Electroporación

A electroporación ou electropermeabilización é unha técnica microbiolóxica na cal se aplica un campo eléctrico ás células para incrementar a permeabilidade da membrana plasmática, para permitir que compostos químicos, fármacos, ou ADN entren n célula (o que se chama tamén electrotransferencia). En microbioloxía, o proceso de electroporación adoita usarse para transformar bacterias, lévedos, ou protoplastos de plantas ao introducirlles novo ADN codificante. Se as bacterias e plásmidos están mesturados no mesmo medio, os plásmidos poden transferirse ás bacterias despois de facer a electroporación, aínda que dependendo do que vai ser transferido poden usarse péptidos penetrantes na célula ou o CellSqueeze. A electroporación funciona pasando miles de volts a través dunha distancia de só 1 ou 2 milímetros de células en suspensión nunha cubeta de electroporación. Despois, as células teñen que ser manipuladas con coidado ata que teñan a oportunidade de dividirse, producindo novas células que conteñen plásmidos reproducidos. Este proceso é aproximadamente dez veces máis efectivo que a transformación química.

A electroporación é tamén moi eficaz para a introdución de xenes alleos en células en cultivos de tecidos, especialmente as células de mamíferos. Por exemplo, é utilizado no proceso de producir ratos knockout, así como no tratamento de tumores, terapia xénica e a terapia baseada en células. O proceso de introducir ADN alleo en células eucariotas denomínase transfección. A electroporación é moi eficaz para transfectar células en suspensión usando cubetas de electroporación. É tamén útil para o seu uso en tecidos in vivo, para aplicacións in utero e para a transfección in ovo. As células adheridas poden tamén ser transfectadas usando a electroporación, proporcionando aos investigadores unha alternativa á tripsinización das células antes da transfección. Porén, un inconveniente da electroporación é que despois do proceso da expresión xénica uns 7 000 xenes poden verse afectados. Isto pode causar problemas en estudos nos que a expresión xénica ten que ser controlada para asegurarse de que os resultados son exactos e precisos.

A fusión celular é interesante non só como proceso artificial en bioloxía celular, senón tamén un método útil en biotecnoloxía e medicina. A fusión inducida artificialmente pode utilizarse para investigar e tratar diferentes doenzas, como a diabetes,McClenaghan, N. H. Physiological regulation of the pancreatic β-cell: functional insights for understanding and therapy of diabetes. Exp. Physiol. 92, 481–496 (2007).Yanai, G. et al. Electrofusion of mesenchymal stem cells and islet cells for diabetes therapy: A rat model. PLoS ONE 8, e64499 (2013).McCluskey, J. T. et al. Development and functional characterization of insulin-releasing human pancreatic beta cell lines produced by electrofusion. J. Biol. Chem. 286, 21982–21992 (2011). rexenerar axóns do sistema nervioso central,Sretavan, D. W., Chang, W., Hawkes, E., Keller, C. & Kliot, M. Microscale surgery on single axons. Neurosurgery 57, 635–646 (2005). e produce células coas propiedades desexadas, como en vacinas de células para a inmunoterapia do cancro.Guo, W., Guo, Y., Tang, S., Qu, H. & Zhao, H. Dendritic cell-Ewing's sarcoma cell hybrids enhance antitumor immunity. Clin. Orthop. 466, 2176–2183 (2008).Koido, S. et al. Regulation of tumor immunity by tumor/dendritic cell fusions. Clin. Dev. Immunol. 2010, 516768 (2010).Avigan, D., Rosenblatt, J. & Kufe, D. Dendritic/tumor fusion cells as cancer vaccines. Semin. Oncol. 39, 287–295 (2012). Porén, a primeira e máis coñecida aplicación da fusión celular é a produción de anticorpos monoclonais na tecnoloxía dos hibridomas, na que se forman liñas de células híbridas (hibridomas) pola fusión de linfocitos B produtores de anticorpos específicos cunha liña célular de mieloma (cancro de linfocito B).Vor dem Esche, U. et al. Passive vaccination with a human monoclonal antibody: generation of antibodies and studies for efficacy in Bacillus anthracis infections. Immunobiology 216, 847–853 (2011).Trontelj, K. et al. Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry 74, 124–129 (2008).

