Célula nai pluripotente inducida

miniatura|Colonias de células iPS humanas. As células con forma de fuso do fondo son fibroblastos de rato. Só as células que están no centro da colonia son células iPS humanas.

As células nai pluripotentes inducidas (normalmente abreviadas como células iPS, polas súas siglas en inglés de "Induced Pluripotent Stem") son un tipo de células nai con características pluripotenciais (con capacidade de xeraren a maioría dos tecidos) derivadas artificialmente dunha célula que inicialmente non era pluripotencial. Xeralmente, utilízase para obtelas unha célula adulta diferenciada procedente dun tecido, sobre a que se induce a expresión de varios xenes exóxenos, tales como Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4, que poden desdiferenciala. Esta desdiferenciación denomínase reprogramación. As células iPS poden: a) diferenciarse en células de tecidos pertencentes ás tres capas xerminais dun embrión natural (ver embrioxénese humana): endoderma, mesoderma e ectoderma, b) formar teratomas, e c) orixinar ratos quiméricos ou quimeras.

Demostrouse que as células iPS son idénticas en moitos aspectos e similares noutros ás células nai embrionarias (normalmente abreviadas como ES, polas súas siglas en inglés de "Embryonic Stem"). Por exemplo, son iguais en morfoloxía, expresión de certos xenes e proteínas, padróns de metilación do ADN, tempo de duplicación celular e capacidade de diferenciación a células doutros tecidos. Porén, o mecanismo por medio do cal se inducen e a súa relación coas células ES segue aínda en investigaciónLiu J, Verma PJ, Evans-Galea MV, Delatycki MB, Michalska A, Leung J, Crombie D, Sarsero JP, Williamson R, Dottori M et al (2011). "Generation of induced pluripotent stem cell lines from Friedreich ataxia patients". Stem Cell Rev 7 (3): 703-713. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21181307).Liu SP, Fu RH, Huang YC, Chen SY, Chien YJ, Hsu CY, Tsai CH, Shyu WC, Lin SZ (2011). "Induced pluripotent stem (iPS) cell research overview". Cell Transplant 20 (1): 15-19. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20887681).

As células iPS obtivéronse por primeira vez no ano 2006 a partir de células de ratos e en 2007 a partir de células humanas. En 2006, describiuse por primeira vez este proceso a partir de fibroblastos de rato utilizando retrovirus que vehiculizaban e inducían a expresión de varios xenes exóxenos. En 2011 publicouse unha revisión sobre esta primeira metodoloxía.Miller JD, Schlaeger TM (2011). "Generation of induced pluripotent stem cell lines from human fibroblasts via retroviral gene transfer". Methods Mol Biol 767 55-65. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21822867). Isto considérase un dos avances máis importantes da investigación con células nai, xa que permite obter células nai pluripotentes a partir de células adultas. As iPS teñen aplicacións como modelos para o estudo de doenzas, posibles usos terapéuticos (diminuíndo o rexeitamento nos transplantes e sen a controversia do uso de embrións que teñen as células ES), e en investigacións básicas.

Shinya Yamanaka e John Gurdon foron galardoados en 2012 co Premio Nobel de Fisioloxía ou Medicina.

 Primeiros métodos de reprogramación de células adultas 
miniatura|400px|Esquema da xeración de células de tecidos diferenciadas a partir das células nai naturais. . Todas as células adultas que compoñen o corpo dun rato ou humano xéranse a partir dunha célula inicial totipotente a través de células nai pluripotentes, que só persisten na etapa embrionaria (células ES), e despois a partir de células nai multipotentes que persisten no adulto. A reprogramación de células adultas a células pluripotenres (células iPS) conseguiu a reversibilidade parcial deste proceso natural de diferenciación celular

 Primeira xeración en ratos 
As células iPS derivan de células adultas por transferencia (transfección) de varios xenes exóxenos asociados a células ES. Xeralmente para unha transferencia eficiente utilízanse retrovirus que actúan como vehículos ou vectores dos xenes exóxenos. Os xenes exóxenos transferidos son principalmente os correspondentes a factores de transcrición asociados ás células ES. Tres ou catro semanas despois, unha pequena porcentaxe das células transferidas comenzan a diferenciarse volvéndose morfolóxica e bioquimicamente similares ás células ES. As células iPS ou células adultas reprogramadas íllanse por selección cun xene de resistencia a antibióticos e para confirmar a súa identidade (véxase máis adiante).

O equipo de Shinya Yamanaka da Universidade de Kyoto (Xapón) en 2006 foi o primeiro que creou células iPS. Para iso utilizaron como células diana fibroblastos de rato, e como xenes exóxenos os previamente identificados como expresados nas células ES, e como vehículos ou vectores retrovirus. Catro xenes que codificaban factores de transcrición resultaron esenciais para producir células iPS: os denominados Oct-3/4, Sox2, c-Myc e Klf4. Das células tratadas con retrovirus que codifican ditos xenes seleccionáronse só aquelas que os expresaban con antibióticos e pola presenza do xene Fbx15 (células Fbx15+). Porén, estas células iPS tiñan padróns de metilación do ADN distintos dos das células ES e ademais non producían ratos quiméricos viables.

