Mutaxénese dirixida a sitio

A mutaxénese dirixida a sitio, tamén chamada mutaxénese específica de sitio ou mutaxénese dirixida a oligonucleótido, é un método de bioloxía molecular que se usa para facer cambios específicos e intencionados na secuencia de ADN dun xene ou calquera produto xénico determinado. Tamén se utiliza para investigar a estrutura e actividade biolóxica de moléculas de ADN, ARN e proteínas e para a enxeñaría de proteínas.

A mutaxénese dirixida a sitio é unha das técnicas de laboratorio máis importantes para crear bibliotecas de ADN para introducir mutacións en secuencias de ADN. Hai numerosos métodos para realizar a mutaxénese dirixida a sitio, pero coa diminución dos custos da síntese de oligonucleótidos, agora utilízase ocasionalmente a síntese de xenes artificiais como alternativa á mutaxénese dirixida ao sitio. Desde 2013, o desenvolvemento da tecnoloxía CRISPR/Cas9, baseada nun sistema de defensa contra virus procariota, tamén permitiu que a edición do xenoma e a mutaxénese poidan realizarse in vivo con relativa facilidade.

 Historia 
Os intentos iniciais de mutaxénese usando a radiación ou mutáxenos químicos non eran específicos de sitio, e xeraban mutacións aleatorias.  Os análogos de nucleótidos e outros compostos químicos foron despois usados para xerar mutacións puntuais localizadas, exemplos deses compostos químicos son a aminopurina, nitrosoguanidina, e o bisulfito. A mutaxénese dirixida a sitio foi lograda en 1974 no laboratorio de Charles Weissmann, que usou o análogo de nucleótidos N4-hidroxicitidina, que induce a transición de GC a AT. Porén, estes métodos de mutaxénese están limitados polo tipo de mutación que poden conseguir e non son tan específicos como os últimos métodos de mutaxénese dirixida a sitio.

En 1971, Clyde Hutchison e Marshall Edgell mostraron que é posible producir mutantes con pequenos fragmentos do fago ϕX174 e nucleases de restrición. Posteriormente, Hutchison co seu colaborador Michael Smith en 1978 idearon unha estratexia máis flexible da mutaxénese dirixida a sitio usando oligonucleótidos nun primeiro método de extensión coa ADN polimerase. Polo seu papel no desenvolvemento deste proceso, Michael Smith compartiría posterioremnte o Premio Nobel de Química en outubro de 1993 con Kary B. Mullis, que inventou a reacción en cadea da polimerase.

 Mecanismo básico 

O procedemento básico require a síntese dun curto cebador de ADN. Este cebador sintético contén a mutación desexada e é complementario co ADN molde arredor do sitio de mutación polo que pode hibridarse co ADN no xene de interese. A mutación pode ser un cambio dunha soa base (unha mutación puntual), múltiples cambios de bases, unha deleción ou unha inserción. O cebador monocatenario é despois ampliado usando unha ADN polimerase, que copia o resto do xene. O xene así copiado contén o sitio mutado e é despois introducido nunha célula hóspede por un vector e clonado. Finalmente, os mutantes son seleccionados por secuenciación de ADN para comprobar que conteñen a mutación desexada.

 Estratexias 

O método orixinal que usaba a extensión dun cebador único era ineficaz debido ao baixo rendemento de mutantes. A mestura resultante contén tanto o molde non mutado orixinal coma a febra mutante, producindo unha poboación mixta de proxenies mutantes e non mutantes. Ademais, o molde usado é metilatdo mentres que a febra mutante non está metilada, e os mutantes poden ser contraseleccionados debido á presenza do sistema de reparación de discordancias, que favorece o ADN molde metilado, o que ten como resultado poucos mutantes. Desde entón desenvolvéronse moitas estratexias para mellorar a eficiencia da mutaxénese.

Disponse dun gran número de métodos para efectuar a mutaxénese dirixida a sitio, aínda que a maioría deles raramente se usan nos laboratorios desde inicios de 2000, xa que as técnicas máis novas permiten maneiras máis simples e doadas de introducir mutacións específicas de sitio nos xenes.

