Alcohol deshidroxenase

As alcohol deshidroxenases (ADH) () son un grupo de encimas deshidroxenases que están presentes en moitos organismos e facilitan a interconversión entre alcohois e aldehidos ou cetonas coa redución de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NAD+) a NADH. Nos humanos e moitos outros animais serven para degradar os alcohois a varios metabolitos que doutro modo serían tóxicos, e tamén participan na xeración de aldehidos ou cetonas útiles, ou grupos alcohol durante as biosínteses de varios metabolitos. En lévedos, plantas e moitas bacterias algunhas alcohol deshidroxenases catalizan a reacción oposta como parte das súas fermentacións para asegurar unha subministración constante de NAD+, polo cal producen alcohol, como ocorre na fermentación alcohólica utilizada para producir bebidas alcohólicas.

 Evolución 

Evidencias xenéticas de comparación de múltiples organismos mostraron que unha formaldehido deshidroxenase dependente de glutatión, idéntica á alcohol deshidroxenase de clase III (ADH-3/ADH5), podería ser o encima ancestral de toda a familia da ADH. bastante cedo na evolución fíxose importante ter un método para eliminar o formaldehido endóxeno e exóxeno e esta capacidade conservou a ADH-3 ancestral nos xenomas ao longo do tempo. A duplicación xénica da ADH-3, seguida por unha serie de mutacións, conduciu á evolución das outras ADHs.

A capacidade de producir etanol a partir de azucres (que é a base da produción das bebidas alcohólicas) crese que evolucionou primeiramente en lévedos. Aínda que esta característica non é adaptativa desde un punto de vista puramente enerxético, os lévedos, ao produciren alcohol en tan altas concentracións que eran tóxicas para outros organismos, podían eliminar a súa competición. Ademais, como as froitas podres conteñen máis dun 4% de etanol, os animais que comen froitas necesitaban un sistema para metabolizar ese alcohol exóxeno. Isto pénsase que explica a conservación de ADH activas co etanol en especies distintas dos lévedos, aínda que a ADH-3 tamén ten un papel importante na sinalización por óxido nítrico.

Nos humanos, a secuenciación do xene da ADH1B (que codifica unha alcohol deshidroxenase) mostrou que hai varias variantes funcionais. Nunha, hai un polimorfismo dun único nucleótido (SNP) que determina a presenza dun residuo de histidina (His) ou arxinina (Arg) na posición 47 do polipéptido maduro. Na variante con histidina, o encima é moito máis efectivo na conversión antes mencionada. Porén, o encima responsable da conversión do acetaldehido a acetato, non se ve afectado, o que fai que haxa diferentes velocidades de catálise do substrato e causa a acumulación de acetaldehido tóxico, causando danos. Isto proporciona algunha protección contra o consumo excesivo de alcohol e a dependencia do alcohol (alcoholismo). Varios haplotipos orixinados por esta mutación están máis concentrados en rexións do lese da  China, unha rexión coñecida polas súas baixas tolerancia e dependencia ao alcohol.

Realizouse un estudo para encontrar unha posible correlación entre a distribución alélica e o alcoholismo, e o resultado indica que esa a distribución alélica orixinouse á vez que o cultivo de arroz na rexión hai entre 12000 e 6000 anos. En rexións onde se cultivaba arroz, o arroz era fermentado orixinando etanol. Isto levou a especular que o aumento da dispoñibilidade de alcohol orixinou o abuso do consumo desa substancia e o alcoholismo, o que tivo como resultado unha menor fitness reprodutora. Nas persoas coa variante do alelo con His diminuían os casos de dependencia e abuso. A hipótese propón que aqueles individuos coa variante do encima con histidina tiñan un éxito reprodutivo diferencial e o alelo correspondente foi transmitido dunha xeración a outra. A evolución darwinista clásica actuaría para seleccionar contra a forma prexudicial do encima (a variante con arxinina) debido á diminución do éxito reprodutivo dos individuos que portan o alelo. O resultado sería unha maior frecuencia do alelo responsable desta variante do encima con His en rexións que estiveran baixo presión selectiva por máis longo tempo. A distribución e fecuencia da variante con histidina segue a expansión do cultivo de arroz en rexións do interior de Asia, e hai maiores frecuencias da variante con histidina en rexións nas que se leva cultivando aroz desde hai máis tempo. A distribución xeográfica dos alelos parece, por tanto, ser o resultado da selección natural contra os individuos con menor éxito reprodutivo, concretamente aqueles que portaban o alelo da variante con arxinina e eran máis susceptibles ao alcoholismo. Porén, a persistencia da variante con arxinina noutras poboacións indica que o efecto podería non ser moi forte.

