Experimento de Avery, MacLeod e McCarty

O experimento de Avery, MacLeod e McCarty foi unha demostración experimental publicada en 1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty, de que o ADN é a substancia que causa a transformación bacteriana, o que implicaba que portaba a información xenética, nunha época en que a maioría dos científicos consideraban que as proteínas eran as moléculas que realizaban a función de almacenar a información xenética (e a propia palabra proteína acuñouse así coa raíz protos polo convencemento que había daquela de que a súa función era primaria). Foi a culminación das investigacións feitas na década de 1930 e en toda a primeira metade do século XX no Rockefeller Institute for Medical Research que intentaban identificar cal era o "principio transformante" responsable do fenómeno da transformación bacteriana descrito no famoso experimento de Griffith de 1928, no cal Griffith matou con calor unha cepa virulenta de tipo III-S da bacteria Streptococcus pneumoniae (pneumococo), e inxectou esas bacterias mortas xunto con bacterias vivas da cepa non virulenta II-R de pneumococos, o que tivo como resultado a morte do rato e a aparición no cadáver de bacterias de tipo III-S vivas, as cales eran bacterias II-R transformadas en III-S porque se supoñía que algunha substancia descoñecida (o "principio transformante") procedente das III-S mortas pasaba ás II-R vivas causando a transformación. Avery e os seus colegas, no seu artigo "Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types: Induction of Transformation by a Desoxyribonucleic Acid Fraction Isolated from Pneumococcus Type III", publicado no número de febreiro de 1944 da revista Journal of Experimental Medicine, suxiren que é o ADN (e non as proteínas como se cría maioritariamente daquela) o material hereditario das bacterias e o "principio transformante" buscado, e que podía ser análogo aos xenes  e/ou virus dos organismos superiores.Fruton (1999), pp. 438–440

miniatura|400px|Avery ae os seus colegas mostraron que o ADN era o compoñente clave do experimento de Griffith, no cal se inxectaban en ratos bacterias mortas dunha cepa virulenta con bacterias vivas doutra cepa non virulenta e orixinábase unha infección similar ás causadas pola cepa virulenta.

Co desenvolvemento da tipificación serolóxica, os investigadores médicos puideron clasificar as bacterias en diferentes cepas, ou tipos.  Cando se inocula unha persoa ou animal de laboratorio (como os ratos) cun determinado tipo ou cepa, orixínase unha resposta inmunitaria, xerando anticorpos que reaccionan especificamente cos antíxenos da bacteria. O soro sanguíneo que contén os anticorpos pode extraerse despois e ser aplicado a un cultivo bacteriano. Os anticorpos reaccionarán con outras bacterias do mesmo tipo que os da inoculación orixinal. Os tipos de pneumococos e a súa tipificación serolóxica descubríraos o bacteriólogo alemán Fred Neufeld. Ata os estudos de Frederick Griffith os bacteriólogos crían que os tipos (cepas) estaban fixados e non podían cambiar dunha xeración á seguinte, pero o experimento de Griffith demostraba o contrario.Lehrer, Steven. Explorers of the Body. 2nd edition. iuniverse 2006 p 46 

O experimento de Griffith, publicado en 1928, indicaba que algún tipo de "principio transformante" da bacteria pneumococo podía causar a transformación dun tipo de pneumococo a outro. Griffith, que era un oficial médico británico, pasara varios anos aplicando a tipificación serolóxica a casos de pneumonía, unha enfermidade que podía ter un fatal desenlace frecuente a inicios do século XX. Atopou que varios tipos de pneumococos, algúns virulentos e outros non virulentos, estaban presentes no curso dun caso clínico de pneumonía e pensou que un tipo podía transformarse noutro (en vez de que simplemente cada tipo se reproducise). Para comprobar esa posibilidade, atopou nos seus experimentos que a transformación podía ocorrer cando as bacterias mortas do tipo virulento e as vivas non virulentas eran inxectadas xuntas en ratos: o rato desenvolvía unha infección mortal (normalmente causada polas bacterias vivas de tipo virulento) e que se podían illar bacterias virulentas vivas do rato infectado (a pesar que non se inoculara ningunha viva dese tipo).