 Segunda xeración en ratos 

En 2007, o mesmo grupo publicou un traballo xunto con outros grupos de investigación independentes da Universidade Harvard, o MIT e a Universidade de California, que demostraba que se podían obter células iPS a partir de fibroblastos de rato con capacidade de formar quimeras viables utilizando o xene Nanog en vez do Fbx15. Os padróns de metilación do ADN e a produción de ratos quiméricos viables indicaron que Nanog é un determinante importante da pluripotencia celular. Desafortunadamente, debido a que un dos catro xenes utilizados (c-Myc) é oncoxénico, o 20% dos ratos quiméricos desenvolveu cancro. Nun estudo posterior, demostrouse que se poden manter células iPS sen c-Myc que non desenvolven cancro, mais o procedemento é menos eficiente.Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S (2008). "Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts". Nat Biotechnol 26 (1): 101-106. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18059259).

 Produción de células iPS humanas 

En 2007, tamén se publicou o avance máis importante, xa que se conseguira crear células iPS humanas a partir de células humanas adultas. Os resultados obtivéronos dous equipos de investigación independentes. Un dirixido por Yamanaka no Xapón transformou fibroblastos humanos en células iPS utilizando os xenes: Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc vehiculizados en retrovirus, mentres outro dirixido por Thomson nos Estados Unidos usou os xenes Oct4, Sox2, Nanog e LIN28 vehiculizados en lentivirus.

 Problemas dos primeiros métodos de reprogramación celular 

Aínda que os primeiros métodos que utilizaban xenes que codificaban factores de transcrición demostraron que as células adultas diferenciadas poden reprogramarse a células iPS, aínda existen problemas importantes, tales como: i) eficiencia, ii) mutaxénese insercional, iii) tumores e iv) reprogramación incompleta. 

 Eficiencia: é un problema que afecta o proceso de obtención de células iPS. A eficiencia ou porcentaxe de obtención de células reprogramadas é aínda moi baixa. Por exemplo, a porcentaxe de reprogramación no estudo en ratos de Yamanaka foi só do 0,1-1% Esta porcentaxe tan baixa pode deberse á necesidade de que coincidan distintos niveis de expresión de varios dos xenes exóxenos transfectados. Tamén podería ser debido á necesidade de cambios xenéticos ou epixenéticos na poboación de células diana tal e como suxire a necesidade de tempos longos de cultivo. A optimización da reprogramación segue sendo obxecto de estudos recentes (Chen, et al. 2011)Dick E, Matsa E, Bispham J, Reza M, Guglieri M, Staniforth A, Watson S, Kumari R, Lochmuller H, Young L et al (2011). "Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines". Stem Cell Res 6 (2): 158-167. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21095172). e constantemente se producen novos avances. Por exemplo, para obter unha máxima eficiencia, nos primeiros métodos descritos cumpría que as células iPS crecesen sobre unha capa de células alimentadoras que aínda que estaban inactivadas supoñían unha posible fonte de contaminación. Con novos métodos conseguiuse facer crecer células iPS en ausencia de ditas capas en boas condiciónsChung HC, Lin RC, Logan GJ, Alexander IE, Sachdev PS, Sidhu KS (2011). "Human Induced Pluripotent Stem Cells Derived Under Feeder-Free Conditions Display Unique Cell Cycle and DNA Replication Gene Profiles". Stem Cells Dev (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21506733). e durante tempo prolongado.Nemati S, Hatami M, Kiani S, Hemmesi K, Gourabi H, Masoudi N, Alaei S, Baharvand H (2011). "Long-term self-renewable feeder-free human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors". Stem Cells Dev 20 (3): 503-514. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20632795).

 Mutaxénese insercional: é un problema que afecta as posibles aplicacións en medicina rexenerativa. A inserción dos xenes exóxenos que codifican os factores de transcrición no xenoma da célula diana limita a súa utilidade debido ao risco de mutaxénese insercional no xenoma das células diana.Selvaraj V, Plane JM, Williams AJ, Deng W (2010). "Switching cell fate: the remarkable rise of induced pluripotent stem cells and lineage reprogramming technologies". Trends Biotechnol 28 (4): 214-223. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20149468). As mutacións introducidas poden ser deletéreas ou inducir tumores. Unha estratexia para evitar a mutaxénese insercional é o uso de vectores alternativos. Para iso exploráronse plásmidos, adenovirus e transposóns, que aínda que reducen as posibilidades de mutaxénese insercional, teñen unha eficiencia de reprogramación menor.Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K (2008). "Induced pluripotent stem cells generated without viral integration". Science 322 (5903): 945-949. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18818365).Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, Hamalainen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M et al (2009). "piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells". Nature 458 (7239): 766-770. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19252478). Outras estratexias que empregan proteínas ou ARN tamén teñen unha eficiencia menor. Por último, o emprego de moléculas de baixo peso molecular que simulan o efecto dos factores de transcrición parece hoxe por hoxe a alternativa máis esperanzadora. 

