Cromatografía en capa fina

miniatura|Imaxe que mostra unha cromatografía de capa fina de tres estándares (orto-, meta- e para-isómeros) e unha mostra
miniatura|Placa de cromatografía en capa fina fluorescente baixo luz UV
A cromatografía en capa fina ou CCF (ou TLC polas súas siglas en inglés de thin-layer chromatography) é unha técnica de cromatografía usada para separar mesturas non volátiles. A cromatografía en capa fina realízase nunha lámina de cristal, plástico ou folla de aluminio, que está cuberta cunha fina capa de material adsorbente, xeralmente xel de sílice, óxido de aluminio (alúmina) ou celulosa. Esta capa de adsorbente coñécese como fase estacionaria.

Despois de que se aplica a mostra na placa, un solvente ou mestura solvente (coñecida como fase móbil) avanza pola placa por acción capilar. Conséquese a separación porque os diferentes analitos ascenden pola placa de cromatografía en capa fina a diferentes velocidades. A fase móbil ten propiedades diferentes que a fase estacionaria. Por exemplo, con xel de sílice, que é unha substancia moi polar, utilízanse fases móbiles non polares como o heptano. A fase móbil pode ser unha mestura, o que permite aos químicos afinar as súas propiedades.

Despois do experimento, visualízanse as manchas, o que adoita facerse simplemente proxectando raios de luz ultravioleta sobre a lámina; as láminas son tratadas cun fósforo, e aparecen na placa manchas escuras onde os compostos separados absorben a luz que doutro modo impactaría sobre esa determinada área da placa e produciría fluorescencia. Os procesos químicos poden tamén utilizarse para visualizar as manchas; o anisaldehido, por exemplo, forma adutos coloreados con moitos compostos e o ácido sulfúrico queima a maioría dos compostos orgánicos, deixando unha mancha escura na lámina.

Para cuantificar os resultados o que se fai é que a distancia á que viaxa a substancia cosiderda se divide pola distancia total á que viaxa a fase móbil. (Á fase móbil non se lle debe permitir alcanzar o final da fase estacionaria.) Esta proporción denomínase factor de retención (Rf). En xeral, unha substancia cuxa estrutura se parece á da fase estacionaria terá un Rf baixo, mentres que outra que teña estrutura similar á da fase móbil terá un factor de retención alto. Os factores de retención son característicos, pero cambian dependendo das condicións exactas das fases móbil e estacionaria. Por esta razón, os químicos xeralmente aplican unha mostra dun composto coñecido á lámina antes de poñer a funcionar o experimento.

A cromatografía de capa fina pode utilizarse para monitorizar o progreso dunha reacción, identificar compostos presentes nunha mestura dada e determinar a pureza dunha substancia. Exemplos específicos destas aplicacións son: analizar ceramidas e ácidos graxos, detección de pesticidas ou insecticidas nos alimentos e a auga, analizar a composición de tinturas de fibras en ciencia forense, ensaiar a pureza radioquímica de radiofármacos, ou identificación de plantas mecidinais e os seus constituíntes. 

Poden realizarse varias melloras no método orixinal para automatizar os diferentes pasos, ou incrementar a resolución alcanada cunha cromatografía en capa fina ou para permitir facer análises cuantitativos máis exactos. Este método denomínase cromatografía en capa fina de alto rendemento (HPTLC polas súas siglas en inglés de high-performance TLC), e tipicamente usa capas máis finas de fase esacionaria e volumes de mostra menores, o que reduce a perda de resolución debida á difusión.

 Preparación da placa 

Disponse comercialmente de placas de cromatografía en capa fina, con tamaños de partículas estándar para mellorar a reproducibilidade. Prepáranse mesturando un adsorbente, como o xel de sílice, cunha pequena cantidade de aglutinante inerte como o sulfao de calcio (xeso) e auga. Esta mestura esténdese como unha solución espesa sobre unha lámina portadora non reactiva, xeralmente de vidro, folla de aluminio grosa ou plástico. A placa resultante sécase e actívase por quentamento nun forno durante trinta minutos a 110 °C. O grosor da capa absorbente é tipicamente duns 0,1 – 0,25 mm para propósitos analíticos e de arredor de 0,5 – 2,0 mm para as cromatografías en capa fina preparativas.Táboas que mostran o valor do grosor de placas de cromatografía en capa fina comerciais regulares e preparativas

 Técnica 

O proceso é similar á cromatografía en papel coa vantaxe de que funciona máis rapidamente, produce mellores separacións e a pode elixirse entre diferentes fases estacionarias. Debido á súa simplicidade e rapidez, a cromatografía en capa fina utilízase a miúdo para monitorizar reaccións químicas e para a análise cualitativa de produtos de reacción. As placas poden ser etiquetadas antes ou despois do proceso de cromatografía usando un lapis ou outros instrumentos que non interfiran ou reaccionen co proceso.

