Punto de control do ciclo celular

Os puntos de control do ciclo celular (ou checkpoints do ciclo celular) son mecanismos de control do ciclo celular das células eucariotas que aseguran que este progrese adecuadamente. Cada punto de control serve como un posible punto de terminación situado en determinados momentos do ciclo celular, no cal se avalían as condicións da célula, e a progresión á seguinte fase do ciclo só ocorre cando as condicións son favorables. Hai moitos puntos de control no ciclo celular, pero os tres principais son: o punto de control G1, tamén coñecido como o Arranque ou punto de control de restrición ou punto de control maior; o punto de control G2/M; e a transición metafase-anafase, tamén coñecida como punto de control do fuso. A progresión a partir destes puntos de control está en gran medida determinada pola activación de quinases dependentes de ciclinas por subunidades proteicas reguladoras chamadas ciclinas, diferentes formas das cales prodúcense en cada etapa do ciclo celular para controlar eventos específicos que ocorren a continuación.

 Introdución 

Todos os organismos vivos son o produto de sucesivas roldas de divisións e crecemento celular desde as súas etapas iniciais. As células durante o proceso coñecido como ciclo celular duplican o seu contido e despois divídense en dúas. O propósito do ciclo celular é duplicar adecuadamente o ADN dos organismos e despois dividir a célula e o seu contido equitativamente entre as dúas células fillas resultantes. Nos eucariotas, o ciclo celular consta de catro grandes etapas: fase G1, durante a cal a célula é metabolicamente activa e crece continuamente; fase S, durante a cal ten lugar a replicación do ADN; fase G2, durante a cal o crecemento celular continúa e a célula sintetiza varias proteínas en preparación para a división; e a fase M (mitose), durante a cal os cromosomas duplicados (formados por cromátides irmás) sepáranse en dous núcleos fillos que aínda están na mesma célula, e finalmente a célula divídese en dúas (citocinese) orixinando as dúas células fillas cada unha cunha copia completa do ADN. Se comparamos o ciclo da célula procariota co da eucariota, o procariota (fisión binaria) é relativamente simple e rápido: o cromosoma replícase desde a orixe de replicación e a célula forma un septo de parede celular que divide a célula en dúas.

Como o ciclo celular eucariota é un proceso complexo, nos eucariotas evolucionou unha rede de proteínas reguladoras, coñecida como sistema de control do ciclo celular, que monitoriza e determina a progresión da célula polas sucesivas fases do ciclo. O sistema actúa como un temporizador ou reloxo, que establece un determinado lapso de tempo que a célula pasa en cada fase do ciclo, e ao mesmo tempo responde á información recibida dos procesos que controla. Os puntos de control ou checkpoints do ciclo celular teñen un importante papel no sistema de control ao detectaren os defectos que ocorren durante procesos esenciais como a replicación do ADN ou a segregación dos cromosomas, e inducen a parada do ciclo celular como resposta ata que os defectos sexan reparados. O principal mecanismo de acción dos puntos de control do ciclo celular é a regulación das actividades dunha familia de proteína quinase coñecida como quinases dependentes de ciclina (CDKs), que se unen a diferentes clases de proteínas reguladoras chamadas ciclinas, formándose así complexos específicos ciclina-CDK e activándose en diferentes fases do ciclo. Estes complexos, á súa vez, activan distintas dianas situadas augas abaixo para promover ou impedir a progresión do ciclo celular.

 Punto de control de G1 (punto de restrición) 

O punto de control de G1, tamén chamado punto de restrición nas células de mamíferos e punto de inicio ou arranque nos lévedos (start point), é o punto no cal a célula queda determinada para entrar no ciclo celular. A medida que a célula progresa ao longo da fase G1, dependendo das condicións internas e externas, pode facer tres cousas: prolongar o G1, entrar nun estado quiescente chamado G0,  ou avanzar no ciclo e superar o punto de restrición. A presenza de danos no ADN é o principal indicador para que a célula se "restrinxa" e non entre no ciclo celular. A decisión de iniciar unha nova rolda de división celular ocorre cando a célula activa a transcrición dependente de ciclina-CDK, que promove a entrada na fase S. Este punto de control asegura o proceso posterior.