 Tumores: é un problema que afecta as posibles aplicacións en medicina rexenerativa. Algúns dos xenes reprogramadores son oncoxenes, o que aumenta a probabilidade de indución de tumores. Aínda que se puido eliminar o c-Myc despois de xerar células iPS para eliminar a formación de tumores, cómpre realizar máis estudos. Parece existir un equilibrio entre a eficiencia da reprogramación e a formación de tumores, xa que a inactivación ou eliminación do xene supresor de tumores p53, aumenta a eficiencia de reprogramación.Marion RM, Strati K, Li H, Murga M, Blanco R, Ortega S, Fernandez-Capetillo O, Serrano M, Blasco MA (2009). "A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity". Nature 460 (7259): 1149-1153. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19668189).

 Reprogramación incompleta: é un problema que afecta as posibles aplicacións en medicina rexenerativa. Para reprogramar completamente unha célula diferenciada dun tipo celular a outro, o código epixenético causante da diferenciación celular debe ser "reformateado", o que non sempre se consegue ao 100% dependendo de cada tipo de célula diana.Kim K, Zhao R, Doi A, Ng K, Unternaehrer J, Cahan P, Hongguang H, Loh YH, Aryee MJ, Lensch MW et al (2011). "Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells". Nat Biotechnol 29 (12): 1117-1119. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22119740). Malia estes inconvenientes, tres equipos independentes puideron xerar células iPS que deron orixe a ratos derivados enteiramente de células iPS inxectándoas a blastocistos tetraploides. Porén, estudos dos perfís de transcrición demostraron que dita equivalencia non sempre é completa.Li Z, Hu S, Ghosh Z, Han Z, Wu JC (2011). "Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells". Stem Cells Dev 20 (10): 1701-1710. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21235328).Narsinh KH, Sun N, Sanchez-Freire V, Lee AS, Almeida P, Hu S, Jan T, Wilson KD, Leong D, Rosenberg J et al (2011). "Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells". J Clin Invest 121 (3): 1217-1221. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21317531).

 Métodos alternativos de reprogramación celular 
Para que un método de reprogramación sexa práctico ou mesmo viable, as eficiencias ou porcentaxes de reprogramación (número de células reprogramadas respecto ao total de células adultas diana iniciais) deben ser o máis altas posible. Por exemplo, unha eficiencia de reprogramación do 50-100 % sería óptima, pero os primeiros porcentaxes de reprogramación estaban no 0,1-1%. As eficiencias de reprogramación dependen maioritariamente dos vectores que se utilicen. Os riscos para o uso de células iPS en humanos tamén dependen en gran medida dos métodos utilizados. Aínda que as transferencias con retrovirus son ata agora as que obtiveron unha maior eficiencia, dan lugar á inserción ao chou dos xenes exóxenos no xenoma da célula diana, o que pode producir mutaxénese insercional provocando inactivación de xenes vitais ou activación de oncoxenes (Zhang, et al. 2011). Ata agora as alternativas a estas metodoloxías son: i) compostos de baixo peso molecular, ii) adenovirus, plásmidos e transposóns, iii) proteínas recombinantes e iv) móleculas de ARN. Melloras nestas novas metodoloxías que desen lugar a maiores eficiencias poderían axudar a xerar células iPS máis seguras e a encontrar solucións a estes problemas. Quizais haxa que deseñar novos métodos que combinen todas as vantaxes coñecidas.

 Moléculas de baixo peso molecular 

Unha das principais estratexias para evitar a mutaxénese insercional é o uso de moléculas de baixo peso molecular (comparadas coas proteínas ou os ADNs) como substitutivos dos efectos dos factores de transcrición. Estas moléculas poden incrementar a eficiencia de reprogramación compensando o efecto do factor reprogramador. Debido a que non son ADN, ditas moléculas tamén evitan a integración xenómica aumentando así a seguridade. Aínda que polo momento non se puido identificar unha mestura de moléculas que reprograme completamente as células adultas a pluripotentes, existen algúns exemplos que aumentan a eficiencia ou mesmo poden substituír algúns dos xenes.

Os primeiros estudos que describían algunhas destas estratexias realizáronse en 2008. Por exemplo, o ácido valproico, un inhibidor da histona descetilase, aumentou a eficiencia de reprogramación multiplicándoa por 100.Huangfu D, Maehr R, Guo W, Eijkelenboom A, Snitow M, Chen AE, Melton DA (2008). "Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds". Nat Biotechnol 26 (7): 795-797. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18568017). Suponse que o ácido valproico simula os sinais do factor de transcrición c-Myc. Propúxose un tipo similar de mecanismo para o BIX-01294, un inhibidor da histona metiltransferase que simula os efectos do Sox2.Shi Y, Desponts C, Do JT, Hahm HS, Scholer HR, Ding S (2008). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds". Cell Stem Cell 3 (5): 568-574. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18983970). A simulación doutros sinais é un tema de activa investigación (Chen, et al. 2011). 