Para realizar unha placa de cromatografía en capa fina lévase a cabo o seguinte procedemento:Thin Layer Chromatography: How To http://www.reachdevices.com/TLC.html

 Usando a propiedade da capilaridade, vértese sobre a placa unha pequena pinga da solución que contén a mostra, a uns 1,5 centímetros do bordo da base. O punto onde se aplica denomínase "toque" (spot). Permítese que o solvente evapore completamente para previr que interfira con interaccións da mostra coa fase móbil no seguinte paso do proceso. Se para aplicar a mostra se usa un solvente non volátil, a placa necesita ser secada nunha cámara de baleiro. Este paso adoita repetirse para asegurarse de que sobre a placa hai analito dabondo no punto de vertido ou "toque" de inicio para obter un resultado visible. Poden situarse diferentes mostras nunha ringleira de toques á mesma distancia do bordo da base, cada un dos cales se moverá polo seu propio carreiro adxacente desde o seu propio punto de inicio.
 Vértese unha pequena cantidade dun solvente apropiado (eluente) nun matraz de vidro ou calquera outro contedor transparente axeitado (cámara de separación) a unha profundidade de menos dun centímetro. Na cámara ponse unha tira de papel de filtro (ás veces chamado "mecha") para que o seu fondo toque o solvente e o papel se apoie na parede da cámara e chegue case ata á parte superior do contedor. O contedor está pechado cunha tapa de vidro ou calquera outra tapa e déixase tapado durante algúns minutos para permitir que os vapores do solvente ascendan polo papel de filtro e saturen o aire da cámara. (Se non se consegue saturar a cámara o resultado será unha mala separación e os resultados non reproducibles).
 A placa de cromatografía en capa fina é despois situada na cámara para que a(s) mancha(s) da mostra non toquen a superficie do eluente na cámara, e péchase a tapa. O solvente móvese pola placa por acción capilar, encóntrase coa mestura da mostra e transpórtaa ao longo da placa (elúe a mostra). A placa debería retirarse da cámara antes de que a fronte do solvente alcance a parte superior da fase estacionaria (a continuación da elución daría lugar a resultados equívocos) e secarse.
 Sen perda de tempo márcase a fronte do solvente, que é o nivel máis lonxe ao que chegou o solvente na placa.
 Visualízase a placa. Como algunhas placas son pre-cubertas cun fósforo como o sulfuro de zinc, grazas ao que se poden visualizar moitos compostos usando luz ultravioleta; aparecen manchas escuras alí onde os compostos bloquean a luz ultravioleta, que non pode incidir na placa. Alternativamente, ás placas se lles pode botar un spray ou mergullar en compostos químicos despois da elución. Varios axentes de visualización poden reaccionar coas manchas das substancias para producir resultados visibles.

