GLUD1

A glutamato deshidroxenase 1 (GLUD1) é un encima da matriz mitocondrial, un dos encimas da familia das glutamato deshidroxenases, que están moi estendidas entre os seres vivos. Exerce un papel clave no metabolismo do nitróxeno e glutamato (Glu) e na homeostase enerxética. Esta deshidroxenase exprésase a altos niveis no fígado, cerebro, páncreas e riles, pero non no músculo. Nas células pancreáticas, pénsase que a GLUD1 está implicada nos mecanismos de secreción de insulina. No tecido nervioso, onde o glutamato está presente nunha concentración máis alta que noutros tecidos, a GLUD1 parece funcionar tanto na biosíntese coma no catabolismo do glutamato e quizais na detoxificación do amoníaco.

 Estrutura 

 Xene 

miniatura|429px|Estrutura de exóns/intróns de GLUD1.O esquema de cores é o seguinte: Glu-BD, NAD(P)-BD, antena, a hélice pivote

O xene GLUD1 humano contén 13 exóns e está localizado no cromosoma 10.

Hai probas de que unha copia de GLUD1 pasou ao cromosoma X, onde deu lugar ao xene sen intróns GLUD2 por mutacións aleatorias e selección natural. GLUD2 adaptouse ás necesidades particulares do sistema nervioso, onde se expresa especificamente.

 Proteína 

miniatura|500px|A estrutura de dominios de GLUD1Cada dominio está coloreado de forma diferente: Glu-BD, NAD(P)-BD, antena, a hélice pivote. Os reguladores alostéricos móstranse como modelos de esfera. Esta estrutura particular de GLUD1 é unha combinación de dúas estruturas de difracción de raios X, unha con GTP unido (1HWZ) e a segunda con ADP unido (1NQT). Aínda que non é real, esta estrutura mostra a posición relativa dos efectores alostéricos cando se unen a GLUD1. Tamén se mostran o NADPH e o Glu.

O encima GLUD1 é un hexámero. A unidade monómera ten os seguintes dominios:
 Dominio de unión ao glutamato N-terminal (ou N-terminal Glu-BD), que está composto principalmente por follas β.
 Dominio de unión ao NAD (ou NAD-BD), ao que se poden unir os coencimas NAD+ ou NADP+.
 Unha proxección similar a unha antena de 48 residuos, que se estende desde a parte superior de cada NAD-BD. A antena consta dunha hélice ascendente e unha febra descendente enroscada ao chou que contén unha pequena hélice α cara ao extremo C-terminal da febra.
O NAD-BD sitúase na parte superior do Glu-BD. O NAD-BD e o Glu-BD forman a fenda catalítica. Durante a unión do susbstrato, o NAD-BD móvese significativamente. Este movemento ten dúas compoñentes, rotación ao longo do eixe longo da hélice na parte de atrás do NAD-BD, chamada "hélice pivote", e retorcemento sobre a antena en dirección das agullas do reloxo. Unha comparación das conformacións aberta e pechada de GLUD1 revela cambios na pequena hélice da febra descendente da antena, que parece volver a enroscarse a medida que se abre a fenda catalítica. O peche dunha subunidade está asociado coa distorsión da pequena hélice da febra descendente, que é empurrada cara á antena da subunidade adxacente. R496 está localizada sobre esta pequena hélice.

A estrutura central do hexámero é un dímero de trímeros amontoados. Os Glu-BDs dos monómeros son responsables principalmente da constitución da parte central. A posición relativa dos monómeros é tal que a rotación sobre a hélice pivote de cada monómero non está restrinxida. As antenas destas tres subunidades dos trímeros envólvense unhas sobre as outras e sofren cambios conformacionais a medida que a fenda catalítica se abre e pecha. A antena serve como un conduto de comunicación entre subunidades durante a cooperatividade negativa e a regulación alostérica.

O aliñamento de GLUD1 obtida de varias fontes mostra que a antena probablemente evolucionou nos protistas antes da formación dos sitios reguladores de purina. Isto suxire que a propia antena ten algunha vantaxe selectiva e que nos animais evolucionaron novas funcións para GLUD1 pola adición de regulación alostérica.