Durante os momentos iniciais da fase G1, hai tres represores transcricionais, coñecidos como proteínas peto (pocket proteins), que se unen a factores de transcrición E2F. A familia de xenes E2F é un grupo de factores de transcrición que teñen como diana moitos xenes que son importantes para o control do ciclo celular, entre os que están os das ciclinas, CDKs, reguladores dos puntos de control e proteínas de reparación do ADN. Unha regulación incorrecta da familia E2F obsérvase frecuentemente en casos de cancro, o que é unha proba de que a familia E2F é esencial para a regulación estreita da replicación do ADN e a división. As tres proteínas peto implicadas son: retinoblastoma (Rb), p107 e p130, que se unen a factores de transcrición E2F para impedir a progresión alén do punto de control de G1.

A familia de xenes E2F comprende algunhas proteínas con mecanismos activadores e outras con mecanismos represores. A p107 e a p130 actúan como  correpresores para o E2F 4 e o E2F 5, que traballan reprimindo a transcrición de factores promocionadores do paso de G1 a S. A terceira proteína peto, a Rb, únese e reprime E2F 1, E2F 2 e E2F 3, que son os xenes das proteínas E2F con capacidades activadoras.

A retroalimentación positiva é esencial na regulación da progresión da fase G1 á S, e implica a fosforilación de Rb por un complexo proteico  ciclina/CDK. A Rb que perdeu un fosfato (ou Rb desfosforilada) regula a saída da fase G0 do ciclo celular e a diferenciación. Durante o inicio da fase G1, factores de crecemento e os danos no ADN son os sinais para o incremento dos niveis de ciclina D, que despois se une a Cdk4 e Cdk6 para formar o complexo ciclina D:Cdk4/6. Este complexo sábese que inactiva Rb por fosforilación. Porén, os detalles da fosforilación de Rb son bastante complexos e específicos comparados cos coñecementos previos que se tiñan do punto de control de G1. A ciclina D:Cdk4/6 coloca só un fosfato (monofosforila) Rb nun dos seus catorce sitios de fosforilación accesibles e únicos. Cada un desas catorce isoformas con monofosforilación específica ten unha preferencia de unión diferencial aos distintos membros da familia E2F, o que probablemente se engade á diversidade de procesos celulares que hai no corpo dos mamíferos.

E2F 4 e E2F 5 dependen de p107 e p130 para manter a súa localización nuclear. Porén, a ciclina D:Cdk 4/6 tamén fosforila p107 e p130, un proceso que as libera da súa unión a E2F 4 e 5 (e entón escapan ao citoplasma), e permite que E2F 1-3 se unan ao ADN e inicien a transcrición da ciclina E. As proteínas Rb manteñen o seu estado monofosforilado durante os momentos iniciais da fase G1, mentres que a ciclina E se acumula e une a Cdk2.

A ciclina E:Cdk2 desempeña un  papel importante adicional na fosforilación na transición de G1 a S. Concretamente, a ciclina E:Cdk2 promove un bucle de retroalimentación positiva que crea un interruptor de “todo ou nada”. En moitas redes de control xenético, as retroalimentacións positivas aseguran que as células non vaian para adiante e para atrás entre distintas fases do ciclo celular.  A ciclina E:Cdk2 realiza a fosforilación de Rb en todos os seus sitios de fosforilación, polo que se di que está “hiperfosforilada”, o cal orixina a completa inactivación de Rb. A hiperfosforilación de Rb considérase o punto de restrición de G1 final, despois do cal a célula xa non pode ir cara a atrás no ciclo celular. Neste momento, as proteínas E2F 1-3 únense ao ADN e transcriben a ciclina A e Cdc 6.

