Desnaturalización (bioquímica)

A desnaturalizaciónDicionario de Bioloxía galego-castelán-inglés. Xunta de Galicia 2010. Páxina 58. BUSCatermos desnaturalización ou desnaturación é un proceso no cal unha proteína ou ácido nucleico perden as estruturas cuaternaria, terciaria e secundaria que presentan no seu estado nativo, por aplicación dalgún estrés externo ou presenza dun composto como un ácido ou base fortes, un sal inorgánico concentrado, un solvente orgánico (como alcohol ou cloroformo), axitación e radiación ou calor. Se as proteínas se desnaturalizan nunha célula viva isto orixina unha alteración da actividade celular e posiblemente a morte da célula. A desnaturalización da proteína é tamén unha consecuencia da morte celular. As proteínas desnaturalizadas poden mostrar unha gran variedade de características, desde un cambio conformacional e perda de solubilidade á agregación debido á exposición de grupos hidrófobos. As proteínas desnaturalizadas perden a súa estrutura tridimensional e, por tanto, non poden funcionar.

O pregamento das proteínas é esencial para que unha proteína globular ou unha proteína de membrana poidan facer o seu traballo correctamente; esta debe estar pregada adoptando a forma correcta para poder funcionar. Porén, as pontes de hidróxeno, que son moi importantes para o pregamento, son bastante febles e son doadamente afectados pola calor, acidez, variacións nas concentracións de sales e outros axentes estresantes que poden desnaturalizar a proteína. Esta é unha das razóns polas cales a homeostase é fisioloxicamente necesaria en moitas formas de vida.

Este concepto non está relacionado co alcohol desnaturalizado, que é alcohol que foi mesturado con aditivos para facelo inapropiado para o consumo humano. Algúns alimentos e bebidas "desnaturalízanse" desta maneira para utilizalos só para propósitos distintos da alimentación.

 Exemplos comúns 
miniatura|(Arriba) A proteína albumina da clara de ovo sofre a desnaturalización e perda de solubilidade cando se cociña o ovo. (Abaixo) Os clips proporcionan unha analoxía visual que axuda á conceptualización do proceso de desnaturalización.

Cando se cociña un alimento, algunhas das súas proteína quedan desnaturalizadas. A isto débese que nos ovos cociñados a clara se volva branca e dura e que a carne cociñada quede firme.

Un exemplo clásico de desnaturalización de proteínas é a transformación da clara dos ovos, que é principalmente ovoalbuminas en auga. Cando as claras están frescas acabadas de sacar do ovo son transparentes e líquidas. Ao cociñar estas claras inestables termicamente vólvense opacas, formando unha masa sólida interconectada. A mesma transformación pode efectuarse por desnaturalización química. Se vertemos claras de ovo nun matraz con acetona as claras vólvense translúcidas e sólidas. A capa superior que se forma no leite callado é outro exemplo común de proteína desnaturalizada. A comida chamada ceviche prepárase ao “cociñar” quimicamente (mariñar) peixe cru e mariscos en ácido cítrico sen calor."Ceviche: the new sushi,"  The Times.

 Desnaturalización das proteínas 
As proteínas desnaturalizadas poden mostrar moi diversas características, desde a perda de solubilidade á agregación de proteínas.
miniatura|As proteínas funcionais teñen catro niveis de organización estrutural: 1) Estrutura primaria: a estrutura linear da secuencia de aminoácidos da cadea polipeptídica. 2) Estrutura secundaria: orixinada polos enlaces ou pontes de hidróxeno entre os péptidos da cadea na hélice alfa ou folla beta. 3) Estrutura terciaria: estrutura tridimensional de hélices alfa e follas beta pregadas no espazo. 4) Estrutura cuaternaria: estrutura tridimensional formada por múltiples polipéptidos unidos e a forma en que se unen.
miniatura|Proceso de desnaturalización: 1) Proteína funcional mostrando a súa estrutura cuaternaria. 2) Cando se aplica calor, este altera os enlaces intermoleculares da proteína. 3) Desfaise o pregamento dos polipéptidos (cadeas de aminoácidos).