 Descubrimento 
miniatura|LADH de cabalo (alcohol deshidroxenase hepática)

A primeira alcohol deshidroxenase (ADH) que se illou purificouse en 1937 a partir de Saccharomyces cerevisiae (o lévedo de panadería). Moitos aspectos do mecanismo catalítico do encima ADH hepático de cabalo foron investigados por Hugo Theorell e colegas. A ADH foi tamén un dos primeiros encimas oligoméricos dos que se obtivo a súa secuencia de aminoácidos e se determinou a súa estrutura tridimensional.

A inicios da década de 1960, descubriuse tamén nas moscas Drosophila.

 Propiedades 

As alcohol deshidroxenases comprenden un grupo de varios isocimas que catalizan a oxidación de alcohois primarios ou secundarios a aldehidos e cetonas, respectivamente, e tamén poden catalizar a reacción inversa. En mamíferos esta é unha reacción redox (redución/oxidación) na que intervén o coencima dinucleótido de nicotinamida e adenina (NAD+).

 Oxidación do alcohol 

 Mecanismo de acción en humanos 

 Pasos 
 Unión do coencima NAD+.
 Unión do substrato alcohol por coordinación co zinc do encima.
 Desprotonación da His-51.
 Desprotonación da nicotinamida ribosa.
 Desprotonación da Thr-48.
 Desprotonación do alcohol.
 Transferencia do híbrido desde o ión alcóxido ao NAD+, orixinando NADH e un aldehido (ou cetona) unidos ao zinc.
 Liberación do produto aldehido.

O mecanismo en lévedos e bacterias é o inverso desta reacción. Estes pasos están apoiados por estudos cinéticos.

 Subunidades implicadas 

O substrato está coordinado ao zinc e este encima ten dous átomos de zinc por subunidade. Un átomo de Zn está no sitio activo, implicado na catálise. No sitio activo, os ligandos para o Zn son Cys-46, Cys-174, His-67 e unha molécula de auga. A outra subunidade está implicada na estrutura do encima e ten outro Zn. Neste mecanismo, o híbrido do alcohol vai ao NAD+. As estruturas cristalinas indican que a His-51 desprotona a nicotinamida ribosa, a cal desprotona a Ser-48. Finalmente, a Ser-48 desprotona o alcohol, orixinando un aldehido. Desde unha perspectiva do mecanismo, se o encima engade o híbrido á cara Re (ver regras de prioridade de Cahn-Ingold-Prelog) do NAD+, o hidróxeno resultante incorpórase a posicións pro-R. Os encimas que engaden un híbrido á cara Re son denominados deshidroxenases de clase A.

 Sitio activo 
miniatura|O sitio activo da alcohol deshidroxenase.

O sitio activo da ADH1 humana () consta dun átomo de zinc, a His-67, Cys-174, Cys-46, Thr-48, His-51, Ile-269, Val-292, Ala-317 e Phe-319. Na isoforma comunmente estudada do fígado de cabalo, a Thr-48 é unha Ser, e a Leu-319 é unha Phe. O zinc coordina o substrato (alcohol). O zinc está coordinado pola Cys-46, Cys-174 e His-67. Por outra parte, a Leu-319, Ala-317, His-51, Ile-269 e Val-292 estabilizan o NAD+ ao formaren enlaces de hidróxeno. A His-51 e a Ile-269 forman enlaces de hidróxeno cos alcohois na nicotinamida ribosa. A Phe-319, Ala-317 e Val-292 forman enlaces de hidróxeno coa amida no NAD+.