O Inhibidor da quinase dependente de ciclina 1B (CDKN1B), tamén chamado p27, únese á ciclina E:Cdk2 impedindo a súa activación por inhibición. Porén, a medida que a ciclina A se acumula e se une a Cdk2, ambos forman un complexo e inhiben p27. A quinase dependente de ciclina da fase G1 funciona xunto coa quinase dependente de ciclina da fase S etiquetando p27 para a súa degradación. Á súa vez, isto permite unha activación completa do complexo ciclina A:Cdk2, un complexo que fosforila E2F 1-3 iniciando a súa disociación dos sitios promotores do ADN. Isto permite que E2F 6-8 se unan ao ADN e inhiban a transcrición. O bucle de retroalimentación negativo usado para inhibir con éxito ao inhibidor p27 é outro proceso esencial utilizado polas células para asegurar o movemento monodireccional e que non se recúe a fases previas no ciclo celular.

Cando ocorren danos no ADN ou cando a célula detecta algúns defectos que necesiten que o ciclo celular se atrase ou deteña en G1, esta parada do ciclo pode producirse por varios mecanismos. A resposta rápida implica eventos de fosforilación que se inician coa quinase ATM (ataxia telanxiectasia mutada) ou con ATR (proteína relacionada con ataxia telanxiectasia e Rad3), que actúan como sensores, dependendo do tipo de danos. Estas quinases fosforilan e activan as quinases efectoras Chk2 e Chk1, respectivamente, que á súa vez fosforilan a fosfatase Cdc25A, marcándoa así para a ubiquitinación e degradación. A medida que Cdc25A activa o antes mencionado complexo ciclina E-CDK2 ao retirar os fosfatos inhibidores de CDK2, en ausencia de Cdc25A, a ciclina E-CDK2 permanece inactiva, e a célula permanece na fase G1.

Hai outra resposta que se inicia para manter a detención do ciclo, pola cal Chk2 ou Chk1 fosforilan p53, un supresor de tumores, e isto estabiliza p53 ao impedir que se una a Mdm2, unha ubiquitina ligase que inhibe p53 ao etiquetalo para a súa degradación. A p53 estable actúa despois como un activador transcricional de varios xenes diana, incluíndo o de p21, un inhibidor do paso de G1 a S que promove o complexo ciclina E-CDK2. Ademais, outro mecanismo polo cal se activa p21 é pola acumulación de p16 en resposta a danos no ADN. A p16 distorsiona os complexos ciclina D-CDK4, o que causa a liberación de p21 dos complexos, e isto leva á desfosforilación e activación de Rb, o cal permite que Rb se una a e inhiba E2F 1-3, mantendo así a célula sen pasar á fase S. Recentemente, algúns aspectos deste modelo foron postos en cuestión.

 Punto de control de G2 

miniatura|441x441px|A concentración de ciclina mitótica mostra histérese e biestabilidade en relación coa activación de Cdk1.
Despois da replicación do ADN na fase S, a célula experimenta unha fase de crecemento chamada G2. Durante este tempo, prodúcense as proteínas mitóticas necesarias e a célula queda unha vez mais suxeita a mecanismos reguladoros que aseguren que está nun estado axeitado para a súa entrada na fase mitótica proliferativa (M). Nesta transición de G2 a M interveñen múltiples puntos de control, cun factor común, a actividade da ciclina-Cdk.

Aínda que existen variacións nos complexos ciclina-Cdk requiridos entre os distintos organismos, a necesidade da actividade quinase está conservada e tipicamente orientada a ter un único acoplamento. Nos lévedos de fisión hai tres formas de ciclina mitótica, e seis no lévedo de xemación, aínda que a ciclina primaria utilizada é a ciclina B. A ciclina B servirá como referencia para a discusión da transición do punto de control G2/M.