 Introdución 

As proteínas ou polipéptidos son polímeros de aminoácidos. As proteínas fabrícanse nos ribosomas, que "len" os codóns dun ARNm, que é unha copia complementaria do xene do ADN onde está codificada a proteína en cuestión ; o ribosoma ensambla a combinación de aminoácidos requirida na mesma secuencia dos codóns, proceso chamado tradución. Despois a proteína formada sofre modificacións postraducionais, nas cales, por exemplo, pódese cortar parte da secuencia ou pódense engadir átomos ou moléculas adicionais, como ións metálicos. Unha vez que estas modificacións están completas, a proteína empeza a sufrir un pregamento (ás veces espontaneamente e ás veces coa axuda de encimas), dobrándose e enroscándose sobre si mesma para que os elementos hidrófobos da proteína queden agochados na zona profunda da estrutura da proteína (lonxe do contacto coa auga circundante) e os elementos hidrófilos acaban quedando na parte externa. A forma final da proteína determina como esta interacciona co seu ambiente.

O pregamento de proteínas consiste nun equilibrio entre unha cantidade substancial de interaccións intramoleculares débiles nunha proteína (hidrofóbicas, electrostáticas e de forzas de van der Waals) e interaccións entre a proteína e o solvente. Como resultado, este proceso depende grandemente do estado do ambiente no que se encontra a proteína. Estas condicións ambientais inclúen entre outras a temperatura, salinidade, presión e os solventes implicados. En consecuencia, calquera exposición a estreses extremos (por exemplo, alcohol ou radiación, altas concentracións de sales inorgánicos, ácidos e bases fortes) poden distorsionar as interaccións da proteína e inevitablemente levan á súa desnaturalización.

Cando unha proteína se desnaturaliza, as estruturas secundaria e terciaria altéranse pero os enlaces peptídicos da estrutura primaria entre os aminoácidos quedan intactos. Como todos os niveis estruturais da proteína determinan a súa función, a proteína xa non pode realizar a súa función unha vez desnauralizada. Isto está en contraposición ás proteínas desestruturadas intrinsecamente, que non están pregadas dunha maneira determinada no seu estado nativo, pero aínda son funcionalmente activas e tenden a pregarse ao unirse á súa diana biolóxica.

 A desnaturalización nos distintos niveis da estrutura proteica 

 Na desnaturalización da estrutura cuaternaria as subunidades proteicas disócianse ou altérase a súa situación espacial.
 A desnaturalización da estrutura terciaria implica a distorsión de:
 Interaccións covalentes entre cadeas laterais de aminoácidos (como as pontes disulfuro entre grupos de cisteína).
 Interaccións non covalentes dipolo-dipolo entre cadeas laterais de aminoácidos polares (e o solvente que as rodea).
 Interaccións de van der Waals (dipolos inducidos) entre cadeas laterais de aminoácidos non polares.
 Na desnaturalización da estrutura secundaria, as proteínas perden todos os padróns repetidos regulares como as hélices alfa e as follas beta-pregadas e adoptan unha configuración aleatoria.
 A estrutura primaria da proteína, que é a secuencia de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, non se altera durante a desnaturalización.

 Perda de función 
A maioría dos substratos biolóxicos perden as súas funcións biolóxicas cando se desnaturalizan. Por exemplo, os encimas perden a súa actividade catalítica, debido a que os substratos xa non poden unirse ao sitio activo, e porque os residuos de aminoácidos implicados na estabilización do estado de transición dos substratos xa non están ben situados para poder facelo. O proceso de desnaturalización e a perda de actividade asociada poden medirse usando técnicas como a interferometría de polarización dual, dicroísmo circular, QCM-D e MP-SPR.

 Perda de actividade debida a metais pesados e metaloides 

Ao unirse ás proteínas, os metais pesados poden alterarlles a súa función e actividade. É importante sinalar que os metais pesados poden ser metais de transición e un selecto número de metaloides. Estes metais, ao interaccionaren con proteínas nativas pregadas, tenden a xogar un papel na obstrución da súa actividade biolóxica. Esta interferencia pode ser levada a cabo de diferentes xeitos. Estes metais pesados poden formar un complexo cos grupos da cadea lateral funcionais presentes nunha proteína ou formar enlaces con tiois libres. Os metais pesados tamén interveñen na oxidación das cadeas laterais de aminoácidos da proteína. Xunto con isto, cando as metaloproteínas interaccionan, os metais pesados poden desprenderse e pode haber substitucións de ións metálicos clave. Como resultado os metais pesados poden interferir co pregamento das proteínas, que pode afectar fortemente a actividade e a estabilidade da proteína.