Os descubrimentos do experimento de Griffith axiña foron confirmados, primeiro por Fred Neufeld no Instituto Robert Koch e por Martin Henry Dawson no Instituto Rockefeller.Dawson, Martin H.  "The Interconvertibility of 'R' and 'S' Forms of Pneumococcus",  Journal of Experimental Medicine, volume 47, no. 4 (1 de abril de 1928): 577–591. Unha serie de investigadores do Instituto Rockefeller continuaron estudando a transformación nos anos seguintes. Xunto con Richard H.P. Sia, Dawson desenvolveu un método para transformar bacterias in vitro (en vez de in vivo como fixera Griffith). Despois da marcha de Dawson en 1930, James Alloway retomou os intentos de ampliar os descubrimentos de Griffith, que tiveron como resultado a extracción de solucións acuosas do principio transformante en 1933. Colin MacLeod traballou purificando esas solucións desde 1934 a 1937, e os traballos foron continuados en 1940 e completados por Maclyn McCarty.Fruton (1999), p. 438The Oswald T. Avery Collection: "Shifting Focus: Early Work on Bacterial Transformation, 1928–1940."  Profiles in Science.  U.S. National Library of Medicine. Consultado o 25 de febreiro de 2009.

 Traballo experimental 
O pneumococo caracterízase por formar colonias lisas nas que as bacterias teñen unha cápsulas de polisacárido ou rugosas, sen cápsula. Os diferentes tipos clasifícanse de acordo coas súas especificidades inmunolóxicas.

O procedemento de purificación seguido por Avery consistía en primeiro matar a bacteria con calor e extraer os compoñentes solubles en solución salina. Despois, causábase a precipitación das proteínas usando cloroformo e as cápsulas de polisacárido eran hidrolizadas cun encima. Para verificar a completa destrución das cápsulas realizábase unha precipitación inmunolóxica causada por anticorpos específicos de tipo. Seguidamente, a porción activa era precipitada por fraccionamento con alcohol, orixinándose febras de moléculas fibrosas que podían ser retiradas cunha variña axitadora.

A análise química mostraba que as proporcións de carbono, hidróxeno, nitróxeno e fósforo nesta porción activa eran consistentes coa composición química do ADN. Para mostrar que o responsable da transformación era o ADN e non algunha pequena cantidade de ARN, proteínas ou algún outro compoñente celular, Avery e os seus colegas usaron diversos tests bioquímicos. Atoparon que a tripsina, quimotripsina e ribonuclease (encimas que degradan as proteínas e o ARN) non afectaban a transformación, pero que unha preparación encimática de "desoxirribonucleodepolimerase" (unha preparación crúa, que se podía obter de moitas fontes animais, que podía degradar o ADN) destruía o poder transformante do extracto.

Posteriores traballos en resposta a críticas e obxección que xurdiran incluíron a purificación e cristalización, feita por Moses Kunitz en 1948 dunha ADN depolimerase (deoxirribonuclease I), e os precisos traballos de Rollin Hotchkiss que mostraban que virtualmente todo o nitróxeno detectado no ADN purificado procedía da glicina, un produto da degradación da base nitroxenada nucleotídica adenina, e que a contaminación por proteínas non detectadas era como moito do 0,02% segundo a estimación de Hotchkiss.Fruton (1999), p. 439

miniatura|150px|Oswald Avery
miniatura|150px|Colin MacLeod
miniatura|150px|Maclyn McCarty (con Watson e Crick)