 Proceso e principios da separación 

Os distintos compostos químicos da mestura da mostra viaxan a diferentes velocidades debido a diferenzas na súa atracción á fase estacionaria e debido a diferenzas na solubilidade no solvente. Cambiando o solvente, ou quizais usando unha mestura, pode axustarse a separación de compoñentes (medido polo valor Rf). Ademais, a separación conseguida coa placa de cromatografía en capa fina pode usarse para estimar a separación dunha columna de cromatografía flash. (Un composto elúe desde unha columna cando a cantidade de solvente recollido é igual a 1/Rf.)Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1-2), 49-54. () Os químicos a miúdo usan a cromatografía en capa fina para desenvolver un protocolo para a separación por cromatografía e o uso da cromatografia en capa fina determina que fraccións conteñen os compostos desexados.
miniatura|800px|O desenvolvemento dunha placa de cromatografía en capa fina. Unha mancha púrpura sepárase en dúas manchas, vermella e azul.
miniatura|Superficie dunha táboa acabada de cortar de Eucalyptus camaldulensis mostrando cromatografía en capa fina. A banda azul horizontal débese á reacción entre o ferro da folla da serra coa que a cortaron e a madeira ácida.
A separación de compostos está baseada na competición do soluto e a fase móbil para unirse a sitios na fase estacionaria. Por exemplo, se se utiliza como fase estacionaria un xel de sílice da fase normal, pode considerse polar. Dados dous compoñentes de distinta polaridade, o composto máis polar ten unha interacción máis forte coa sílice e ten, por tanto, unha mellor capacidade para desprazar a fase móbil dos sitios de unión dispoñibles. Como consecuencia, o composto menos polar móvese máis alto na placa (o que resulta nun valor máis alto de Rf). Se a fase móbil se cambia a un solvente máis polar ou mestura de solventes, mellora a súa unión á placa polar e despraza os solutos dela, polo que todos os compostos da placa da comatografía en capa fina se moverán avanzando pola placa. Dise comunmente que os solventes (eluentes) "fortes" empurran os compostos analizados pola placa, mentres que os eluentes "febles" apenas os moven. O grao da forza/debilidade depende da cobertura (fase estacionaria) da placa. Para placas cubertas de xel de sílice, a forza dos eluentes increméntase na seguinte orde: perfluoroalcano (o máis feble), hexano, pentano, tetracloruro de carbono, benceno/tolueno, diclorometano, dietil éter, etil acetato, acetonitrilo, acetona, 2-propanol/n-butanol, auga, metanol, trietilamina, ácido acético, ácido fórmico (o máis forte). Para placas cubertas de  C18 a orde é a inversa. Noutras palabras, cando a fase estacionaria é polar e a fase móbil é non polar, o método é de fase normal en vez de fase inversa. Isto significa que se se usa unha mestura de etil acetato e hexano como fase móbil, engadir máis etil acetato ten como resultado valores de Rf maiors para todos os compostos na placa de cromatografía en capa fina. Cambiando a polaridade da fase móbil normalmente non resultará nunha orde inversa da separación dos compostos na placa de cromatografía en capa fina. Unha serie eluotrópica pode utilizarse como guía seleccionando unha fase móbil. Se se desexa que haxa unha orde inversa dos compostos debería utilizarse unha fase estacionaria apolar, como a sílice funcionalizada con C18.

 Análise 

Como os compostos químicos que se separan poden ser incoloros, hai varios métodos para visualizar as manchas:
 Analitos fluorescentes como a quinina poden ser detectados con luz negra (366 nm).
 A miúdo unha pequena cantidade dun composto fluorescente, xeralmente engádese ao adsorbente silicato de zinc activado por manganeso que permite a visualización de manchas con luz UV-C (254 nm). A capa adsorbente fluoresce con cor verde clara, mentres que as manchas do analito atemperan esta fluorescencia.
 Os vapores de iodo son un reactivo xeral de cor inespecífica.
 Os reactivos de cor específica nos cales se mergulla a placa de cromatografía en capa fina ou que son salferidos sobre a placa.Thin Layer Chromatography stains http://www.reachdevices.com/TLC_stains.htmlJork, H., Funk, W., Fischer, W., Wimmer, H. (1990): Thin-Layer Chromatography: Reagents and Detection Methods, Volume 1a, VCH, Weinheim, Jork, H., Funk, W., Fischer, W., Wimmer, H. (1994): Thin-Layer Chromatography: Reagents and Detection Methods, Volume 1b, VCH, Weinheim
Oxidación con permanganato potásico.
 Bromo.
 Vainillina ácida.
Ácido fosfomolíbdico

 No caso dos lípidos, o cromatograma pode ser transferido a unha membrana de fluoruro de polivinilideno e despois sométese a posteriores análises, por exemplo a espectroscopia de masas, unha técnica coñecida como far-eastern blot.

Unha vez visible, o valor de Rf ou factor de retención de cada mancha de analito pode ser determinado dividindo a distancia á que o produto se desprazou pola distancia á que viaxou a fronte do solvente, usando como referencia o sitio inicial onde se depositou. Estes valores dependen do solvente usado e do tipo de placa de cromatografía en capa fina e non son constantes físicas.

 Aplicacións 

 Caracterización 
En química orgánica, as reaccións son monitorizadas cuantitativamente con cromatografía en capa fina. As mostras recollidas cun tubo capilar son situadas sobre a placa ; colócase un "toque" de material de partida, outro da mestura de reacción e outro que é unha mancha cruzada con ambos. Unha pequena placa (de 3 por 7 cm) de cromatografía en capa fina tarda un par de minutos en completar o seu funcionamento. A análise é cualitativa, e indica se desapareceu o material de partida, é dicir, indica se a reacción está completada, se apareceu algún produto e cantos produtos se xeraron (aínda que isto pode ser subestimado debido á coelución). Desafortunadamente, a cromatografía en capa fina por mor de reaccións a baixa temperatura pode dar resultados enganosos, porque a mostra se quenta a temperatura dunha habitación no capilar, o que pode alterar a reacción (a mostra quentada analizada pola cromatografía pode non ser a mesma que era cando estaba no matraz a baixa temperatura. Unha desas reaccións é a redución DIBALH de éster a aldehido.