Outra estratexia estaba baseada no estudo da ruta molecular natural de diferenciación das células mesenquimais a epiteliais na que interveñen o TGF-beta (factor de transformación beta) e MEK (quinase das proteínas epiteliais activada por mitóxenos). Primeiro seleccionáronse dous inhibidores de TGF-beta e MEK entre aqueles que non só inhibían a diferenciación senón que tamén eran os máis activos en reprogramación (SB431412 e PD0325901). Cando se usaron estes dous inhibidores en combinación, multiplicouse aproximadamente por 100 a eficiencia de reprogramación. Despois investigouse dunha maneira similar, a ruta molecular natural empregada para manter a supervivencia celular. Así, despois de ensaiar en reprogramación varios compostos que inhiben dita ruta, seleccionouse o Thiazovivin. Usando unha mestura destes tres inhibidores conseguiuse unha mellora na eficiencia de reprogramación, que se multiplicou case por 200.Lin TX, Ambasudhan R, Yuan X, Li WL, Hilcove S, Abujarour R, Lin XY, Hahm HS, Hao E, Hayek A et al (2009). "A chemical platform for improved induction of human iPSCs". Nature Methods 6 805-U824. 

Por outra parte, o estudo dos mecanismos de reprogramación posiblemente achegará novas alternativas e ideas sobre este importante asunto.Lin SL (2011). "Concise review: Deciphering the mechanism behind induced pluripotent stem cell generation". Stem Cells 29 (11): 1645-1649. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21948625).Lin Z, Perez P, Lei D, Xu J, Gao X, Bao J (2011). "Two-phase analysis of molecular pathways underlying induced pluripotent stem cell induction". Stem Cells 29 (12): 1963-1974. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21956995).

 Adenovirus, plásmidos e transposóns 

Outra estratexia para evitar a formación de tumores foi o uso de vectores alternativos ou non retrovirais, tales como os adenovirus, plásmidos e transposóns. Porén, aínda que os métodos baseados en todos estes vectores alternativos evitan o uso de retrovirus, seguen requirindo o uso de xenes exóxenos provocadores de tumores para obter a reprogramación. 

Os adenovirus son únicos entre os vectores virais porque non incorporan ningún dos seus propios xenes ao xenoma da célula diana e por tanto evitan a mutaxénese insercional.Zhou W, Freed CR (2009). "Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells". Stem Cells 27 (11): 2667-2674. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19697349). Outra vantaxe de usar adenovirus é que soamente necesitan estar presentes durante un breve tempo para induciren a reprogramación. En 2008, usouse adenovirus para vehiculizar os catro xenes exóxenos (factores de transcrición) a células de ratos obtendo células idénticas ás ES, demostrándose así que para obter células iPS non é absolutamente necesaria a integración no xenoma da célula diana dos xenes exóxenos.

En 2008, o equipo de Yamanaka demostrou que a reprogramación tamén era posible empregando plásmidos en vez de retrovirus para transferir os catro xenes exóxenos.Okita K, Hong H, Takahashi K, Yamanaka S (2010). "Generation of mouse-induced pluripotent stem cells with plasmid vectors". Nat Protoc 5 (3): 418-428. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=20203661). En ditos traballos, descríbese como conseguiron transformar células de rato con dous plásmidos, un deles expresaba o c-Myc, mentres que o segundo expresaba Oct4, Klf4 e Sox2. Porén, estes métodos son moito menos eficientes que os baseados en retrovirus e tamén teñen posibilidades de mutaxénese insercional aínda que en menor proporción que os retrovirus.

Intentouse tamén o uso dalgúns transposóns. Por exemplo, varios estudos demostraron que os transposóns denominados piggyBac poden  transportar os xenes de reprogramación sen introduciren mutacións indesexables no xenoma da célula diana, xa que efectúan unha reexcisión dos xenes exóxenos evitando a mutaxénese insercional.

 Proteínas recombinantes 

Unha gran vantaxe deste método é que evita os problemas de mutaxénese insercional, dado que as proteínas non son ácidos nucleicos e non se poden inserir no xenoma. En 2009, demostrouse a xeración de células iPS sen alteración xenética das células adultas orixinais por medio de proteínas vehiculizadas a través de péptidos.Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y et al (2009). "Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins". Cell Stem Cell 4 (5): 381-384. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19398399). Así, púidose demostrar que as proteínas recombinantes correspondentes aos factores de transcrición se podían usar para a reprogramación. Mentres que a transferencia de proteínas tamén induce pluripotencia, o método é máis complicado e require dominar as técnicas de produción e purificación de proteínas recombinantes. Ademais, a súa eficiencia é moi baixa.