 Práctica de laboratorio 

miniatura|230px|Cubetas para a electroporación in vitro. Son de plástico con eléctrodos de aluminio e unha tapa azul. Teñen unha cabida máxima de 400 μl.
A electroporación realízase con electroporadores, aparellos construídos con ese propósito que crean un campo eléctrico nunha solución de células. A suspensión de células é pipeteada nun vaso ou cubeta de plástico, que ten nos seus lados dous eléctrodos de aluminio. Para a electroporación bacteriana, utilízase normalmente unha suspensión duns 50 microlitros. Antes da electroporación, esta suspensión de bacterias mestúrase cos plásmidos para ser transformado. A mestura é pipeteada na cubeta, establécense a voltaxe e a capacitancia, e a cubeta insírese no electroporador. O proceso require un contacto directo entre os eléctrodos e a suspensión. Inmediatamente despois da electroporación, engádese un mililitro de medio líquido á bacteria (na cubeta ou nun tubo Eppendorf), e incúbase o tubo á temperatura óptima da bacteria durante unha hora ou máis para permitir a recuperación das células e a expresión do plásmido, seguido do cultivo bacteriano en placa de ágar.

O éxito da electroporación depende en gran medida da pureza da solución de plásmidos, especialmente no seu contido de sal. As solucións con altas concentracións de sal podería causar unha descarga eléctrica (arco eléctrico), que a miúdo reduce a viabilidade das bacterias. Para unha investigación máis detallada do proceso, debe prestarse moita atención á saída de impedancia do aparello porador e á entrada de impedancia da suspensión de células (por exemplo o contido de sal).

Como a membrana plasmática non pode ser atravesada pola corrente eléctrica (agás nas canles iónicas), actúa como un capacitador eléctrico. Ao someter as membranas a un campo elécrico de alta voltaxe producese a súa rotura temporal, o que orixina poros que son dabondo grandes como para permitir que as macromoléculas (como o ADN) entren ou saian da célula.

Adicionalmente, a electroporación pode utilizarse para incrementar a permeabilidade das células durante as inxeccións e cirurxía in utero. Particularmente, a electroporación permite unha transfección máis eficaz do ADN, ARN, ARN de forquita pequeno e todos os ácidos nucleicos de células de ratos e ratas. O éxito da electroporación in vivo depende grandemente da voltaxe, repetición, pulsos e duración. Os sistemas nervisos centrais en desenvolvemento son máis efectivos para a electroporación in vivo debido á visibilidade dos ventrículos para as inxeccións de ácidos nucleicos, así como o incremento da permeabilidade das células en división. A electroporación de embrións in utero inxectados realízase a través da parede uterina, xeralmente con eléctrodos de tipo fórceps para limitar os danos ao embrión.

 Aplicacións médicas 

A primeira aplicación médkica da electroporación utilizouse para introducir fármacos anticancro pouco permeantes nos nódulos tumorais.Mir LM, Belehradek M, Domenge C, Orlowski S, Poddevin B, Belehradek J Jr, Schwaab G, Luboinski B, Paoletti C (1991). Electrochemotherapy, a new antitumor treatment: first clinical trial, CR Acad Sci III 313:613-618 Axiña espertou grande interese debido ao seu baixo custo, facilidade de realización e seguridade. Concretamente, os vectores virais poden ter serias limitacións en termos de inmunoxenicidade e patoxenicidade cando se usan para a transferencia de ADN.Marshall E (1999). Gene therapy death prompts review of adenovirus vector, Science 286:2244–2245 (1999)