GLUD1 pode formar longas fibras para unha asociación extremo con extremo dos hexámeros. A polimerización non está relacionada coa actividade catalítica, pero probablemente ten un importante papel na formación de complexos multiencimáticos.

GLUD1 ten dous sitios de unión de coencimas: un no NAD-BD, no que se pode unir NAD+ ou NADP+ e está directamente implicado no proceso da catálise, e o segundo, que ten unha función reguladora, que descansa directamente debaixo da hélice pivote, na que se pode unir ADP, NAD+, ou NADH, pero ao que non se une NADPH ben.

 Función 

GLUD1 cataliza a desaminación oxidativa do glutamato (Glu) a α-cetoglutarato (ou 2-oxoglutarato) e NH4+ libre (é o amonio, o amoníaco ionizado) usando  NAD+ ou NADP+ como cofactor. A reacción ocorre coa transferencia dun ión hidruro desde o Cα do glutamato ao NAD(P)+, formando así 2-iminoglutarato, que é hidrolizado a α-cetoglutarato (= 2-oxoglutarato) e NH4+. O equilibrio da reacción baixo circunstancias estándar favorece moito a formación de glutamato sobre a de NH4+ (G<sub<o' ~ 30 kJ·mol-1). Por esta razón, pensouse que o encima xogaba un importante papel na detoxificación do amoníaco, porque como os niveis altos de NH4+ son tóxicos, a posición de equilibrio sería fisioloxicamente importante: axudaría a manter baixo o NH4+. Porén, en individuos cunha certa forma de hiperamonemia resultante dun tipo de hiperinsulinismo, a actividade do encima increméntase debido ao descenso na sensibilidade ao GTP, un regulador negativo. Estes niveis de amoníaco sanguíneos do individuo elévanse significativamente, o cal non se esperaría se o encima realmente operase no equilibrio.

 Interaccións 

 Moléculas que se unen ao encima 

 ADP 

O ADP únese por detrás do NAD-BD, xusto baixo a hélice pivote, o segundo sitio de unión de coencimas. O residuo de adenosina únese nun peto hidrofóbico cos grupos ribosa-fosfato apuntando para arriba cara á hélice pivote.

O ADP pode tamén unirse ao segundo sitio para o NADH, inhibitorio, pero causa activación.

 GTP 

A unión do GTP é antagonizada polo Pi e o ADP, pero é sinerxístico coa unión do NADH no sitio alostérico non catalítico. A maioría dos contactos entre o GTP e o encima son por medio do residuo trifosfato. O sitio de unión do GTP é considerado un "sensor" que "apaga" o encima cando a célula está nun estado de alta enerxía. O GTP únese na zona onde se unen o NAD-BD e a antena.

Mentres que a maior parte das interaccións GLUD1-GTP son por interaccións cos fasfatos β- e γ, hai interaccións específicas con E346 e K343 que favorecen a guanosina sobre a adenosina.

Na conformación aberta, o sitio de unión do GTP está distorsionado de modo que xa non se pode unir o GTP.

 Regulación 

Cando GLUD1 está moi saturado cos ligandos (substratos) do sitio activo, fórmase un complexo inhibitorio abortivo no sitio activo: NAD(P)H·Glu na reacción de desaminación oxidativa a pH alto, e NAD(P)+·α-cetoglutrato na reacción de aminación redutora a pH baixo. GLUD1 adopta o seu estado de configuración basal en ausencia de efectores alostéricos, sen importar se os sitios alostéricos son funcionais. Os reguladores alostéricos de GLUD1 (ADP, GTP, Leu, NAD+ e NADH) exercen os seus efectos cambiando a enerxía necesaria para abrir e pechar a fenda catalítica durante o recambio encimático, noutras palabras desestabilizando ou estabilizando, respectivamente, os complexos abortivos. Os activadores non son necesarios para a función catalítica de GLUD1, xa que é activo en ausencia destes compostos (estado basal). Suxeriuse que GLUD1 adopta no seu estado basal unha configuración (fenda catalítica aberta) que permite a actividade catalítica independentemente de se os sitios alostéricos son funcionais. A regulación de GLUD é de importancia biolóxica especial, como se exemplificou por observacións que mostraron que as mutacións reguladoras de GLUD1 están asociadas con manifestacións cínicas en nenos.