 Moléculas de ARN 

Os micro ARNs son moléculas curtas complementarias de secuencias de ARN mensaxeiro (ARNm) que bloquean a súa tradución a proteínas, inhibindo especificamente a expresión final dos xenes. A expresión de moléculas de microARN específicas de ES (tales como miR-291, miR-294 e miR-295) aumentaban a eficiencia da reprogramación ata un nivel similar ao método que usa proteínas. Os microARNs quizais actúan bloqueando a expresión de represores dos catro ou algún dos catro factores de transcrición de Yamanaka. Un obstáculo para o uso da reprogramación por ARN é a súa inestabilidade. Porén, poderíanse usar ARNs con modificacións estabilizadoras (5-metilguanosinas ou pseudouracilos), que ademais de seren máis estables e teñen menor probabilidade de mutaxénese insercional. Outro obstáculo quizais máis importante, é que os ARN exóxenos provocan respostas antivirais innatas nas células diana.

 Xenes que inducen reprogramación 

A xeración de células iPS depende de que se usen os xenes axeitados para a indución da reprogramación. Ata agora identificáronse os Oct-3/4 e varios membros da familia dos xenes Sox (Sox1, Sox2, Sox3, Sox15) como xenes indispensables para inducir a reprogramación. Por outra parte, xenes tales como os das familias dos factores Kruppel (Klf1, Klf2, Klf4, Klf5), Myc (c-myc, L-myc, N-myc), Nanog e LIN28, identificáronse como xenes implicados en aumentar a eficiencia de reprogramación. Máis en detalle:
 Xenes indispensables na reprogramación
 Xene Oct-3/4: o Oct-3/4 (Pou5f1) é un dos xenes da familia dos factores de transcrición de estrutura octamérica, coñecido polo seu papel no mantemento da pluripotencia e do potencial de diferenciación das células ES. A ausencia de Oct-3/4 en células que son naturalmente Oct-3/4+, tales como os blastómeros e as células ES causa a súa diferenciación espontánea. Outros xenes da familia Oct, como Oct1 e Oct6, non producen indución da reprogramación, demostrando a especificidade de Oct-3/4.
 Xenes Sox: a familia de xenes Sox está asociada ao mantemento tanto da pluripotencia coma da multipotencia mentres que os xenes Oct-3/4 están exclusivamente implicados no mantemento da pluripotencia. O xene Sox2 foi o que se utilizou inicialmente, pero despois demostrouse que tamén se poden usar outros xenes da familia Sox. Por exemplo o Sox1 induce células iPS cunha eficiencia similar a Sox2, mentres que os xenes Sox3, Sox15 e Sox18 tamén inducen células iPS pero con menor eficiencia.
 Xenes que aumentan a eficiencia da reprogramación
 Xenes Kruppel (Klf): o xene Klf4 da familia Klf identificouno inicialmente o grupo de Yamanaka como un factor de indución de células iPS para rato, aínda que o grupo de Thomson comprobou que Klf4 non inducía células iPS humanas. Klf2 e Klf4 inducen células iPS con alta eficiencia mentres que Klf1 e Klf5 o fan cunha eficacia menor.
 Xenes Myc: a familia de xenes Myc son oncoxenes envolvidos no cancro. O xene c-Myc está implicado na indución de células iPS de rato e humanas. Porén, despois comprobouse que a súa presenza non é necesaria para manter células iPS humanas. O uso de xenes da familia Myc na indución de células iPS humanas é problemático se se usan para terapias clínicas, xa que o 25% dos ratos transplantados con células iPS inducidas con c-Myc desenvolveron teratomas letais. N-Myc e L-Myc tamén inducen células iPS con eficiencias similares a c-Myc.
 Xene Nanog: o xene Nanog, xunto con Oct-3/4 e Sox2, exprésanse nas células ES. Por iso foi sorprendente que o grupo de Yamanaka describise inicialmente que Nanog non era necesario para a reprogramación, aínda que o grupo de Thomson comprobou que tamén era posible a súa utilización.
 Xene LIN28: LIN28 é unha proteína que se liga ao ARN e que se expresa en células ES e células de carcinoma embrionario asociadas con diferenciación e proliferación. Demostrouse que LIN28 pode inducir células iPS aínda que é dispensable.

 Confirmación da identidade das células iPS 
miniatura|400px|Tres células/tecidos de liña xerminal diferenciadas a partir de iPSC: neuronas (ectoderma), cartilaxe (mesoderma) e células caliciformes intestinais (endoderma).
As células iPS son moi similares ás células ES tanto en rato coma en humanos nos seguintes aspectos: propiedades celulares, pluripotencia e reprogramación epixenética. O estudo destes aspectos emprégase para confirmar se unhas determinadas células iPS son pluripotenciales ou non.
 Propiedades celulares
 Morfoloxía: as células iPS son morfoloxicamente similares ás células ES. Ambas teñen unha forma redondeada cun núcleo grande e pouco citoplasma. As colonias de células iPS son tamén similares ás colonias de células ES. As células iPS humanas forman colonias con fortes contornos, planas e compactas como as que forman as células iPS humanas. As colonias de células iPS de rato son máis similares ás ES de rato, menos planas e máis compactas que as humanas.