A electrotransferencia de xenes in vivo foi descrita primeiramente en 1991 Titomirov A, Sukharev S, Kistanova E (1991). In vivo electroporation and stable transformation of skin cells of newborn mice by plasmid DNA, Biochim Biophys Acta. 1088(1):131–134 e hoxe hai máis estudos preclínicos da electrotransferencia de xenes. O método utilízase para entregar unha gran variedade de xenes terapéuticos para o tratamento potencial de varias enfermidades, tales como: trastornos do sistema inmunitario, tumores, trastornos metabólicos, enfermidades monoxenéticas, enfermidades cardiovasclares, analxesia….Heller LC, Coppola D (2002). Electrically mediated delivery of vector plasmid DNA elicits an antitumor effect, Gene Ther 9:1321-1325Chuang IC, Jhao CM, Yang CH, Chang HC, Wang CW, Lu CY, Chang YJ, Lin SH, Huang PL, Yang LC (2004). Intramuscular electroporation with the pro-opiomelanocortin gene in rat adjuvant arthritis, Arthritis Research & Therapy, 6:R7–R14. . Accessed 2015-11-14.Vilquin JT, Kennel PF, Paturneau-Jouas M, Chapdelaine P, Boissel N, Delaère P, Tremblay JP, Scherman D, Fiszman MY, Schwartz K (2001). Electrotransfer of naked DNA in the skeletal muscles of animal models of muscular dystrophies, Gene Ther 8:1097-1107

O primeiro grupo en probar a electroporación para aplicacións médicas foi o de Lluis M. Mir no Instituto Gustave-Roussy. Neste caso, trataron de usar a electroporación reversible xunto con macromoléculas impermeables. A primeira investigación estudou como se poderían usar pulsos de nanosagundos en células humanas e foi realizada polos investigadores da Escola médica de Virxinia Occidental e a Universidade Old Dominion e publicado en 2003.

En canto á electroporación irreversible, o primeiro tratamento con éxito de tumores cutáneos malignos implantados en ratos completouse en 2007 por un grupo de científicos que conseguiron a ablación completa dun tumor en 12 dun grupo de 13 ratos. Realizaron isto enviando 80 pulsos de 100 microsegundos a 0,3 Hz cunha magnitude de campo eléctrico de 2500 V/cm para tratar os tumores cutáneos.

En porcos viuse que unha maior voltaxe de electroporación destrúe irreversiblemente as células diana dentro dun estreito rango mentres que as células veciñas non son afectadas, polo que representa un novo tratamento prometedor contra o cancro, enfermidades de corazón e outros estados de enfermidades que requiren a extracción do tecido. A electroporación irreversible desde entón probou ser efectiva para tratar o cancro humano, que os ciruruxiáns do Hospital Johns Hopkins e outras institucións agora usan a tecnoloxía para tratar os cancros pancreáticos que previamente se pensaba que eran inextirpables.

Ademais, informouse dos ensaios clínicos en fase I da electrotranferencia de xenes en pacientes con melanoma metastático.Daud A, DeConti R, Andrews S, Urbas P, Riker A, Sondak VK, Munster PN, Sullivan DM, Ugen KE, Messina JL, Heller R (2008). Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma, J Clin Oncol 26(36):5896–5903 Realizouse a entrega mediada por electroporación dun xene de plásmido codificante para a interleucina-12 (pIL-12) e monitorizáronse a seguridade, a tolerabilidade e os efectos terapéuticos. O estudo concluíu, que a electrotransferencia de xenes con pIL-12 é segura e ben tolerada. Ademais, a resposta completa ou parcial observouse tamén en metástases distantes e non tratadas, o que suxire un efecto de tratamento sistémico. Baseándose nestes resultados xa está planeado pasar aos estudos clínicos en fase II. Actualmente están en marcha varios estudos clínicos de electrotransferencia de xenes,http://clinicaltrials.gov nos que se monitoriza a seguridade, tolerabilidade e efectividade da inmunización cunha vacina de ADN, que é administrada por pulsos eléctricos.