De xeito similar á fase S, a G2 ten un punto de control de danos no ADN. A célula é examinada unha vez máis buscando sitios onde haxa danos no ADN ou replicación incompleta, e recrútanse as quinases ATR e ATM nos sitios onde hai danos. A activación de Chk1 e Chk2 e de p53 inducen a parada do ciclo celular e a detención da progresión cara á mitose. Un compoñente adicional na fase S, o complexo pre-replicativo, debe quedar inactivado por medio da fosforilación de ciclina B-Cdk1.

Conforme se avalían os puntos de control previos, a acumulación de proteínas G2 serve para activar a actividade de ciclina B-Cdk1 por múltiples mecanismos. A ciclina A-Cdk2 activa Cdc25, un activador de ciclina B-Cdk1, que despois desactiva o inhibidor de ciclina B-Cdk1, chamado Wee1. Isto ten como resultado o establecemento dun bucle de retroalimentación positiva, que incrementa significativamente a expresión da ciclina B e a activación de Cdk1. A medida que a célula progresa cara a G2 e chega á transición G2/M, a quinase Plk1 fosforila Wee1, o cal etiqueta Wee1 para a degradación por medio do complexo SCF ubiquitina ligase. Unha función adicional de Plk1 é activar Cdc25 por fosforilación. O efecto combinado da degradación de Wee1 e a activación de Cdc25 é a eliminación neta da fosforilación inhibitoria de cdc2, o cal activa cdc2. Plk1 actívase na transición G2/M polas proteínas Aurora A e Bora, que se acumulan durante a G2 e forman un complexo de activación. O complexo Plk1-Cdc2-cdc25 inicia despois un bucle de retroalimentación positivo que serve para activar máis Cdc2, e conxuntamente cun incremento nos niveis de ciclina B durante a G2, os complexos cdc2-ciclina B resultantes activan despois dianas de augas abaixo que promoven a entrada na mitose. A actividade de Cdk1 resultante tamén activa a expresión de Mem1-Fkh, un xene da transición G2/M. Cómpre un rápido incremento da actividade de ciclina B-Cdk1 porque o inicio da fase M é un evento de "todo ou nada" implicado na histérese. A histéres da actividade de Cdk1 por medio da ciclina B conduce á entrada na fase M ao estabilizar un limiar mínimo de concentración de ciclina B. Este ten un nivel maior que o mínimo necesario para a continuación da fase M despois da entrada, actuando de salvagarda do evento de "todo ou nada". Esta concentración de entrada increméntase máis no caso de haber unha replicación do ADN incompleta, engadindo outro mecanismo regulador ao punto de transición G2/M. A presenza da histérese permite que a entrada na fase M estea moi regulada en función da actividade da ciclina B-Cdk1.

O mecanismo polo cal se impide a entrada na mitose en resposta aos danos no ADN é similar ao do punto de control G1/S. Os danos no ADN desencadean a activación da antes mencionada vía ATM/ATR, na cal ATM/ATR fosforilan e activan as quinases do punto de control Chk1/Chk2. Chk1/2 fosforila cdc25, o cal, ademais de ser inhibido, é tamén secuestrado no citoplasma polas proteínas 14-3-3. As 14-3-3 están reguladas á alza pola p53, a cal é activada por Chk1 e ATM/ATR. A p53 tamén transactiva p21, e tanto p21 coma as 14-3-3 á súa vez inhiben os complexos ciclina B-cdc2 por fosforilación e o secuestro citoplásmico de cdc2. Ademais, a inactivación de cdc25 ten como resultado a súa incapacidade de desfosforilar e activar cdc2. Finalmente, outro mecanismo de resposta aos danos é por medio da regulación negativa de Plk1 por ATM/ATR, o cal á súa vez ten como resultado a estabilización de Wee1 e Myt1, os cales poden despois fosforilar e inhibir cdc2, mantendo así a célula detida na fase G2 ata que os danos se reparen.