 Propiedades de división celular: o tempo de duplicación curto correspondente a unha división ou frecuencia de mitose alta é a propiedade máis característica das células ES, xa que por definición como células nai que son, deben de multiplicarse activamente. As células iPS son tamén mitoticamente activas, dividíndose a unha velocidade igual que as células ES.
 Marcadores de células nai: as células iPS expresan nas súas membranas celulares os mesmos marcadores antixénicos que as células ES, segundo demostra o seu recoñecemento con anticorpos específicos. Por exemplo as células iPS humanas expresan SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E e Nanog, xenes que tamén se expresan nas células ES humanas, mentres que as células iPS de rato expresan SSEA-1 mais non SSEA-3 nin SSEA-4, tal e como fan as células ES de rato. Continúa a busca e investigación de novos marcadores para mellorar a caracterización das células iPS (Chen, et al. 2011). 
 Xenes transcritos en células nai: as células iPS transcriben a maioría dos mesmos xenes que se transcriben nas células ES, tales como Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4, TERT, etc, aínda que estudos recentes están encontrando algunhas diferenzas.
 Actividade de telomerase: a telomerase é un encima necesario para manter a división celular sen a limitación natural dunhas 50 divisións celulares (límite de Hayflick). Tanto as células iPS coma as ES humanas expresan unha actividade de telomerase moi alta para manter a súa autorenovación e proliferación. Ademais expresan a transcriptase inversa da telomerase, un compoñente necesario para que actúe a telomerase.
 Pluripotencia
 Diferenciación neuronal: en cultivos in vitro, as células iPS, igual que as ES, diferéncianse a neuronas, que expresan os marcadores βIII-tubulina, tirosina hidroxilase, AADC, DAT, ChAT, LMX1B e MAP2. A presenza de encimas asociados á catecolamina pode ser unha indicación de que as células iPS teñen capacidade para se diferenciar a neuronas. Cando se completa a diferenciación a neuronas os xenes marcadores mencionados déixanse de expresar.
 Diferenciación a células cardíacas: en cultivos in vitro, as células iPS diferéncianse a células musculares cardíacas (cardiomiocitos), que espontaneamente comezan a contraerse. Os cardiomiocitos expresan os marcadores TnTc, MEF2C, MYL2A, MYHCβ e NKX2.5. Cando se completa a diferenciación a cardiomiocitos, os xenes marcadores mencionados déixanse de expresar.
 Formación de teratomas in vivo: as células iPS cando se inxectan en ratos inmunodeficientes forman teratomas nunhas nove semanas. Os teratomas son tumores que conteñen simultaneamente tipos de células correspondentes a múltiples tecidos derivados das tres capas xerminais endoderma, mesoderma e ectoderma. Os teratomas son tumores moi característicos, porque a maioría dos tumores son dun só tipo celular. A formación de teratomas é unha das principais características das células ES e tamén un dos seus principais problemas técnicos para a súa posible utilización terapéutica en medicina rexenerativa.
 Corpos embrionarios in vitro: as células ES humanas forman en cultivo in vitro masas de estruturas redondeadas que se denominan corpos embrionarios. Os corpos embrionarios consisten nun centro de células mitoticamente activas rodeadas de células diferenciándose e unha periferia de células totalmente diferenciadas correspondentes a tecidos derivados das tres capas xerminais. As células iPS tamén forman corpos embrionarios en cultivo in vitro.

miniatura|300px|Esquema de cigoto, mórula e blastocisto rodeado de trofoblasto no desenvolvemento natural dun embrión. Un cigoto totipotencial de rato ou humano despois dunha fase de mórula na que todas as células son iguais, diferénciase a células internas (blastocisto) e células externas (trofoblasto). As células ES de rato e humanas que forman o blastocisto dos embrións temperáns diferénciase aos distintos tecidos que darán lugar ao embrión completo mentres que as capas máis exteriores (trofoblasto) se diferencian a tecidos extraembrionarios, tales como a placenta. O trofoblasto illado sen o blastocisto non pode desenvolver embrións. Cómpre que haxa células ES no interior do trofoblasto para poder obter o desenvolvemento dun embrión.