 Sitio estrutural do zinc 

miniatura|O motivo estrutural de unión ao zinc nunha alcohol deshidroxenase dunha simulación de dinámica molecular (MD).
As alcohol deshidroxenases de mamíferos tamén teñen un sitio estrutural do zinc. Este ión Zn xoga un papel estrutural e é crucial para a estabilidade da proteína. As estruturas dos sitios do zinc estrutural e catalítico na alcohol deshidroxenáse hepática de cabalo (HLADH) reveladas polas estruturas cristalográficas foron estudadas computacionalmente con química cuántica e tamén con métodos de dinámica molecular clásicos. O sitio do Zn estrutural está composto por catro ligandos cisteína moi xuntos (Cys97, Cys100, Cys103 e Cys111 na secuencia de aminoácidos) situados formando un tetraedro case simétrico arredor do ión Zn. Un estudo recente mostrou que a interacción entre o zinc e a cisteína está gobernada principalmente por unha contribución electrostática cunha contribución covalente adicional ao enlace.

 Tipos 
 Humanos 
Nos humanos a ADH existe en moitas formas como dímero e está codificada por polo menos sete xenes diferentes (e orixínase polo menos seis encimas ao combinar os polipéptidos e formar heterodímeros). Hai cinco clases de alcohol deshidroxenase (I-V), pero as formas hepáticas que son as usadas principalmente en humanos son da clase I. A clase I consta das subunidades α, β e γ, que están codificadas nos xenes ADH1A, ADH1B e ADH1C. O encima está presente en altos niveis no fígado e no recubrimento interno do estómago. Cataliza a oxidación do etanol a acetaldehido (etanal):

CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+

Isto permite o consumo de bebidas alcohólicas, pero a súa función evolutiva é probablemente a degradación dos alcohois contidos de forma natural en alimentos ou producidos por bacterias no tracto dixestivo.

Outro propósito evolutivo pode ser o metabolismo do alcohol endóxeno da vitamina A (retinol), que xera a hormona ácido retinoico, aínda que esa función aquí pode ser principalmente a eliminación dos niveis tóxicos de retinol.

A alcohol deshidroxenase está tamén implicada na toxicidade doutros tipos de alcohol: Por exemplo, oxida o metanol para producir formaldehido e etilén glicol para render finalmente os ácidos glicólico e oxálico. Os humanos teñen polo menos seis alcohol deshidroxenases lixeiramente diferentes. Todas elas son dímeros (é dicir, constan de dous polipéptidos), e cada dímero ten dous ións zinc, Zn2+. Un destes ións é esencial para o funcionamento do encima: está localizado no sitio catalítico e sostén o grupo hidroxilo do alcohol no seu debido lugar.

A actividade da alcohol deshidroxenase varía entre homes e mulleres, entre mozos e vellos e entre poboacións de diferentes áreas do mundo. Por exemplo, as mulleres xoves non poden procesar o alcohol coa mesma rapidez que os homes xoves porque non expresan a alcohol deshidroxenase a un nivel tan alto, aínda que na mediana idade ocorre totalmente o contrario. O nivel de actividade pode non depender só do nivel de expresión senón tamén da diversidade de alelos entre a poboación.

Os xenes humanos que codifican as alcohol deshidroxenases das clases II, III, IV e V son ADH4, ADH5, ADH7 e ADH6, respectivaqmente.

 Lévedos e bacterias 

A diferenza dos humanos, os lévedos e bacterias (excepto as bacterias do ácido láctico e E. coli en certas condicións) non fermentan a glicosa a lactato. No seu lugar, fermentan a glicosa a etanol e  (fermentación alcohólica). Velaquí a reacción gloobal:

 Glicosa + 2 ADP + 2 Pi → 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O

miniatura|esquerda|Alcohol deshidroxenase
En lévedos e moitas bacterias, a alcohol deshidroxenase desempeña unha importante función na fermentación: o piruvato resultante da glicólise convértese en acetaldehido e dióxido de carbono, e o acetaldehido é despois reducido a etanol (alcohol etílico) por unha alcohol deshidroxenase chamada ADH1. O propósito deste último paso é a rexeneración do NAD+, para que a ruta da glicólise xeradora de enerxía poida continuar. Os humanos aproveitan este proceso para producir bebidas alcohólicas, deixando que os lévedos fermenten diversos froitos ou grans. Os lévedos poden producir e despois consumir o seu propio alcohol (véxase máis abaixo).

A principal alcohol deshidroxenase dos lévedos é máis grande que a humana, e consta de catro subunidades en vez de dúas. Tamén contén zinc no seu sitio catalítico. Xunto coa alcohol deshidroxenase que contén zinc de animais e humanos, estes encimas de lévedos e moitas bacterias forman a familia das alcohol deshidroxenases de "cadea longa".