 Transición G2-M en ovocitos de Xenopus 

Ao final da fase G2, a célula fai a transición á mitose, na cal o núcleo se vai dividir. A transición de G2 a M é drástica; hai un efecto de "todo ou nada" e a transición é irreversible. Isto é vantaxoso para a célula porque entrar na mitose é un paso crítico na vida dunha célula. Se non está completamente comprometida en facer a mitose, a célula atoparía diversos problemas cunha división parcial, e finalmente poderían acabar na morte celular.

En ovocitos de ra, o cadoiro de sinalización é inducido cando a hormona proxesterona se une a un receptor de membrana. Augas abaixo, actívase Mos. Despois, Mos fosforila MEK1, a cal fosforila MAPK. MAPK exerce dúas funcións: activar o complexo ciclina B-Cdk1 para iniciar a entrada na mitose e activar Mos. A activación de Mos xera un bucle de retroalimentación positivo e, por tanto, actúa como un “interruptor conmutador” (de dúas posicións) para crear a entrada de "todo ou nada" á mitose.
miniatura|Esquema do cadoiro de sinalización de MAPK.

Este bucle de retroalimentación foi atopado primeiramente ao observarse que as concentracións de MAPK-P (é dicir, MAPK fosforilada) aumentaban en resposta ao incremento dos niveis de proxesterona. A nivel celular, cada célula ou ben tiña completamente fosforilada MAPK ou non tiña MAPK fosforilada, o que confirma que actúa como un mecanismo de interruptor en cada célula. Atopouse tamén que bloquear a síntese da proteína Mos fai que as respostas de MAPK-P sexan máis graduadas, mostrando que a síntese da proteína Mos é necesaria para o carácter de "todo ou nada" da activación de MAPK.

 Biestabilidade 

Este proceso pode entenderse utilizando o concepto da biestabilidade. Usando o gráfico mostrado á dereita, a velocidade de síntese de Mos cambia conforme se vai engadindo máis proxesterona. En cada curva hai puntos fixos estables e inestables. Nos puntos fixos inestables, o sistema empurra cara a algún dos puntos fixos estables. Así, o sistema pode ou ben estar no estado de "acendido" ("on") ou no estado de "apagado" ("off"), pero non nun estado intermedio. Cando o nivel de proxesterona é suficientemente alto, a curva de Mos faise máis alta e finalmente intersecta a liña de degradación nun só punto, así que só hai un estado estable de "acendido", que indica a entrada na mitose.

A irreversibilidade que se observa no punto de transición da mitose procede de ter niveis suficientemente altos de proxesterona na célula. A niveis de proxesterona altos dabondo, o sistema é monoestable como resultado do bucle de retroalimentación positivo entre Mapk e Mos. O punto no cal o sistema cambia de biestable a monoestable denomínase bifurcación do nodo sela (saddle node bifurcation).

Por tanto, pódese entender a resposta de "todo ou nada" irreversible da transición mitótica cun modelo matemático dos reguladores moleculares como un sistema biestable que depende da existencia de retroalimentación positiva. O "estado de apagado" é aniquilado por un nivel suficientemente alto de proxesterona e unha vez que a célula consegue superar o estado de "apagado", entón queda bloqueado no estado de "acendido".

 A histérese e o modelo de Novak Tyson 

Con este modelo biestable pódese entender a transición mitótica como un proceso impulsado pola histérese. A histérese defínese como a dependencia do estado dun sistema da súa historia. O modelo de Novak Tyson é un modelo matemático da progresión do ciclo celular que predí que as transicións irreversibles de entrada e saída da mitose son impulsadas pola histérese. O modelo ten tres predicións básicas que deberían ser certas en extractos de ovocitos en ciclo cuxa progresión no ciclo celular depende da histérese, que son:

 A concentración de ciclina B necesaria para entrar na mitose é maior que a concentración necesaria para manter o extracto mitótico en mitose.
 O ADN non replicado eleva o nivel de ciclina necesario par a activación de Cdc2 e, por tanto, a entrada na mitose.
 Hai unha diminución na velocidade de activación de Cdc2 a concentracións de ciclina B xusto por riba do limiar de activación.