 ADP 
Como o ADP é un dos maiores activadores (o NAD+ é o outro), actúa desestabilizando os complexos abortivos e cancelando a cooperatividade negativa. Na ausencia de substratos e co ADP unido, a fenda catalítica está na conformación aberta e os hexámeros GLUD1 forman longos polímeros na célula cristalina con máis interaccións que as que se encontran nos cristais do complexo abortivo (1NQT). Isto é consistente co feito de que o ADP promova a agregación en solución. Cando a fenda catalítica se abre, R516 rota cara a abaixo sobre os fosfatos do ADP. A abertura da fenda catalítica está aproximadamente correlacionada coa distancia entre R516 e os fosfatos do ADP. Deste xeito, o ADP activa GLUD1 facilitando a abertura da fenda catalítica que fai diminuír a afinidade do produto e facilita a liberación do produto. permitindo así que GLUD1 reconcilie os complexos abortivos non catalíticos.

Suxeriuse previamente que a inhibición por altas concentracións de ADP se debía á competición entre o ADP e o residuo de adenosina do coencima no sitio activo 1. Polo menos sábese que o efecto non se ve relativamente afectado nin por H507Y nin por R516A.

 ATP 

O ATP ten complexos efectos dependentes da concentración sobre a actividade de GLUD1:
 Concentracións baixas de ATP.- Causan inhibición mediada pola súa unión ao sitio de unión do GTP, xa que é eliminado por H507Y. A afinidade do ATP polo sitio de unión do GTP parece ser mil veces menor que a do propio GTAP, xa que as interaccións entre os fosfatos β e γ son o principal determinante da unión ao sitio de unión do GTP.
 Concentracións intermedias de ATP.- Causan activación mediada pola súa unión ao sitio efector do ADP, xa que é completamente eliminado por R516A. Neste sitio o grupo nucleótido é o principal determinante da unión.
 Concentracións altas de ATP.- Causan inhibición mediada pola súa unión feble no terceiro sitio, que é relativamente específico para os nucleótidos de adenina. Este efecto non se ve afectado relativamente por H507Y nin por R516A. Como se suxeriu para o ADP podería deberse a unha competición entre o ATP e o residuo de adenosina do coencima no seu sitio activo.

 GTP 

O GTP inhibe o recambio encimático nunha ampla gama de condicións ao incrementar a afinidade de GLUD1 polo produto da reacción, facendo que a liberación do produto sexa limitante da velocidade da reacción en todas as condicións en presenza de GTP. O GTP actúa mantendo a fenda catalítica nunha conformación pechada, estabilizando así os complexos abortivos. Os efectos do GTP sobre GLUD1 non están localizados soamente na subunidade á que este se une, e a antena desempeña un importante papel comunicando esta inhibición ás outras subunidades.

 Leu 

A leucina (Leu) activa GLUD1 independentemente do sitio para o ADP ao unirse noutro lugar, quizais directamente na fenda catalítica. As respostas potenciadas en pacientes de hiperinsulinemia/hiperamonemia (ver síndrome HI/HA) á estimulación pola Leu da liberación de insulina, que é resultado da súa sensibilidade alterada á inhibición por GTP, salientan a importancia fisiolóxica do control inhibitorio de GLUD1.

 NAD+ 

O NAD(P)(H) pode unirse ao segundo sitio de cada subunidade. Neste sitio únese o NAD(H) unhas 10 veces mellor que o NADP(H) e as formas reducidas únense mellor que as oxidadas. Aínda que se sinalou que a unión do coencima reducido neste sitio inhibe a reacción mentres que o encima oxidado causa activación, o efecto aínda non está claro.

 NADH 

O NADH é outro inhibidor alostérico importante de GLUD1.

 Fosfato 
O fosfato e outros anións bivalentes estabilizan GLUD1. Recentes estudos estruturais mostraron que as moléculas de fosfato se unen ao sitio do GTP.