 Reversibilidade e irreversibilidade 

En moitos casos a desnaturalización é reversible (as proteínas poden recuperar o seu estado nativo cando desaparece a influencia que causou a desnaturalización). Este proceso denomínase renaturalización ou renaturación. Isto levou á noción de que toda a información que cómpre para que as proteínas adopten o seu estado nativo estaba codificada na estrutura primaria da proteína, e, por tanto, no ADN que codificaba a proteína, o que se chama hipótese termodinámica de Anfinsen.

A desnaturalización pode tamén ser irreversible. Esta ireversibilidade é tipicamente cinética, non unha irreversibilidade termodinámica, xa que unha proteína pregada xeralmente ten unha enerxía libre menor que cando está sen pregar. Pola irreversibilidade cinética, o feito de que a proteína estea bloqueada nun mínimo local pode facer que nunca máis se volva a pregar e quede irreversiblemente desnaturalizada.

 Desnaturalización das proteínas debido ao pH 

A desnaturalización pode tamén ser causada por cambios no pH que poden afectar a química dos aminoácidos e dos seus residuos. Os grupos ionizables dos aminoácidos poden quedar ionizados cando acontecen cambios no pH. Un cambio de pH a condicións máis ácidas ou máis básicas pode inducir que a proteína perda o seu pregamento. O despregamento inducido por ácidos adoita ocorrer entre os pH 2 e 5; o despregamento inducido por bases xeralmente necesita un pH de 10 ou maior.

 Desnaturalización de ácidos nucleicos 

Os ácidos nucleicos (ARN e ADN) son polímeros de nucleótidos sintetizados por encimas polimerases durante a transcrición xenética ou a replicación do ADN (e en certos virus a replicación do ARN). Ao realizarse a síntese do esqueleto da molécula en dirección 5'-3' as bases nitroxenadas van establecendo entre elas enlaces ou pontes de hidróxeno, o que permite a formación de estruturas de orde superior. A desnaturalización dos ácidos nucleicos ocorre cando rompen os enlaces de hidróxeno entre os nucleótidos debido ás condicións do medio; o resultado é a separación das febras (ou de seccións de febras) que antes estaban unidas entre si (rompe o annealing). Por exemplo, a desnaturalización do ADN debido a temperaturas altas ten como resultado a distorsión dos emparellamentos de bases de Watson e Crick e a separación da hélice bicatenaria en dúas cadeas separadas. As febras dos ácidos nucleicos poden volver a formar os enlaces (re-annealling) cando se recuperan as condicións normais, pero se esta recuperación ocorre demasiado rapidamente, as febras de ácido nucleico poden volverse a formar imperfectamente con emparellamentos de bases incorrectos.

 Desnaturalización inducida bioloxicamente 
miniatura|A desnauralización do ADN ocorre cando os enlaces de hidróxeno entre os pares de bases de Watson e Crick se distorsionan.

As interaccións non covalentes entre febras antiparalelas no ADN poden romper para "abrir" a dobre hélice cando ocorren importantes mecanismos biolóxicos como a replicación do ADN, a transcrición, a reparación do ADN ou a unión de proteínas ao ADN. A área de ADN parcialmente separado coñécese como burbulla de desnaturalización, que pode ser definida máis especificamente como a abertura da dobre hélice do ADN pola separación coordinada dos pares de bases.

O primeiro modelo que intentou describir a temodinámica da burbulla de desnaturalización foi presentado en 1966 e chamado modelo Poland-Scheraga. Este modelo describe a desnaturalización das febras do ADN en función da temperatura. A medida que se incrementa a temperatura, os enlaces de hidróxeno entre os pares de bases de Watson e Crick están cada vez máis distorsionados e empezan a formarse os "bucles desnaturalizados".Lieu, Simon. "The Poland-Scheraga Model." (2015): 0-5. Massachusetts Institute of Technology, 14 de maio de 2015. Web. 25 de outubro de 2016. Porén, o modelo de Poland-Scheraga considérase hoxe demasiado elemental porque non consegue explicar as confusas implicacións xeradas pola secuencia do ADN, composición química, rixidez e torsión.Richard, C., and A. J. Guttmann. "Poland–Scheraga Models and the DNA Denaturation Transition." Journal of Statistical Physics 115.3/4 (2004): 925-47. Web.