O lévedo de panadería Saccharomyces cerevisiae tamén ten outra alcohol deshidroxenase, ADH2, que evolucionou a partir dunha versión duplicada do cromosoma que contén o xene ADH1. Os lévedos utilizan a ADH2 para converter etanol de novo en acetaldehido, e exprésase só cando a concentración de azucre é baixa. Grazas a teren estes dous encimas (ADH1 e ADH2) os lévedos poden producor alcohol cando abunda o azucre (e este alcohol mata os microbios competidores) e despois continuar oxidando ese alcohol cando xa non hai azucre nin competidores.

 Plantas 
En plantas, a ADH cataliza a mesma reacción que en lévedos e bacterias para asegurar unha subministración constante de NAD+. O millo ten dúas versións do encima, a ADH1 e a ADH2; Arabidopsis thaliana ten só un xene de ADH. A estrutura da ADH de Arabidopsis está conservada nun 47% en relación coa ADH hepática de cabalo. Porén, os residuos importantes estrutural e funcionalmente, como os sete residuos que proprocionan ligandos para os átomos de zinc catalíticos e non catalíticos, están conservados, o que suxire que estes encimas teñen unha estrutura similar. A ADH exprésase constitutivamente a baixos niveis nas raíces de plantas novas que crecen en ágar. Se as raíces carecen de oxíxeno, a expresión do xene ADH increméntase significativamente. A súa expresión tamén aumenta en resposta á deshidratación, ás baixas temperaturas e ao ácido abscísico, e desempeña un importante papel na maduración da froita, desenvolvemento das plantiñas xerminadas e no desenvolvemento do pole. As diferenzas na secuencia de ADH en diferentes especies foron utilizadas para crear filoxenias que mostren a proximidade ou non de diferentes especies de plantas. O ADH é un xene ideal para estes estudos porque ten un tamaño conveniente (2–3 kb de lonxitude cunha secuencia codificante de ≈1000 nucleótidos) e un número baixo de copias.

 Con ferro 

Unha terceira familia de alcohol deshidroxenases, non relacionadas coas dúas anteriores, é a das que conteñen ferro. Aparecen en bacterias e  fungos. Membros da familia das alcohol deshidroxenases que conteñen ferro son:
Alcohol deshidroxenase 4 de Saccharomyces cerevisiae (xene ADH4)
Alcohol deshidroxenase 2 de Zymomonas mobilis (xene adhB)
 Propanodiol oxidorredutase de Escherichia coli  (xene fucO), un encima implicado no metabolismo da fucosa e que tamén parece conter ións de ferro ferroso.
 Butanol deshidroxenases dependentes de NADPH e NADH de Clostridium acetobutylicum  (xenes adh1, bdhA e bdhB), encimas que usan butanol e etanol como substratos.
 adhE de E. coli, un encima dependente do ferro que  ten tres tipos de actividades: alcohol deshidroxenase, acetaldehido deshidroxenase (acetilante)  e piruvato-formiato-liase desactivase.
Glicerol deshidroxenase bacteriana  (xene gldA ou dhaD).
 4-Hidroxibutirato deshidroxenase dependente de NAD de Clostridium kluyveri (4hbd) 
 1,3-Propanodiol deshidroxenase de Citrobacter freundii e Klebsiella pneumoniae  (xene dhaT)
 Metanol deshidroxenase dependente de NAD de Bacillus methanolicus 
Proteína eutG para a utilización da etanolamina de E. coli e Salmonella typhimurium.
Proteína hipotética yiaY de E. coli.

 Outros tipos 
Unha clase adicional de alcohol deshidroxenases pertence aos quinoencimas e require cofactores quinoides (por exemplo, pirroloquinolina  quinona, PQQ) como aceptores de electróns unidos ao encima. Un exemplo típico deste tipo de encima é a metanol deshidroxenase das bacterias metilotróficas.