Aínda que o método non é sistémico senón estritamente local, é a estratexia non viral máis eficaz para a entrega de xenes.

 N-TIRE 

Unha técnica recente chamada electroporación irreversible non térmica (N-TIRE) tivo éxito no tratamento de moitos tipos de tumores e outros tecidos non desexados. Este procedemento faise usando pequenos eléctrodos (de 1mm de diámetro), situados dentro ou arredor do tecido diana para aplicar curtos e repetitivos disparos de electricidade a unha voltaxe e frecuencia predeterminada. Estes disparos de electricidade incrementan o potencial transmembrana en repouso, para que se formen nanoporos na membrana plasmática. Cando se aplica a electricidade aos tecidos por riba do limiar do campo eléctrico do tecido diana, as células vólvense permanentemente permeables debido á formación de nanoporos. Como resultado, as células non poden reparar os danos e morren debido á perda de homeostase. N-TIRE é única entre as técnicas de extirpación de tumores porque non crea danos termais ao tecido de arredor.

 Electroporación reversible 

En contraste co anterior, a electroporación reversible ocorre cando a electricidade aplicada cos eléctrodos está por debaixo do limair do campo eléctrico do tecido diana. Como a electricidade aplicada está por debaixo do limiar das células, permite que as células reparen a súa bicapa de fosfolípidos e continúen coas súas funcións celulares normais. A electroporación reversible faise tipicamente con tratamentos que implican a captación dun fármaco ou xene (ou outras moléculas para as que a membrana da célula non é normalmente permeable) cara ao interior da célula. Non todos os tecidos teñen o mesmo limiar de campo eléctrico; polo que cómpre facer cálculos coidadosos antes dun tratamento para garantir a seguridade e eficacia.

Unha vantaxe principal de usar N-TIRE é que, cando se fai correctamente de acordo con cálculos coidadosos, só afecta o tecido diana. As proteínas, a matriz extracelular e as estruturas críticas como os vasos sanguíneos e nervios non quedan afectadas e seguen en boas condicións despois do tratamento. Isto permite unha rápida recuperación e facilita unha substitución máis rápida das células tumorais mortas por células sas.

Antes de facer o procedemento, os científicos deben calcular con coidado exactamente o que se necesita facer para tatar cada paciente individualizadamente caso por caso. Para facelo, a tecnoloxía de obtención de imaxes máis usada para obter imaxes en 3D do tumor son os escáneres de tomografía computadorizada e as imaxes de resonancia magnética. A partir desta información, poden estimar aproximadamente o volme do tumor e decidir sobre o mellor procedemento, como o mellor sitio de inserción dos eléctrodos, o ángulo en que deber ser inseridos, a voltaxe que se necesitará, e máis aspectos, usando tecnoloxía de software. A miúdo, úsase unha máquina de tomografía computadorizada para axudar á colocación dos eléctrodos no sitio axeitado durante este procedemento, especialmente cando os eléctrodos están sendo usados para tratar tumores no cerebro.

O procedemento completo é moi rápido e normalmente tarda uns cinco minutos. A taxa de éxitos destes procedementos é alta e moi prometedora para futuros tratamentos en humanos. Unha desvantaxe de usar N-TIRE é que a electricidade transportrada polos eléctrodos pode estimular as células musculares, que se contraen, o que podería ter consecuencias mortais dependendo da situación. Por tanto, cando se realiza o procedemento debe usarse un axente paralítico. Os axentes paralíticos que se teñen usado en investigacións son efectivos; porén, sempre hai algún risco, aínda que lixeiro, cando se usan anestésicos.

