Clonación TA

A clonación TA, tamén chamada clonación rápida ou clonación T (TA cloning, T cloning), é unha técnica de  subclonación que evita case totalmente o uso de encimas de restrición e é máis doada de realizar e máis rápida que a subclonación tradicional. A técnica baséase na habilidade da adenina (A) e a timina (T) (par de bases complementarias) de diferentes fragmentos de ADN de hibridarse e, en presenza dunha ligase, os fragmentos quedan unidos. Os produtos de PCR producidos son xeralmente amplificados usando a ADN polimerase Taq, que engade preferentemente unha adenina ao extremo 3' do produto. Ditos insertos amplificados por PCR son clonados en vectores linearizados que teñen tramos sobresaíntes colgantes 3' de  timina complementarios ás adeninas.

 Procedemento 
miniatura|400px|Diagrama da clonación TA.

 Creación do inserto 

O inserto créase por medio da PCR usando a polimerase Taq. Esta polimerase carece de actividade de corrección de erros 3' a 5' e, con alta probabilidade, engade un tramo sobresaínte colgante monocatenario 3' de adenina a cada extremo do produto da PCR. É mellor se os cebadores de PCR teñen guaninas no extremo 5' xa que isto maximiza a probabilidade de que a ADN polimerase Taq engada o tramo colgante final de adenosina. Non se deberían usar polimerases termoestables que teñan unha actividade exonuclease extensiva 3´ a 5´, porque non deixan os tramos sobresaíntes colgantes 3' de adenina.

 Creación do vector 

O vector diana, inicialmente circular, é linearizado e cortado cun encima de restrición que deixa extremos romos. Este é o único momento en que se usan encimas de restrición nesta técnica. A este vector fáiselle despois unha cola con didesoxitimidina trifosfato (ddTTP) usando unha transferase terminal. É importante usar ddTTP para asegurarse da adición unicamente dun só residuo T. A creación da cola deixa o vector cun só residuo de timina 3' colgante e non apareado en cada extremo romo. Os fabricantes xeralmente venden "kits" para a clonación TA cunha ampla gama de vectores preparados que xa foron linearizados e etiquetados cunha timina colgante.

 Vantaxes e inconvenientes 

Dado que nesta técnica non hai necesidade de utilizar encimas de restrición a non ser para xerar o vector linearizado, o procedemento é moito máis simple e rápido que a subclonación tradicional. Tampouco se precisa engadir sitios de restrición cando se deseñan os cebadores e así poden utilizarse cebadores máis curtos e aforrar tempo e diñeiro. Ademais, en casos en que non hai sitios de restrición viables pode usarse esta técnica como alternativa á clonación tradicional. O maior inconveniente da clonación TA é que a clonación direccional non é posible, así que o xene ten un 50% de posibilidades de ser clonado na dirección inversa.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
Clonación TOPO

Categoría:Clonación
Categoría:Bioloxía molecular
Categoría:Biotecnoloxía
Categoría:Técnicas de bioloxía molecular