 Repercusión  do experimento 
Os descubrimentos experimentais do experimento de Avery, MacLeod e McCarty foron rapidamenre confirmados e ampliados a outras características hereditarias distintas das cápsulas polisacáridas bacterianas. Porén, había unha considerable reticencia a aceptar a conclusión de que o ADN era o material xenético. Segundo a influente "hipótese do tetranucleótido" de Phoebus Levene, o ADN consistía en unidades repetidas dos catro nucleótidos (coas catro bases nitroxenadas) e tiña pouca especificidade biolóxica. O ADN era, por tanto, considerado simplemente un compoñente estrutural dos cromosomas, mentres que se pensaba que os xenes probablemente estaban feitos do compoñente proteico dos cromosomas.Morange (1998), pp. 30–39Fruton (1999), pp. 440–441 Esta liña de pensamento foi reforzada pola cristalización en 1935 do virus do mosaico do tabaco feita por Wendell Stanley, e os paralelismos entre virus, xenes e encimas. Así, moitos biólogos pensaban que os xenes poderían ser unha especie de "superencima" e que os virus eran considerados, de acordo con Stanley, proteínas e compartían a propiedade da autocatálise con moitos encimas.Para as teorías entrecruzadas sobre virus, xenes e encimas neste período ver: Creager, Angela N. H. The Life of a Virus: Tobacco Mosaic Virus as an Experimental Model, 1930–1965. University of Chicago Press: Chicago, 2002.  Ademais, poucos biólogos pensaban que a xenética se puidese aplicar ás bacterias, xa que estas carecían de cromosomas e de reprodución sexual. En particular, moitos dos xenetistas coñecidos informalmente como o grupo dos fagos, que serían moi influentes na nova disciplina da bioloxía molecular na década de 1950, eran contrarios a considerar o ADN o material xenético (e estaban inclinados a evitar os "desordenados" enfoques bioquímicos de Avery e os seus colegas). Algúns biólogos, incluíndo algúns do propio Instituto Rockefeller como Alfred Mirsky, poñían en dúbida os descubrimentos de Avery de que o principio transformante era ADN puro, suxerindo que os responsables eran os contaminantes proteicos presentes. Aínda que a transformación ocorría nalgúns tipos de bacterias, non podía ser replicada noutras bacterias (nin en ningún organismo superior), e a súa importancia parecía limitada principalmente á medicina.Deichmann, pp. 220–222

Os científicos que examinaron a repercusión do experimento de Avery, MacLeod e McCarty non están de acordo sobre o influente que foi na década de 1940 e inicios da de 1950. Gunther Stent suxeriu que foi en gran medida ignorado e só foi celebrado anos máis tarde, de maneira similar ao que ocorrera cos traballos de Gregor Mendel décadas antes do xurdimento da xenética. Outros, como Joshua Lederberg e Leslie C. Dunn, testemuñan a súa importancia temperá e citan o experimento como o comezo da xenética molecular.Deichmann, pp. 207–209

Uns cantos microbiólogos e xenetistas estaban interesados na natureza química e física dos xenes antes de 1944, pero o experimento de Avery, MacLeod e McCarty trouxo un maior e renovado interese sobre o asunto. Aínda que a publicación orixinal non menciona a xenética especificamente, Avery e moitos xenetistas que leron o seu artigo eran conscientes das implicacións xenéticas que tiña: Avery podía ter conseguido illar un xene como ADN puro. O bioquímico Erwin Chargaff, o xenetista H. J. Muller e outros loaron o resultado como algo que establecía a especificidade biolóxica do ADN e tiña importantes implicacións para a xenética se se demostraba que o ADN tiña un papel similar nos organismos superiores. En 1945, a Royal Society premiou a Avery coa medalla Copley, en parte polo seu traballo sobre a transformación bacteriana.Deichmann, pp. 215–220