 Importancia clínica 

O hiperinsulinismo familiar (FHI), ligado a mutacións en GLUD1, caracterízase por unha hipoglicemia que pode ir desde unha doenza con comezo neonatal grave, doenza difícil de tratar, a unha doenza que comeza na nenez, con síntomas leves e hipoglicemia difícil de diagnosticar. A doenza de comezo neonatal maniféstase en cuestión de horas ou días despois do nacemento. A enfermidade que comeza na nenez maniféstase durante os primeiros meses ou anos de vida. No período neonatal os síntomas que se presentan poden ser inespecíficos, como convulsións, hipotonía, mala alimentación e apnea. En casos graves as concentración de glicosa sérica son tipicamente extremadamente baixas e grazas a iso son doadamente recoñecibles, mentres que nos casos leves, unha hipoglicemia variable e leve pode facer que o diagnóstico sexa máis difícil. Incluso dentro dunha mesma familia, as manifestacións da doenza poden ser de leves a graves. Os individuos con hiperinsulinismo familiar autosómico recesivo, causado por mutacións en ABCC8 ou KCNJ11 (FHI-KATP), adoitan ser grandes para a súa idade xestacional e xeralmente presentan unha grave hipoglicemia refractaria nas primeiras 48 horas de vida; os nenos afectados xeralmente responden só parcialmente ás dietas ou a tratamentos médicos (terapia con diazóxido) e poden requirir extirpación de parte do páncreas. Os individuos con FHI-KATP autosómico dominante tenden a ter un tamaño apropiado para a súa idade xestacional ao nacer, e presentala á idade de aproximadamente un ano (vai de 2 días a 30 anos), e a responder á dieta e á terapia con diazóxido. Informouse de excepcións a estas dúas xeneralidades. A FHI-GCK, causada por mutacións en GCK, pode ser moito máis leve que a FHI-KATP; porén, algnhas persoas teñen unha hipoglicemia grave que non responde ao diazóxido. A FHI-HADH, causada por mutacións en HADH, adoita ser relativamente leve, aínda que tamén se informou de casos graves. Os individuos con FHI-HNF4A, causada por mutacións en HNF4A, nacen normalmente máis grandes do normal para a súa idade xestacional e teñen características leves que responden ao tratamento con diazóxido. A FHI-UCP2, causada por mutacións en UCP2, é unha causa rara de FH1 que responde ao diazóxido. A hiperamonemia/hiperinsulinismo (HA/HI) está asociada con hiperamonemia de leve a moderada e cunha hipoglicemia de comezo tardío relativamente leve; a maioría pero non todos os individuos afectados teñen mutacións en GLUD1.

 Diagnóstico/tests 

Aproximadamente o 45% dos individuos afectados teñen mutacións en ABCC8, que codifica a proteína SUR1, ou en KCNJ11, que codifica a proteína Kir6.2. Na poboación xudía asquenací, dúas mutacións ABCC8 fundadoras son responsables de aproximadamente o 97% dos hiperinsulinismos familiares (FHI). Outras mutacións ABCC8 fundadoras están presentes na poboación finesa (p. Val187Asp e p.Asp1506Lys). Mutacións en GLUD1 e HNF4A explican cada unha aproximadamente o 5% dos casos de individuos con FHI. Mutacións activadoras en GCK ou inactivadoras en HADH aparecen en menos do 1% dos individuos con FHI. Informouse de mutacións en UCP2 en só dúas familias ata agora. Aproximadamente o 40% dos individuos con FHI non teñen unha mutación identificable en calquera dos xenes coñecidos que se poida asociar á FHI.

 Tratamento 
Nunha diagnose inicial, a hipoglicemia corríxese con glicosa intravenosa para normalizar as concentracións de glicosa no plasma e previr danos cerebrais. O tratamento médico a longo prazo inclúe o uso de diazóxido, análogos da somatostatina, nifedipina, glicagón, IGF-I recombinante, glicocorticoides, hormona do crecemento humana, dietas ou combinacións destas terapias. En individuos nos cales o tratamento médico agresivo non consegue manter a concentración de glicosa sanguínea dentro de límites seguros, ou nos cales dita terapia non pode aplicarse con seguridade por longo tempo, pode considerarse facer unha extirpación de parte do páncreas.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Ligazóns externas 
  GeneReviews/NCBI/NIH/UW entry on Familial Hyperinsulinism



Categoría:Oxidorredutases