) no ADN durante a replicación, xa que os enlaces entre as cadeas se fan menos estables. O slippage cara a adiante orixinará unha mutación por deleción, mentes que en dirección inversa causará unha mutación por inserción. Ademais, a intercalación no ADN de antraciclinas como a daunorrubicina e a doxorrubicina interfire co funcionamento do encima topoisomerase II, bloqueando a replicación e causando recombinación homóloga mitótica.

 Mutaxénese insercional 

Os transposóns e os virus ou retrotransposóns poden inserir secuencias de ADN en rexións codificantes ou elementos funcionais dun xene e teñen como resultado a inactivación do xene. Isto denomínase mutaxénese insercional.

 Mecanismos da mutaxénese adaptativa 

A mutaxénese adaptativa comprende os mecanismos de mutaxénese que permiten que un organismo se adapte a un estrés ambiental. Como a variedade de estreses ambientais é moi ampla, os mecanismos que a permiten son tamén bastante diversos, como demostran as investigacións realizadas neste eido. Por exemplo, en bacterias, a modulación da resposta SOS e a síntese de ADN de profago endóxeno incrementa a resistencia de Acinetobacter baumannii á ciprofloxacina. Os mecanismos de resistencia presúmese que están ligados a mutacións cromosómicas intransferibles por transferencia horizontal de xenes nalgúns membros da familia Enterobacteriaceae, como Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella spp. e Enterobacter spp. Os eventos cromosómicos, especialmente a amplificación xénica, parecen ser relevantes nesta mutaxénese adaptativa en bacterias.

As investigacións feitas en células eucariotas son moito máis escasas, pero os eventos cromosómicos parecen tamén ser bastante relevantes: mentres que se informou que a recombinación intracromosómica ectópica está implicada na adquisición de resistencia á 5-fluorocitosina en Saccharomyces cerevisiae, atopouse que as duplicacións xenómicas lle dan resistencia a esta mesma especie aos ambientes don escaseza de nutrientes.

 Aplicacións de laboratorio 

No laboratorio a mutaxénese é unha técnica pola cal se xeran deliberadamente por enxeñaría mutacións no ADN para producir xenes mutantes, proteínas ou cepas de organismos. Poden mutarse varios constituíntes dun xene, como os seus elementos de control e os seus produtos xénicos, isto permite que a función dun xene ou proteína poida ser examinada en detalle. A mutación pode tamén producir proteínas mutantes con propiedades alteradas interesantes ou mellorar ou crear unha nova función que poida ser útil comercialmente. Poden xerarse tamén  cepas mutantes de organismos que teñen aplicacións prácticas ou que permiten investigar as bases moleculares dunha determinada función da célula.

Os primeiros métodos de mutaxénese producían mutacións completamente ao chou; porén, os métodos modernos de mutaxénese poden producir mutacións específicas de sitio. Entre as modernas técnicas de laboratorio usadas para xerar estas mutacións están:

 Mutaxénese dirixida a sitio / mutaxénese de PCR
 Mutaxénese insercional
 Mutaxénese etiquetada con sinatura
 Mutaxénese de transposón
 Mutaxénese de saturación de secuencias

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
Carcinoxénese
Danos no ADN (por causas naturais)
Reparación do ADN
Mutáxeno
Mutación
Taxa de mutación
Transfección

Categoría:Mutaxénese