Recentes estudos de termodinámica inferiron que o tempo de vida dunha burbulla de desnaturalización particular vai desde 1 microsegundo a 1 milisegundo. Esta información está baseada en escalas emporais establecidas da replicación do ADN e a transcrición. Estanse facendo investigacións biofísicas e bioquímicas para dilucidar máis claramente os detalles termodinámicos da burbulla de desnaturalización.

 Desnaturalización debida a axentes químicos 

miniatura|A formamida desnaturaliza o ADN ao romper os enlaces de hidróxeno entre os pares de bases de Watson e Crick. A liñas laranxas, azuis, verdes e púrpuras representan a adenina, timina, guanina e citosina, respectivamente. As tres liñas negras curtas entre as bases e as moléculas de formamida representan os enlaces de hidróxeno de nova formación.

Como na técnica da reacción en cadea da polimerase (PCR) é unha das aplicacións máis utilizadas en que se desexa que se produza a desnaturalización do ADN, o quentamento, usado nesta técnica, é o método de desnaturalización máis frecuente. Ademais da desnaturalización por calor, os ácidos nucleicos poden sufrir este proceso de desnaturalización se os expoñemos a diversos axentes químicos como a formamida, guanidina, salicilato de sodio, dimetil sulfóxido (DMSO), propilén glicol e urea. Estes axentes químicos desnaturalizantes rebaixan a temperatura de "fusión" (Tm) ao competiren con doantes e aceptores de enlaces de hidróxeno cos preexistentes pares de bases nitroxenadas. Algúns axentes mesmo teñen a capacidade de desnaturalización a temperaturas moderadas dunha habitación. Por exemplo, os axentes alcalinos (por exemplo o NaOH) desnaturalizan o ADN ao cambiar o pH do medio e retirar os protóns que contribúen á formación de enlaces de hidróxeno. Estes desnaturalizantes empregáronse para facer xeles para a electroforese en xel en gradiente desnaturalizante (DGGE), que favorecen a desnaturalización de ácidos nucleicos para eliminar a influencia da forma dos ácidos nucleicos sobre a súa mobilidade electroforética.

 A desnaturalización química como alternativa 

A actividade óptica (absorción e dispersión da luz) e as propiedades hidrodinámicas (difusión traducional, coeficientes de sedimentación e tempos de correlación rotacional) de ácidos nucleicos desnaturalizados pola formamida son similares aos dos ácidos nucleicos desnaturalizados por calor. Por tanto, dependendo do efecto desexado, a desnaturalización química do ADN pode proporcionar un procedemento xenético para desnaturalizar ácidos nucleicos alternativo á desnaturalización inducida pola calor. Os estudos que compararon diferentes métodos de desnaturalización como o quentamento, muíños de bólas de diferentes tamaños de bólas, sonificación de sondas ultrasónicas e desnaturalización química mostran que a desnaturalización química pode proporcionar unha desnaturalización máis rápida comparada con outros métodos de desnaturalización de tipo físico descritos. En particular, en casos onde se desexa unha desnaturalización rápida, os axentes de desnaturalización química poden proporcionar unha alternativa ideal ao quentamento. Por exemplo, as febras de ADN desnaturalizadas con axentes alcalinos como o hidróxido de sodio (NaOH) renaturalízanse en canto se engade tampón fosfato.

 Desnaturalización debida ao aire 

Pequenas moléculas de átomos electronegativos como as dos gases nitróxeno e oxíxeno, que son os principais compoñentes do aire, teñen un impacto significativo sobre a capacidade das moléculas que os rodean de participar na formación de enlaces de hidróxeno. Estas moléculas compiten cos aceptores de enlaces de hidróxeno que os rodean polos doantes de enlaces de hidróxeno, actuando así como "rompedores de enlace de hidróxeno" e debilitan as interaccións entre as moléculas que as rodean no seu ambiente. As febras antiparalelas da dobre hélice do ADN están unidas non covalentemente por medio de enlaces d hidróxeno entre pares de bases de Watson e Crick; o nitróxeno e o oxíxeno manteñen, por tanto, o potencial de debilitar a integridade dun ADN cando este se expón ao aire. Como resultado, cómpre menos forza para separar as febras de ADN expostas ao aire e exemplificar menores temperaturas de "fusión".