 Ratos quiméricos: o ensaio de formación de ratos quiméricos baséase na transferencia de células ES a trofoblastos baleiros. Cando as células iPS se inxectan a un trofoblasto baleiro e o conxunto trofoblasto+células iPS resultante se implanta nun rato femia, dá lugar a ratiños nos que un 10-90% das súas células proceden das iPS (quimeras).
 Ratos por complementación tetraploide : as células ES e as iPS derivadas de rato cando se inxectan en blastocistos tetraploides baleiros dan lugar a unha pequena porcentaxe de ratos non quiméricos.
 Reprogramación epixénetica
 Desmetilación de promotores: a metilación é a transferencia dun grupo metilo a unha base do ADN, tipicamente a unha citosina dun sitio rico en secuencias adxacentes de citosina e guanina (sitio CpG). Os promotores son secuencias de ADN que controlan a transcrición dun xene. A metilación extensiva do promotor dun determinado xene inhibe a súa transcrición. Nas células ES e iPS, os promotores dos xenes asociados a pluripotencia tales como Oct-3/4, Rex1 e Nanog, non están metilados, demostrando a súa transcrición.
 Desmetilación de histonas: as histonas son proteínas que compactan o ADN inhibindo a transcrición do ADN cando están metiladas. Por exemplo, as histonas H3 asociadas cos xenes Oct-3/4, Sox2 e Nanog deben estar sen metilar para que ditos xenes estean activos tal e como ocorre coas células ES.Liang G, Taranova O, Xia K, Zhang Y (2010). "Butyrate promotes induced pluripotent stem cell generation". J Biol Chem 285 (33): 25516-25521. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20554530).
 Perfil global de metilación: as células iPS humanas teñen perfís de metilación global moi similares aos das células ES. Porén, distintas iPS mostran variacións da orde dunhas 1000 veces nos seus perfís de metilación. A metade deses perfís son semellantes aos da célula da que se derivaron mentres que a outra metade é específica de células iPS. Nalgunhas iPS atopáronse decenas de rexións do ADN de megabases de lonxitude que non están reprogramadas como as das células ES.

 Aplicacións: modelos, medicina rexenerativa e ciencia básica 

As células iPS estanse aplicando ao estudo de doenzas xenéticas humanas: i) como modelos in vitro de enfermidades para desenvolver medicamentos específicos, ii) considerando o seu uso como posible tratamento individual en medicina rexenerativa, e iii) utilizándoas para investigación básica. Para adiantarse a estas posibles aplicacións, xa se comezou a pensar na organización de bancos de células nai.Taylor CJ, Bolton EM, Bradley JA (2011). "Immunological considerations for embryonic and induced pluripotent stem cell banking". Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 366 (1575): 2312-2322. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21727137).

miniatura|500px|Esquema da xeración e aplicacións das células iPS. As células iPS poden derivarse de cada paciente. Unha vez obtidas, amplifícanse por división celular e parte delas consérvase conxelada en nitróxeno líquido. As súas aplicacións son: i) como modelos in vitro de enfermidades para desenvolver medicamentos específicos, ii) para o seu uso como posible tratamento individual en medicina rexenerativa, e iii) utilizalas para investigación básica.

 Modelos in vitro de enfermidades. Para o seu uso como modelos in vitro de enfermidades específicas de cada paciente, as células iPS derívanse dos pacientes correspondentes. Por exemplo, en 2011 publicáronse traballos con células iPS desenvolvidas a partir de pacientes con varios tipos de síndromes raras,Ananiev G, Williams EC, Li H, Chang Q (2011). "Isogenic pairs of wild type and mutant induced pluripotent stem cell (iPSC) lines from Rett syndrome patients as in vitro disease model". Plos One 6 (9): e25255. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21966470).Priori SG (2011). "Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and long QT syndrome: is personalized medicine ready for prime time?". Circ Res 109 (8): 822-824. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21960720).Sheridan SD, Theriault KM, Reis SA, Zhou F, Madison JM, Daheron L, Loring JF, Haggarty SJ (2011). "Epigenetic characterization of the FMR1 gene and aberrant neurodevelopment in human induced pluripotent stem cell models of fragile X syndrome". Plos One 6 (10): e26203. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22022567). atrofia muscular,Chang T, Zheng W, Tsark W, Bates S, Huang H, Lin RJ, Yee JK (2011). "Brief report: phenotypic rescue of induced pluripotent stem cell-derived motoneurons of a spinal muscular atrophy patient". Stem Cells 29 (12): 2090-2093.  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21956898). desordes cardiovasculares,Josowitz R, Carvajal-Vergara X, Lemischka IR, Gelb BD (2011). "Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders". Curr Opin Cardiol 26 (3): 223-229. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21451408). e ataxia (Liu, et al. 2011). Debido a que en principio se poden obter cantidades ilimitadas de células iPS “enfermas”, pódense estudar as características moleculares da doenza e ensaiar posible tratamentos e fármacos in vitro antes de aplicalos ao paciente.