Nun estudo aplicouse a cromatografía en capa fina no cribado de reaccións orgánicas,TLC plates as a convenient platform for solvent-free reactions Jonathan M. Stoddard, Lien Nguyen, Hector Mata-Chavez and Kelly Nguyen Chem. Commun., 2007, 1240 - 1241,  por exemplo no afinado da síntese de BINAP a partir de 2-naftol. Neste método, o alcohol e a solución catalizadora (por exemplo cloruro de ferro(III)) sitúanse por separado na liña base, despois reaccionan e seguidamente son analizados instantaneamente.

Unha aplicación especial da cromatogrfía en capa fina é a caracterización de compostos radioetiquetados, onde se usa para determinar a pureza radioquímica. A lámina da cromatografía en capa fina visualízase usando unha lámina de película fotográfica ou un instrumento que poida medir a radioactividade. Pode ser tamén visualizado usando outros medios. Este método radioactivo é moito máis sensible que os outros e pode usarse para detectar unha cantidade extremadamente pequena dun composto con tal de que porte un átomo radioactivo.

 Illamento 

Como os diferentes compostos viaxan a unha distancia distinta na fase estacionaria, a cromatografía pode utilizarse para illar compoñentes dunha mestura para unha análise ulterior. Os compostos separados ocupan cada un unha área específica da placa, poden ser retirados por raspado (xunto con partículas da fase estacionaria) e disoltos nun solvente apropiado. Como exemplo, móstranse as imaxes dunha cromatografía dun extracto de material verde dunha planta (por exemplo de espinacas) mostrada en 7 etapas do seu desenvolvemento, o caroteno elúe rapidamente e só será visible na fase 2. As clorofilas a e b quedan a medio camiño no paso final e a luteína é o primeiro composto de cor amarela. Unha vez que acaba a cromatografía, o caroteno pode retirarse da placa, extraído cun solvente e situado nun espectrofotómetro para determinar o seu espectro. As cantidades extraídas son pequenas e é preferible outra técnica como a cromatografía en columna para separar grandes cantidades. Porén, poden utiliarse grandes placas de cromatografía en capa fina preparativa con cobertura de xel de sílice grosa para separar máis de 100 mg de material.

 Exame de reaccións e estabilidade de compostos 

A cromatografía en capa fina tamén se usa para a identificación da terminación dunha reacción química. Para determinar isto obsérvase que ao principio da reacción toda a mancha de mostra está ocupada polos compostos quimicos de partida ou materiais da placa. Como a reacción empeza tendo lugar na mancha formada polos compostos químicos iniciais empeza reducindo e finalmente substituíndo a totalidade da mancha dos compostos iniciais polo novo produto presente na placa. A formación dunha mancha completamente nova determina que se completou a reacción. 

Ademais, a cromatografía en capa fina bidimensional utilízase ferecuentemente como método para comprobar se un composto é estable na fase estacionaria (como o xel de sílice, que adoita ser lixeiramente ácido). Para isto, a mestura de compostos testada elúese dúas veces nunha placa de cromatografía en capa fina cadrada, primeiro nunha dirección e despois rotada 90º. Se aparece o composto diana na diagonal do cadrado, é estable en xel de sílice e seguro para purificar. Se aparece por debaixo da diagonal, está descompoñendose no xel de sílice. Se este é o caso, a purificación pode intentarse usando xel de sílice neutralizado (con trietilamina, por exemplo), ou unha fase estacionaria alternativa como a alúmina neutra.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Bibliografía 

 F. Geiss (1987): Fundamentals of thin layer chromatography planar chromatography, Heidelberg, Hüthig, 
 Justus G. Kirchner (1978): Thin-layer chromatography, 2nd edition, Wiley 
 Joseph Sherma, Bernard Fried (1991): Handbook of Thin-Layer Chromatography (= Chromatographic Science. Bd. 55). Marcel Dekker, Nova York NY, .
 Elke Hahn-Deinstorp: Applied Thin-Layer Chromatography. Best Practice and Avoidance of Mistakes. Wiley-VCH, Weinheim u. a. 2000, 

Categoría:Cromatografía
Categoría:Técnicas de laboratorio