 H-FIRE 

Unha técnica que se desenvolveu máis recentemente chámase electroporación de alta frecuencia (H-FIRE). Esta técnica usa eléctrodos para aplicar disparos bipolares de electricidade a unha alta frecuencia, ao revés que os disparos unipolares de electricidade a unha baixa frecuencia. Este tipo de procedemento ten o mesmo éxito na extirpación de tumores que a N-TIRE. Porén, ten unha clara vantaxe, a H-FIRE non causa a contracción muscular no paciente e, por tanto, non hai necesidade de aplicar un axente paralítico.

 Entrega de xenes e fármacos 

A electroporación pode usarse tamén para axudar a entregar fármacos ou xenes á célula aplicando pulsos eléctricos curtos e intensos que permeabilizan transitoriamente a membrana celular, permitindo así o transporte de moléculas que doutro modo non serían transportadas a través da membrana celular. Este procedemento denominase electroquimioterapia cando as moléculas que van ser transportadas son axentes quimioterápicos, ou electrotransferencia de xenes cando a molécula a ser transportada é o ADN. Os científicos do Instituto Karolinska e a Universidade de Oxford usan a electroporación de exosomas para entregar ARN interferente pequeno, oligonucleótidos antisentido, axentes qimioterapéuticos e proteínas especificamente a neuronas despois de inxectalas sistemicamente (no sangue). Como estes exosomas poden cruzar a barreira hematoencefálica, este protocolo podería resolver o problema da mala capacidade de entrega de medicamentos no sistema nervioso central, e potencialmente tratar o alzhéimer, o párkinson e o cancro de cerebro, entre outras condicións.

A transformación bacteriana é xeralmente o modo máis doado de fabricar grandes cantidades dunha determinada proteína necesaria para propósitos biotecnolóxicos ou en medicina. Como a electrotransferencia de xenes é unha técnica moi simple, rápida e moi efectiva, converteuse nun substituto moi conveniente doutros procedementos de tansformación.Calvin NM, Hanawalt PC (1988). High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation, J Bacteriol 170:2796-801

 Mecanismo físico 

miniatura|250px|Sección transversal esquemática que mostra a disposición teórica de lípidos nun poro hidrófobo (arriba) e nun poro hidrófilo (abaixo).
A electroporación permite a introdución na célula de grandes moléculas moi cargadas electricamente como o ADN, que nunca difundirían pasivamente a través da parte central da bicapa lipídica hidrofóbica. Este fenómeno indica que o mecanismo é a creación na membrana de buratos cheos de auga de escala nanométrica. Aínda que a electroporación e a rotura dieléctrica orixínanse ambas da aplicación dun campo eléctrico, os mecanismos implicados son fundamentalmente diferentes. Na rotura dieléctrica o material barreira está ionizado, creando unha vía condutora. A alteración do material é, pois, de natureza química. A diferenza disto, durante a electroporación as moléculas lipídicas non se alteran quimicamente senón que simplemente cambian de posición, abrindo un poro que actúa como vía condutora a través da bicapa, xa que está cheo de auga.

A electroporación é un fenómeno dinámico que depende da voltaxe transmembrana local en cada punto da membrana plasmática. Acéptase xeralmente que para unha determinada duración e forma dun pulso, existe un limiar de voltaxe transmembrana específico para a manifestación do fenómeno da electroporación (de 0,5 V a 1 V). Isto leva á definición dun limiar da magnitude do campo eléctrico para a electroporación (Eth). É dicir, só as células dentro da área na que E≧Eth son electroporadas. Se se chega ou supera un segundo limiar (Eir), a electroporación comprometerá a viabilidade da célula e denomínase electroporación irreversible.