Sha et al fixeron experimentos en extractos de ovos de Xenopus laevis en 2003 para demostrar esta natureza histerética. Usando extractos en ciclo, observouse que o limiar de activación para a Δciclina B está entre 32 e 42 nM, mentres que o limiar de inactivación está entre 16 e 24 nM de Δciclina B. Por tanto, estes experimentos confirmaron a biestabilidade deste sistema e a importancia da histérese nesta transición do ciclo celular. A concentracións intermedias de ciclina B, son posibles tanto o estado de interfase coma o mitótico.

 Resposta ao estrés de replicación 

Como a entrada na mitose é un compromiso grande e custoso para a célula, é lóxico que haxa sistemas para impedir a entrada prematura nese proceso. Observouse que os erros nos pasos previos, como ter seccións non replicadas do ADN bloquea a progresión do ciclo celular. O modelo de Novak Tyson predí que isto ocorre elevando o nivel de ciclina B que cómpre para a entrada na mitose.

Sha et al. investigaron se era certo isto nos extractos de ovos de Xenopus. Utilizaron afidicolina (APH) para inhibir a ADN polimerase e impedir a replicación do ADN. Cando eran tratados con ciclina B na interfase, o limiar de activación incrementábase entre 80 e 100 nM, como predicía o modelo de Novak Tyson. Por tanto, estes experimentos confirman que o estrés creado polo ADN non  replicado na célula afecta o bucle de histérese e ten como resultado que teña que haber un limiar moito maior de ciclina B para entrar na mitose.

 Punto de control da metafase 

O punto de control do fuso mitótico está na metafase, na que os cromosomas deberían estar aliñados na placa metafásica e baixo tensión bipolar. A tensión creada polo seu enganche bipolar a microtúbulos é percibido pola célula e iso inicia a entrada na anafase. Para facelo, o mecanismo de percepción asegura que o complexo promotor da anafase (APC/C) xa non está inhibido, polo que agora pode degradar a ciclina B, que contén unha caixa D (D-box ou caixa de destrución), e degradar a securina. Esta última é unha proteína cuxa función é inhibir a separase, a cal á súa vez corta as cohesinas, o complexo proteico responsable da cohesión das cromátides irmás. Unha vez que esta proteína inhibitoria é degradada por ubiquitinación e a subseguinte proteólise, o encima separase causa despois a separación das cromátides irmás. Despois de que a célula se dividiu orixinando as dúas células fillas, a célula entra de novo na fase G1.

 Cancro 

O proceso de reparación do ADN e os puntos de control do ciclo celular foron asociados intimamente co cancro debido ás súas funcións de regular a estabilidade do xenoma e a progresión do ciclo celular, respectivamente. Os mecanismos moleculares precisos que conectan as disfuncións nestas vías e o comezo do desenvolvemento de determinados cancros non se comprenden de todo na maioría dos casos. A perda da proteína ATM precede o desenvolvemento dun linfoma probablemente debido a unha recombinación homóloga excesiva, que conduce a unha alta inestabilidade xenómica. A distorsión de Chk1 en ratos causa significativas desregulacións dos puntos de control do ciclo celular, unha acumulación de danos no ADN e un incremento da incidencia da tumoroxénese. Quizais o caso máis famoso é a herdanza dun só mutante dos xenes BRCA1 ou BRCA2 que predispón as mulleres aos cancros de mama e ováricos. O BRCA1 é necesario para as transicións a S e G2/M e está implicado na resposta celular aos danos no ADN. O BRCA2 crese que está implicado na recombinación homóloga e en regular o punto de control da fase S, e as mutacións e deficiencias no BRCA2 están fortemente ligadas á tumoroxénese.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Interruptores bioquímicos no ciclo celular
 Ciclo celular
 Punto de control de danos no ADN G2-M
 Punto de control posreplicación
 Punto de control da recombinación meiótica

Categoría:Ciclo celular