 Método de Kunkel 

En 1985, Thomas Kunkel presentou unha técnica que reduce a necesidade de seleccionar os mutantes. O fragmento de ADN que debe ser mutado insírese nun faxémido como M13mp18/19 e é despois transformado nunha cepa de E. coli deficiente en dous encimas, a dUTPase (dut) e a uracil desglicosidase (udg). Ambos os encimas forman parte dunha vía de reparación do ADN que protexe o cromosoma bacteriano das mutacións pola desaminación espontánea de dCTP a dUTP. A deficiencia de dUTPase impide a degradación do dUTP, o que ten como resultado un alto nivel de dUTP na célula. A deficiencia de uracilo desglicosidase impide a eliminación do uracilo do ADN acabado de sintetizar. Cando a E. coli dobre mutante replica o ADN do fago, a súa maquinaria encimática pode incorporar incorrectamente dUTP en vez de dTTP, o que ten como resultado un ADN monocatenario que contén algúns uracilos (ssUDNA). Este ssUDNA é extraído do bacteriófago que se libera no medio e despois é utilizado como molde para a mutaxénese. Un oligonucleótido que conteña a mutación desexada utilízase para a extensión do cebador. O ADN heterodúplex que se forma consta dunha febra non mutada parental que contén dUTP e unha febra mutada que contén dTTP. O ADN é despois transformado na cepa de E. coli que porta os xenes silvestres de dut e udg. Aquí, a febra de ADN parental que contén uracilo é degradada, así que case todos os ADN resultantes constan da febra mutada.

 Mutaxénese de casete 

A diferenza doutros métodos, a mutaxénese de casete non necesita facer a extensión de cebador usando a ADN polimerase. Neste método, sintetízase un fragmento de ADN e despois insírese nun plásmido. Realízase un corte por medio dun encima de restrición nun sitio no plásmido e seguidamente lígase ao plásmido un par de oligonucleótidos complementarios que conteñen a mutación no xene de interese. Usualmente, os encimas de restrición que cortan o plásmido e os oligonucleótidos son iguais, o que permite que os plásmidos con extremos adhesivos se insiran para ligarse entre si. Ese método pode xerar mutantes con case un 100% de eficacia, pero está limitado pola dispoñibilidade de sitios de restrición apropiados que flanqueen o sitio que debe ser mutado.

 Mutaxénese dirixida a sitio de PCR 

miniatura|400px|Representación dun modo común de clonar unha biblioteca de mutaxénse dirixida a sitio (é dicir, usando oligos dexenerados). O xene de interese é PCRed con oligos que conteñen unha rexión que é perfectamente complementaria co molde (en azul), e unha que difire do molde nun ou máis nucleótidos (en vermello). Na mesma PCR xúntanse moitos deses cebadores que conteñen dexeneración na rexión non complementaria, orixinando moitos produtos de PCR distintos con diferentes mutacións nesa rexión (os mutantes individuais móstranse con diferentes cores máis abaixo).

A limitación dos sitios de restrición da mutaxénese de casete pode ser evitada usando a reacción en cadea da polimerase con "cebadores" oligonucleótidos, para que se poida xerar un fragmento máis grande, cubrindo dous sitios de restrición convenientes. A amplificación exponencial na PCR produce un fragmento que contén a mutación desexada en cantidde suficiente para ser separada do plásmido orixinal non mutado por electroforese en xel, que pode despois ser inserido no contexto orixinal usando técnicas de bioloxía molecular recombinante estándar. Hai moitas variacións da mesma técnica. O método máis simple sitúa o sitio de mutación cara a un dos extremos do fragmento por medio do cal un dos dous oligonucleótidos usados para xerar o fragmento contén a mutación. Isto implica un só paso de PCR, pero aínda ten o problema inherente de requirir un sitio de restrición axeitado próximo ao sitio da mutación, a non ser que se use un cebador moi longo. Outras variacións, por tanto, empregan tres ou catro oligonucleótidos, dous dos cales poden ser oligonucleótidos non mutaxénicos que cobren dous sitios de restrición convenientes e xeran un fragmento que pode ser dixerido e ligado nun plásmido, mentres que o oligonucleótido mutaxénico pode ser complementario a unha localización dentro dese fragmento bastante lonxe de calquera sitio de restrición conveninente. Estes métodos requiren múltiples pasos de PCR para que o fragmento final que vai ser ligado conteña a mutación desexada. O proceso de deseño para xerar un fragmento coa mutación desexada e os sitios de restrición relevantes pode ser complicado. Algunhas ferramentas de software como SDM-Assist poden simplificar o proceso.

 Mutaxénese de plásmido completo 

Para manipulacións de plásmidos, as outras técnicas de mutaxénese dirixida a sitio foron suplantadas en gran medida por técnicas que son altamente eficaces e relativamente simples, doadas de usar e dispoñibles comercialmente en forma de kits. Un exemplo destas técnicas é o método Quikchange, no que se usan un par de cebadores mutaxénicos complementarios para amplificar o plásmido enteiro nunha reacción termociclada que usa unha ADN polimerase que non despraza a febra de alta fidelidade, como a polimerase Pfu. A reacción xera un ADN circular con amosega. O ADN molde debe ser eliminado por dixestión encimática cun encima de restrición como DpnI, que é específico para o ADN metilado. Todos os ADN producidos a partir da maioría das cepas de Escherichia coli serían metilados; o plásmido molde que é biosintetizado en E. coli será, por tanto, dixerido, mentres que o plásmido mutado, que se xera in vitro e non está metilado, deixaríase sen dixerir. Nótese que nestes métodos de mutaxénese de plásmidos bicatenarios, aínda que se pode usar unha reacción termociclada, o ADN non necesita ser exponencialmente amplificado nunha PCR. En vez disto, a amplificación é linear, e, por tanto, é inexacto describila como unha PCR, xa que non hai reacción en cadea.