 Aplicacións 

En biotransformación, as alcohol deshidroxenases utilízanse a miúdo para a síntese de estereoisómeros enantiomericamente puros de alcohois quirais. Con frecuencia, pode conseguirse unha alta quimio- e enantioselectividade. Un exemplo é a alcohol deshidroxenase de Lactobacillus brevis (LbADH), que se describe como un versátil biocatalizador. A alta quimioespecificidade foi confirmada tamén no caso de substratos que presentan dous sitios redox potenciais. Por exemplo o cinnamaldehido presenta tanto dobres enlaces alifáticos coma a función aldehido. A diferenza dos catalizadores convencionais, as alcohol deshidroxenases poden actuar selectivamente só neste último, rendendo exclusivamente cinnamil alcohol.

En células ou pilas de combustible, as alcohol deshidroxenases poden utilizarse para catalizar a degradación do combustible para unha pila de combustible de etanol. Os científicos da Universidade de Saint Louis utilizaron a alcohol deshidroxenase sostida con carbono con poli(verde de metileno) como ánodo, cunha membrana Nafion, para obter uns 50 μA/cm2.

En 1949, E. Racker definiu o concepto de "unidade de actividade de alcohol deshidroxenase" como a cantidade de actividade deste encima que causa un cambio na densidade óptica de 0,001 por minuto baixo condicións estándar de ensaio.E. Racker
. Aldehyde dehydrogenase, a diphosphopyridine nucleotide-linked enzyme. (From the Department of Microbiology, New York University College of Medicine, New York. J. Biol. Chem. 1949, 177:883-892.  Recentemente, a definición internacional de unidade encimática (E.U.) fíxose máis común: unha unidade de alcohol deshidroxenase é a que converte 1,0 μmol de etanol en acetaldehido por minuto a pH 8,8 a 25 °C.

 Importancia clínica 

 Alcoholismo 
Fixéronse estudos que mostraron que as variacións na ADH que inflúen no metabolismo do etanol teñen un efecto sobre o risco de dependencia do alcohol. O efecto máis forte débese a variacións na ADH1B que incrementan a velocidade á que o alcohol se converte en acetaldehido. Unha de ditas variantes é máis común en individuos do leste de Asia e de Oriente Medio, outra é máis común en individuos de África. Ambas as variantes reducen o risco de alcoholismo, pero os individuos poden chegar a ser alcóholicos malia todo. Detectáronse provisionalmente algúns outros xenes que poderían estar asociados ao alcoholismo e considérase que hai moitos máis que aínda non se atoparon.

 Dependencia de drogas 

A dependencia das drogas é outro problema asociado coa ADH, que os investigadores pensan que podería esar ligada ao alcoholismo. Un estudo suxire que a dependencia das drogas está asociada a sete xenes de ADH, pero cómpre facer máis investigacións. A dependencia do alcohol e doutras drogas poden compartir algúns factores de risco, pero como a dependencia do alcohol adoita ser comórbida coa dependencia doutras drogas, a asociación da ADH coa dependencia doutras drogas pode non ser causal.

 Envelenamento 
O Fomepizole é un fármaco que inhibe competitivamente a alcohol deshidroxenase que pode utilizarse en casos de toxicidade causada por metanolInternational Programme on Chemical Safety (IPCS): Methanol (PIM 335), , retrieved on 1 March 2008 ou etilén glicol. Impide a conversión do metanol ou etilén glicol nos seus metabolitos tóxicos (como o ácido fórmico, formaldehido ou glicolato). O mesmo efecto conséguese tamén ás veces co etanol, de novo por inhibición competitiva da ADH.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Alcohol deshidroxenase (NAD(P)+)
 Aldehido deshidroxenase
 Oxidorredutase
 Contido de alcohol no sangue para taxas metabólicas

 Ligazóns externas 

 PDBsum ten ligazóns a estruturas tridimensionais de varias alcohol deshidroxenases contidas no Protein Data Bank
 ExPASy con ligazóns a secuencias de alcohol deshidroxenases en Swiss-Prot, para buscar literatura en Medline sobre o encima e entradas a outras bases de datos.
 PDBe-KB información da estrutura en PDB para a alcohol deshidroxenase 1A.
 PDBe-KB información da estrutura en PDB para a alcohol deshidroxenase 1B.
 PDBe-KB información da estrutura en PDB para a alcohol deshidroxenase 1C.
 PDBe-KB información da estrutura en PDB para a alcohol deshidroxenase 4.
 PDBe-KB información da estrutura en PDB para a alcohol deshidroxenase clase 3.

Categoría:Familias de proteínas
Categoría:Oxidorredutases