Hibridación in situ cromoxénica

A hibridación in situ cromoxénica (que se adoita abreviar como CISH, do inglés chromogenic in situ hybridization) é unha técnica citoxenética que combina o método de detección de sinais cromoxénicos das técnicas de inmunohistoquímica coa hibridación in situ. Foi desenvolvida arredor do ano 2000 como alternativa á hibridación in situ fluorescente (FISH) para a detección da amplificación do oncoxene HER-2/neu. A CISH é similar á FISH no sentido de que ambas as dúas son técnicas de hibridación in situ usadas para detectar a presenza ou ausencia de rexións específicas do ADN. Porén, a CISH é moito máis práctica en laboratorios de diagnóstico porque usa microscopios de campo brillante en vez dos máis complicados e caros microscopios de fluorescencia que hai que usar na FISH.

 Procedemento 

miniatura|Procedemento para realizar a hibridación in situ cromoxénica

 Deseño de sondas 

O deseño de sondas para CISH é moi similar ao das sondas para FISH con diferenzas só en etiquetado e detección. As sondas para FISH son xeralmente etiquetadas con diversas etiquetas fluorescentes e só pode detectarse con microscopio fluorescente, mentres que as sondas para CISH son etiquetadas con biotina ou digoxixenina  e poden detectarse usando un microscopio de campo brillante unha vez que se aplicaron outros pasos do tratamento.

As sondas para CISH son de aproximadamente 20 nucleótidos de lonxitude e son deseñadas para dianas de ADN. Son complementarias da secuencia diana e únense a ela despois dun paso de desnaturalización e hibridación. Só se dispón comercialmente dunhas poucas sondas para CISH, así que para a maioría das aplicacións deben ser extraídas, amplificadas, secuenciadas, etiquetadas e mapadas a partir de cromosomas artificiais bacterianaos (BACs). Os BACs foron desenvolvidos durante o Proxecto Xenoma Humano, xa que era necesario illar e amplificar curtos fragmentos de ADN humano para propósitos de secuenciación. Hoxe os BACs poden seleccionarse e posicionarse no xenoma humano usando bases de datos públicas como o UCSC Genome Browser. Isto asegura unha complementariedade óptima e especificidade de secuencia. O ADN extráese dos clons de BAC e amplifícase usando unha técnica baseada na polimerase, como a DOP-PCR. Os seguintes clons son secuenciados e verifícanse as súas posicións no xenoma. A etiquetaxe de sondas pode realizarse usando un cebado aleatorio ou a translación de amosega para incorporar biotina ou digoxixenina.Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012) "Labeling of DNA Probes by Nick Translation". Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

 Preparación dos tecidos, hibridación de sondas e detección 

Para que a CISH funcione optimamente, os cromosomas deben estar en interfase ou metafase. As mostras de tecidos están adheridas con seguridade a unha superficie, que adoita ser un portaobxectos de cristal, con parafina. As mostras de tecidos deben despois lavarse e quentarse varias veces para eliminar toda a parafina antes do paso de hibridación. Despois disto, a mostra sométese a unha dixestión con pepsina para asegurarse de que a diana é accesible. Como paso final, engádense de 10 a 20 μL de sonda, a mostra cúbrese cun cubreobxectos que se sela con cemento goma, e despois o portaobxectos quéntase a 97 °C durante 5–10 minutos para desnaturalizar o ADN. O portaobxectos sitúase despois nun forno a 37 °C durante toda a noite, polo que a sonda pode hibridarse. Ao día seguinte, a mostra é lavada e aplícase un bloqueador para sitios de unión a proteínas non específicas. Se se vai usar a peroxidase do ravo picante (HRP, horseradish peroxydase), a mostra debe ser incubada en peróxido de hidróxeno para suprimir a actividade de peroxidase endóxena. Se se utilizou a digoxixenina como  etiqueta da sonda, aplícase un anticorpo primario de fluoresceína anti-digoxixenina seguido dun anticorpo secundario anti-fluoresceína conxugado con HRP. Se se utilizou a biotina como etiqueta da sonda, primeiro deben bloquearse os sitios de unión non específicos utilizando seroalbumina bovina (BSA). Despois, utilízase para a detección unha estreptavidina conxugada a HRP. Despois a HRP converte a diaminobencidina (DAB) nun produto marrón insoluble, que pode ser detectado nun microscopio de campo brillante a 40-60 aumentos. Pode utilizarse unha contratinguidura como a hematoxilina e eosina para facer o produto máis visible.