Nótese que a polimerase pfu pode converterse en desprazadora da febra a unha maior temperatura de extensión (≥70 °C), o cal pode ter como resultado o fracaso do experimento, dado que a reacción de extensión debería realizarse á temperatura recomendada de 68 °C. Nalgunhas apicacións, observouse que este método orixina a inserción de múltiples copias de cebadores. Unha variación deste método, chamada SPRINP, impide este artefacto e foi utilizada en diferentes tipos de mutaxénese dirixida a sitio.

Outras técnicas como a mutaxénese de varrido de dianas dirixidas a oligos (SMOOT, do inglés scanning mutagenesis of oligo-directed targets) pode combinar semialeatoriamente oligonucleótidos mutaxénicos na mutaxénese de plásmidos. Esta técnica pode crear bibliotecas de mutaxénese de plásmidos que van desde mutacións únicas a mutaxéneses de codóns completas ao longo dun xene enteiro.

 Métodos de mutaxénese dirixida a sitio in vivo 
Delitto perfetto
Transprazamento "pop-in pop-out"
Dirección de xene directa e mutaxénese específica de sitio con PCR e un marcador reciclable
Deleción de xene directa e mutaxénese específica de sitio con PCR e un marcador reciclable usando rexións homólogas longas
Muraxénese dirixida a sitio in vivo con oligonucleótidos sintéticos

 CRISPR 
Desde 2013, o desenvolvemento da tecnoloxía CRISPR-Cas9 permitiu a introdución eficiente de mutacións puntuais no xenoma dunha ampla variedade de organismos. O método non require un sitio de inserción de transposón, non deixa marcador e a súa eficacia e simplicidade convertérono no método preferido para a edición do xenoma.

 Aplicacións 

miniatura|300px|A mutaxénese de saturación de sitio é un tipo de mutaxénese dirixida a sitio. Esta imaxe mostra a mutaxénese de saturación dunha soa posición nunha proteína de 10 residuos teórica. A versión de tipo silvestre da proteína móstrase na parte superior, na que M representa o primeiro aminoácido metionina, e o asterisco (*) representa a terminación da tradución. Os 19 mutantes da isoleucina na posición 5 móstranse abaixo.

A mutaxénese dirixida a sitio utilízase para xerar mutacións que poden producir unha proteína deseñada racionalmente que ten propiedades melloradas ou especiais (é dicir, unha proteína de enxeñaria).

Ferramentas de investigación.– Mutacións específicas no ADN permiten investigar a función ou propiedades dunha secuencia de ADN ou proteína cunha estratexia racional. Ademais, os cambios nun só aminoácido feitos por mutaxénese dirixida a sitio en proteínas poden axudar a comprender a importancia das modificacións postraducionais. Por exemplo, cambiar unha determinada serina (fosfoaceptora) por unha alanina (non aceptora de fosfato) nunha proteína substrato bloquea a unión dun grupo fosfato, o que permite investigar a fosforilación. Esta estratexia pode uilizarse para descubrir a fosforilación da proteína CBP pola quinase HIPK2  Outra estratexia completa é a mutaxénese de saturación de sitio na que se pode substituír un codón ou un conxunto de codóns por todos os posibles aminoácidos en posicións específicas.

Aplicacións comerciais.– As proteínas poden formarse por enxeñaría para producir formas mutantes que se fan a medida para unha aplicación específica. Por exemplo, os deterxentes que se usan comunmente para lavar a roupa poden conter subtilisina, cuxa forma de tipo silvestre ten unha metionina que pode ser oxidada pola lixivia, o que reduce significativamente a actividade da proteína no proceso. Esta metionina pode ser substituída por alanina ou outro residuos, facéndoa resistente á oxidación o que mantén a proteína activa en presenza de lixivia.

 Síntese de xenes 

Como o custo da síntese de oligonucleótidos de ADN está baixando, a síntese artificial dun xene completo é agora un método viable para introducir unha mutación nun xene. Este método permite unha extensa mutaxénese en múltiples sitios, incluíndo o redeseño completo do uso de codóns dun xene para optimizalo para un determinado organismo.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Mutaxénese dirixida (evolución)

 Ligazóns externas 
 Conferencia para o Nobel sobre a invención da mutaxénese dirixida a sitio
 OpenWetWare
 Diagrama que resume a mutaxénese dirixida a sitio

Categoría:Xenética molecular
Categoría:Mutaxénese
Categoría:Enxeñaría de proteínas