Entre 1944 e 1954 o artigo foi citado polo menos 239 veces (de forma uniforme ao longo daqueles anos), principalmente en artigos de microbioloxía, inmunoquímica e bioquímica. Ademais dos traballos posteriores de McCarty e outros no Instituto Rockefeller en resposta ás críticas de Mirsky, o experimento estimulou a realización de considerables traballos en microbioloxía, onde axudou a aclarar as analoxías entre a herdanza bacteriana e a xenética dos organismos que se reproducen sexualmente. O microbiólogo francés André Boivin informou que estendera os descubrimentos sobre a transformación bacteriana en pneumococos de Avery a Escherichia coli, aínda que isto non puido ser confirmado por outros investigadores. Porén, en 1946 Joshua Lederberg e Edward Tatum demostraron a conxugación bacteriana en E. coli e mostraron que a xenética podía aplicarse a bacterias, mesmo se o método específico de Avery da transformación non era xeral. O traballo de Avery tamén motivou a Maurice Wilkins a continuar os estudos de cristalografía de raios X do ADN, aínda que se enfrontou á presión dos seus financiadores de que enfocase a súa investigación a células completas e non a biomoléculas.

Malia o importante número de citas do artigo e as respostas positivas que recibiu nos anos seguintes á súa publicación, o traballo de Avery foi en gran medida desatendido por gran parte da comunidade científica. Aínda que foi recibido positivamente por moitos científicos, o experimento non afectou seriamente ás liñas principais de investigación xenética, en parte porque non supoñía a penas diferenza para os experimentos de xenética clásica, nos cales os xenes se definían polo seu comportamento en experimentos de cruzamento en lugar de polas súas características químicas. H. J. Muller, aínda que estivo interesado, estaba centrado en estudos máis físicos que químicos do xene, como tamén o estaban a maioría dos membros do grupo dos fagos. O traballo de Avery foi tamén ignorado pola Fundación Nobel, que posteriormente expresou publicamente o seu lamento por non ter concedido a Avery o premio Nobel.Deichmann, pp. 227–231

No período en que se fixo o experimento de Hershey e Chase, os xenetistas xa estaban máis inclinados a considerar que o ADN era o material xenético e Alfred Hershey foi un influente membro do grupo dos fagos.Morange (1998), pp. 44–50Fruton (1999), pp. 440–442 Erwin Chargaff demostrara que a composición en bases do ADN varía dunha especie a outra (o que é contrario á hipótese do tetranucleótido), e en 1952 Rollin Hotchkiss publicou as súas probas experimentais que confirmaban o traballo de Chargaff e demostraban a ausencia de proteínas no principio transformante de Avery. Ademais, o campo da xenética bacteriana foi rapidamente quedando establecido e os biólogos estaban máis inclinados a pensar que se debía considerar a herdanza nos mesmos termos para bacterias e organismos superiores. Despois de que Hershey e Chase usasen isótopos radioactivos para mostrar que era o ADN e non as proteínas, o que entraba nas bacterias despois dunha infección por bacteriófagos, enseguida se aceptou amplamente que o ADN era o material xenético. A pesar dos seus resultados experimentais moito menos precisos (xa que encontraron que tamén entraba na célula unha cantidade non insignificante de proteína xunto co ADN), o experimento de Hershey e Chase non foi sometido ao mesmo grao de obxeccións. A súa influencia foi impulsada pola rede crecente de científicos do grupo dos fagos e, ao ano seguinte, pola publicidade que rodeou á resolución da estrutura do ADN proposta por Watson e Crick  (Watson era tamén membro do grupo dos fagos). Porén, soamente en retrospectiva ambos os experimentos probaron definitivamente que o ADN é o material xenético.

 Notas 

 Bibliografía 

 Fry, Michael (2016) Landmark Experiments in Molecular Biology; Elsevier-Academic Press, United States, 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Experimento de Griffith
 Experimentos de Hershey e Chase

 Ligazóns externas 
Profiles in Science: The Oswald T. Avery Collection

Categoría:Xenética
Categoría:Bioloxía
Categoría:Experimentos