 Comparación con outras técnicas 

miniatura|A) Detección de FISH directa. As etiquetas fluorescentes son unidas a unha sonda, que se hibridará á febra de ADN diana. B) Detección de FISH indirecta. A biotina, por exemplo, únese a unha sonda. A estreptavidina unida a unha etiqueta fluorescente únese á biotina con alta especificidade. C) Detección de CISH indirecta. De novo, a biotina únese a unha sonda. A etreptavidina ligada á peroxidase do ravo picante únese á biotina con alta especificidade. A peroxidase do ravo picante converte a diaminobencidina nun precipitado marrón.

 Comparación coa FISH 

A FISH considérase a técnica estándar para a detección de anormalidades cromosómicas porque é moi sensible e ten unha alta resolución. Outras técnicas que se desenvolveron para detectar anormalidades cromosómicas son comparadas xeralmente coa sensibilidade e especificidade da FISH para ver se están ao mesmo nivel. Por exemplo, comparada coa FISH, a CISH ten unha sensibilidade do 97,5% e unha especificidade do 94% para a detección da amplificación do xene HER-2/neu. A taxa de concordancia entre a FISH e a CISH era do 94,8%, o que indica que a CISH é unha técnica comparable á FISH. A maioría das demais fontes concordan e informan dunha prestación case igual nos ensaios de amplificación de xenes da FISH e a CISH. Porén, ás veces a CISH mostra unha baixa sensibilidade para amplificacións de baixo nivel.

A CISH ten algunhas vantaxes sobre a FISH nos reactivos e o equipamento que hai que usar. Como se sinalou antes, a CISH é moito máis barata e doada de usar porque usa microscopios de campo brillante en vez de microscopios de fluorescencia. Ademais, os reactivos para CISH son máis estables que os reactivos para FISH, polo que é posible para almacenar as mostras e examinar a mesma mostra moitas veces. Os reactivos para FISH esváense co tempo debido ao fotobranqueo, polo que unha mostra só se pode examinar unha vez. Ademais dos caros microscopios de fluorescencia, a FISH tamén require unha cámara dixital de alta resolución para capturar micrografías da mostra antes de que se esvaeza a fluorescencia. Outra vantaxe de usar un microscopio de campo brillante é que a mostra de tecido ou célula pode visualizarse enteira por medio da CISH, mentres que a morfoloxía da célula é difícil de estimar usando a microscopia de fluorescencia na FISH.

A CISH tamén se diferencia da FISH nas sondas que usa e no método global. Hai moitos tipos de sondas para FISH dispoñibles, como sondas de repeticións, sondas que detectan xenes específicos ou telómeros e sondas que detectan anormalidades cromosómicas. En contraste, hai unha variedade limitada de sondas para CISH dispoñibles comercialmente, incluíndo as sondas que se unen ao centrómero dos cromosomas 3, 7, 8, 9, 10, 11, 17, 18, X e Y así como sondas específicas para xenes relacionados co cancro, como HER-2, EGFR, MYC e TOP2A. Malia a limitada variedade de sondas para CISH dispoñibles, son xeralmente máis custosas que as sondas para FISH. Con respecto ao método global, a FISH pode realizarse usando etiquetaxe directa (os fluorocromos son unidos ás sondas) ou indirecta (as sondas son etiquetadas con biotina ou digoxixenina, que son detectadas usando estreptavidina etiquetada fluorescentemente ou anticorpos, respectivamente). A CISH realízase usando etiquetaxe indirecta na cal os anticorpos ou a estreptavidina son conxugadas con enzimas como a peroxidase do ravo picante (HRP) ou a fosfatase alcalina (AP).

 Comparación coa inmunohistoquímica 

A CISH e a inmunohistoquímica son similares porque ambas se usan para o mesmo propósito (principalmente detectar a amplificación de HER-2/neu) e ambas usan encimas de restrición (HRP/AP) para medir dita amplificación. Porén, a CISH e a inmunohistoquímica son diferentes en que esta última mide a expresión de proteínas, mentres que a CISH mide a amplificación do ADN. Esta diferenza é especialmente útil para o HER-2/neu porque se observou que a amplificación deste xene ten máis valor para o prognóstico que a expresión de proteínas.

Unha desvantaxe da inmunohistoquímica é que non é posible identificar resultados de falso negativo e falso positivo. Na CISH, se non hai sinal para a sonda de referencia, o ensaio falla.