 Medicina rexenerativa. O desafío de producir células iPS máis seguras continúa para desenvolver posibles tratamentos terapéuticos de enfermidades humanas en medicina rexenerativa, (Zhang, et al. 2011). O atranco máis importante para esta aplicación das células nai, tanto das iPS coma das ES, é a súa tendencia á formación de teratomas, tal e como recoñecen institucións como a FDA (Food and Drug Administration dos Estados Unidos). Ademais, un traballo recente indica que as células iPS poderían ser máis tumoroxénicas que as ES. Isto podería deberse a que algúns dos xenes, por exemplo, os xenes Myc, son oncoxenes moi coñecidos. A omisión dos Myc provoca unha diminución á centésima parte da eficiencia de reprogramación, aínda que en 2008, se describiu unha nova técnica para eliminar os oncoxenes Myc unha vez conseguida a indución da pluripotencia, incrementando así a súa seguridade. Un punto decisivo que hai que resolver axeitadamente é a relación entre eficiencia e integración xenómica. A maioría dos métodos de indución de células iPS que non utilizan integración xenómica son ineficientes, mentres que os que a empregan aínda teñen problemas causados pola mutaxénese insercional tales como a indución de tumores (teratomas) e a reprogramación incompleta. Por iso búscanse activamente métodos alternativos para inducir iPS. Por tanto, unha área importante para futuros estudos é o ensaio de tumoroxenicidade das iPS usando métodos similares aos que logo se usarían para a súa aplicación terapéutica na medicina rexenerativa. Ditos estudos son importantes, xa que as células iPS, igual que as ES, non só forman teratomas senón que en ratos derivados de células iPS se demostraron altas mortalidades por cancro.Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S (2008). "Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells". Science (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=18276851). Relacionado con estas posibles aplicacións é o tema dos rexeitamentos de autotransplantes. Debido a que as células iPS se poden derivar das propias células adultas do propio paciente, ao contrario que as células ES, pensábase que un tratamento coas súas células iPS (autotransplante) evitaría as respostas inmunolóxicas responsables de rexeitamentos. Porén, xa existen as primeiras evidencias de que tamén este pode seguir sendo un problema coas células iPS. 

 Investigación básica. En canto a estudos máis básicos necesarios para comprender os mecanismos de reprogramación e con posibilidades de aplicación a máis longo prazo, outro reto importante é a caracterización proteómica e dos perfís de transcrición das células iPS. O grupo dirixido por Wu na Universidade Stanford fixo avances significativos en proteómica, mentres que outros equipos traballan na caracterización do transcritoma.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Shinya Yamanaka
 Célula nai

 Bibliografía 
 Chen HF, Chuang CY, Lee WC, Huang HP, Wu HC, Ho HN, Chen YJ, Kuo HC (2011). "Surface marker epithelial cell adhesión molecule and E-cadherin facilitate the identification and selection of induced pluripotent stem cells". Stem Cell Rev 7 (3): 722-735. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21305366).
 Chen J, Liu J, Chen Y, Yang J, Liu H, Zhao X, Mo K, Song H, Guo L, Chu S et al (2011). "Rational optimization of reprogramming culture conditions for the generation of induced pluripotent stem cells with ultra-high efficiency and fast kinetics". Cell Res 21 (6): 884-894. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21445094).
 Chen T, Shen L, Yu J, Wan H, Guo A, Chen J, Long Y, Zhao J, Pei G (2011). "Rapamycin and other longevity-promoting compounds enhance the generation of mouse induced pluripotent stem cells". Aging Cell 10 (5): 908-911. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21615676).
 Liu J, Verma PJ, Evans-Galea MV, Delatycki MB, Michalska A, Leung J, Crombie D, Sarsero JP, Williamson R, Dottori M et al (2011). "Generation of induced pluripotent stem cell lines from Friedreich ataxia patients". Stem Cell Rev 7 (3): 703-713. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21181307).
 Liu SP, Fu RH, Huang YC, Chen SY, Chien YJ, Hsu CY, Tsai CH, Shyu WC, Lin SZ (2011). "Induced pluripotent stem (iPS) cell research overview". Cell Transplant 20 (1): 15-19. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20887681).
 Zhang F, Citra F, Wang DA (2011). "Prospects of induced pluripotent stem cell technology in regenerative medicine". Tissue Eng Part B Rev 17 (2): 115-124. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21210760).
 Zhang G, Shang B, Yang P, Cao Z, Pan Y, Zhou Q (2011). "Induced pluripotent stem (iPS) cell consensus genes: Implication for the risk of tumorigenesis and cancers in iPS cell therapy". Stem Cells Dev (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22185567).
 Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y (2011). "Immunogenicity of induced pluripotent stem cells". Nature 474 (7350): 212-215. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21572395).

 Ligazóns externas 
 Las células iPS inauguran una tercera vía, Diario Médico 30/05/2008
 Center for iPS Cell Research and Application, Universidade de Kioto
 With few factors, adult cells take on character of embryonic stem cells 
 Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4 
 Vídeo de 2 minutos de BSCRF sobre céluls nais pluripotentes inducidas
 20Minute Video / The Discovery and Future of Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells de Dr.Yamanaka 8 de xaneiro de 2008
 Blog que trata especificamente de células iPS e investigación, biotecnoloxía e asuntos orientados a pacientes
 Folla de datos sobre reprogramación
 Insertech on stem cells

Categoría:Bioética
Categoría:Biotecnoloxía
Categoría:Célula
Categoría:Clonación
Categoría:Embrioloxía
Categoría:Células nai