 Aplicacións 

Moitas técnicas de laboratorio dependen da capacidade das febras dos ácidos nucleicos de se separar. Utilizan a desnaturalización dos ácidos os seguintes métodos:
 PCR
 Southern blot
 Northern blot
 Secuenciación do ADN

 Desnaturalizantes 

 Proteínas desnaturalizantes 

 Ácidos 
Entre os desnaturalizantes de proteínas ácidos están os seguintes:
 Ácido acético
 Ácido tricloroacético ao 12% en auga
 Ácido sulfosalicílico

 Bases 
As bases funcionan de modo similar aos ácidos na desnaturalización. Entre elas está:
 Bicarbonato de sodio

 Solventes 
Moitos disolventes son desnaturalizantes, como:
 Etanol Theodore T. Herskovits, Barbara Gadegbeku e Helen Jaillet.Denaturation of Proteins. I. DENATURATION BY THE ALCOHOLS AND GLYCOLS”. Department of Chemistry, Fordham University, New York, New York 10458. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 
vol. 245, No. 10, Número do 25 de maio, pp. 2588-2598, 1970. U.S.A.

 Reaxentes que establecen enlaces cruzados 
Entre estes axentes para proteínas están:
 FormaldehidoJ T Mason 1, T J O'Leary. Effects of formaldehyde fixation on protein secondary structure: a calorimetric and infrared spectroscopic investigation. J Histochem Cytochem. . 1991 Feb;39(2):225-9. doi: 10.1177/39.2.1987266. PMID 1987266 
 Glutaraldehido

 Axentes caotrópicos 
Entre eles están os seguintes:
 Urea 6 – 8 mol/lAtanu Das and Chaitali Mukhopadhyay. Urea-Mediated Protein Denaturation: A Consensus View. J. Phys. Chem. B 2009, 113, 38, 12816–12824. 26 de agosto de 2009. 
 Cloruro de guanidinio 6 mol/l
 Perclorato de litio 4,5 mol/l
 Dodecilsulfato sódico (SDS)

 Redutores de pontes disulfuro 
Os axentes que rompen pontes disulfuro por redución inclúen:Paul T. Wingfield. Use of Protein Folding Reagents. Curr Protoc Protein Sci. Manuscrito do autor dispoñible en PMC 5 de abril de 2016. Publicado na súa forma final como: Curr Protoc Protein Sci. 2001 May; APPENDIX 3: Appendix–3A. doi: 10.1002/0471140864.psa03as00. PMCID: PMC4821428. NIHMSID: NIHMS773187. PMID 18429069.
 2-Mercaptoetanol
 Ditiotreitol
 TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina)

 Axentes reactivos quimicamente 
Axentes como o peróxido de hidróxeno, cloro elemental, ácido hipocloroso, bromo, auga de bromo, iodo, ácido nítrico e ácidos oxidantes e ozono reaccionan con residuos sensibles das proteínas como os sulfuro/tiol, e os aneis aromáticos activados (fenilalanina) causando danos nas proteínas e facéndoas non funcionais.

 Outros 
 Axitación mecánica
 Ácido pícrico
 Radiación
 Temperatura

 Desnaturalizantes de ácidos nucleicos 

 Químicos 
Entre os desnaturalizantes ácidos de ácidos nucleicos están:
 Ácido acético
 HCl
 Ácido nítrico 
Desnaturalizantes básicos utilizados como:
 NaOH
Outros desnaturalizantes de ácidos nucleicos son:
 DMSO
 Formamida
 Guanidina
 Salicilato de sodio
 Propilén glicol
 Urea

 Físicos 
 Temperatura (desnaturalización térmica)
 Muíño de bólas
 Sonicación de sonda ultrasónica
 Radiación

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Alcohol desnaturalizante
 Fixación (histoloxía)
 Pregamento das proteínas
 Pelota aleatoria (random coil)

 Ligazóns externas 
 McGraw-Hill Online Learning Center — Animación: Desnaturalización das proteínas

Categoría:Estrutura das proteínas
Categoría:Ácidos nucleicos