Para a sobreexpresión de proteínas/amplificación xénica altas e baixas, a CISH e a inmunohistoquímica mostran unha concordancia de aproximadamente o 86% e o 89%, respectivamente. Mostrouse que os anticorpos monoclonais son mellores que os anticorpos policlonais para a detección en inmunohistoquímica ou en CISH , xa que se unen máis especificamente, o que causa unha maior taxa de concordancia.

Para sobreexpresión de proteínas/amplificación xénica medias a concordancia varía, pero é maior cando se usan anticorpos monoclonais que cando se usan os anticorpos policlonais. A concordancia variable débese ao feito de que a amplificación xénica non se correlaciona estritamente coa expresión de proteínas e a que a heteroxeneidade de tumores pode facer difícil detectar a sobreexpresión de proteínas nun tecido.

 Aplicacións médicas 

A CISH aplícase frecuentemente para avaliar a amplificación xénica, como o status HER-2/neu en mostras de cancro de mama. A amplificación HER-2/neu está asociada cunha maior mortalidade, maior taxa de recorrencia e peor prognóstico no cancro de mama. O anticorpo monoclonal trastuzumab é un bloqueador de receptor que probou ser clinicamente moi efectivo en tumores con sobreexpresión de HER-2/neu. Por tanto, é esencial determinar o status do receptor antes de comezar o tratamento contra o cancro.

A CISH tamén se usa para a detección de rearranxos e fusións cromosómicas, como a fusión do dominio ALK tirosina quinase co promotor e a rexión 5’ de EML4 no cancro de pulmón. Os tumores ALK-positivos son un subgrupo clinicamente relevante, xa que poden ser tratados con moita efectividade co inhibidor de ALK crizotinib.

Ademais de en cancros, a CISH tamén é útil para detectar as infeccións por papilomavirus humano.

 Variacións 

 Hibridación in situ potenciada por prata (SISH) 
A hibridación in situ potenciada por prata (ou SISH, do inglés silver-enhanced in situ hibridization) utiliza un método similar ao da CISH, pero o produto final é un precipitado de prata en vez dun produto marrón. Neste método, unha sonda etiquetada con dinitrofenol (DNP) únese á secuencia diana. Despois engádese un anticorpo primario anti-DNP seguido dun anticorpo secundario conxugado á HRP. Seguidamente engádense acetato de prata, hidroquinona e peróxido de hidróxeno ao anticorpo secundario e a HRP cataliza a polimerización da prata en presenza de peróxido de hidróxeno. O metal prata queda depositado no núcleo da célula. A amplificación de HER-2/neu vese como puntos negros.

 DuoCISH 
DuoCISH é unha variante da CISH que permite usar dúas sondas diferentes no mesmo portaobxectos.Henriksen, U., Müller, S., and Schønau, A. (2009) Chapter 14: "Dual color CISH and FISH to CISH conversion", pp. 97–101 in G.L. Kumar and L. Rudbeck (Eds.), Immunohistochemical (IHC) Staining Methods Fifth Edition. Carpinteria, CA: Dako North America É unha técnica ben establecida para a detección da amplificación HER-2/neu incluso se ás veces se informa que é menos efectiva que a FISH. Nesta técnica, unha sonda únese á referencia, a cal, no caso da detección da amplificación de HER-2/neu, é CEN17 (o centrómero do cromosoma 17), mentres que a outra sonda únese á secuencia diana, a cal é HER-2/neu. DuoCISH combina a FISH e a CISH porque converte sinais das sondas da FISH en substratos cromoxénicos. Funciona baseándose no principio de que a tinguidura de cianina azul é un substrato para a HRP e a tinguidura vermella é un substrato para a AP. Por exemplo, os sinais de isotiocianato de fluoresceína (FITC) verde son convertidos en precipitados cromoxénicos azuis por medio de anticorpos anti-FITC conxugados coa HRP, e os sinais de Texas Red son convertidos en precipitados cromoxénicos vermellos por medio dun anticorpo anti-Texas Red conxugado á AP. Unha vantaxe do DuoCISH é que é posible distinguir entre a aneuplodía cromosómica e a amplificación xénica, xa que o xene de referencia será tamén amplificado en aneuploidía, pero non na detección da amplificación xénica.

 Notas 

Categoría:Técnicas de bioloxía molecular