A electroporación é un proceso de múltiples pasos e con varias fases. Primeiro, debe aplicarse un curto pulso eléctrico. Os parámetros típicos serían 300–400 mV para < 1 ms a través da membrana (nótese que as voltaxes usadas en experimentos celulares son normalmente moito máis grandes porque se aplican a través de grandes distancias a unha solución voluminosa, polo que o campo resultante a través da membrana real é só unha pequena fracción da polaridade aplicada). Coa aplicación deste potencial a membrana cárgase como un capacitador pola migración de ións da solución que a rodea. Unha vez que se chega ao campo crítico hai un rearranxo rápido localizado na morfoloxía lipídica. A estrutura resultante crese que é un "pre-poro", xa que non é condutora electricamente, pero leva rapidamente á creación dun poro condutor. As probas da existencia de tales pre-poros proceden principalmente dos poros "intermitentes", o que indica unha transición enre os estados condutor e illante. Sinalouse que estes pre-poros son pequenos (~3 Å) defectos hidrofóbicos. Se esta teoría é correcta, entón a transición a un estado condutor podería explicarse polo rearranxo da beira do poro, na cal as cabezas das moléculas lipidicas se dobran para crear unha interface hidrófila. Finalmente, estes poros condutores poden desaparecer, volvendo a selar a bicapa, ou expandirse, rompéndoa finalmente. O resultado dependerá de se se excedeu o tamaño do defecto crítico, o cal á súa vex dependerá do campo aplicado, o estrés mecánico local e a enerxía do bordo da bicapa.

 Electrotransferencia 
miniatura|900px|Electrotransferencia de xenes.
A aplicación de pulsos eléctricos á célula de suficiente forza como para causar un incremento na diferenza de potencial transmembrana, provoca a desestabilización da membrana. A permeabilidae da membrana celular increméntase e moléculas que doutro modo non serían permeantes poden agora entrar na célula.Kotnik T, Miklavcic D (2000). Analytical description of transmembrane voltage induced by electric fields on spheroidal cells, Biophys J 79:670-679 Aínda que os mecanismos da electrotransferencia de xenes non se comprenden totalmente, observouse que a introdución de ADN só ocorre na parte da membrana que está fronte ao cátodo e que cómpren varios pasos para unha transfección con éxito, que son: migración electroforética do ADN cara á célula, inserción do ADN na membrana, translocación a través da membrana, migración do ADN cara ao núcleo, transferencia do ADN a través da envoltura nuclear e finalmente a expresión xénica.Satkauskas S, Bureau MF, Puc M, Mahfoudi A, Scherman D, Miklavcic D, Mir LM (2002). Mechanisms of in vivo DNA electrotransfer: respective contributions of cell electropermeabilization and DNA electrophoresis, Mol Ther 5:133-140 Hai varios factores que poden influír na eficacia da electrotransferencia de xenes, como son: temperatura, parámetros dos pulsos eléctricos, concentración do ADN, tampón de electroporación usado, tamaño das células e capacidade das células de expresar xenes transfectados.Gehl J (2003). Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research, Acta Physiol Scand 177:437-447 Na electrotransferencia de xenes in vivo tamén son cruciais a difusión do ADN a través da matriz extracelular, as propiedades do tecido e a condutividade global do tecido.Miklavcic D, Beravs K, Semrov D, Miklavcic D, Cemazar M, Demsar F, Sersa G (1998). The importance of electric field distribution for effective in vivo electroporation of tissues, Biophys J 74:2152–2158

 Historia 
A electrotransferencia de xenes describiuse primeiro na década de 1980Neumann E, Schaefer-Ridder M, Wang Y, Hofschneider PH (1982). Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields, EMBO J 7:841-845 e desde entón debido á súa facilidade de aplicación e eficiencia converteuse nun método de rotina para introducir xenes alleos en células bacterianas,Drury L (1996). Transformation of bacteria by electroporation, Methods Mol Biol 58: 249-256 de lévedos,Simon JR (1993). Transformation of intact yeast cells by electroporation, Methods Enzymol 217:478-483 plantas,Terzaghi WB, Cashmore AR (1997). Plant cell transfection by electroporation, Methods Mol Biol 62:453-462 e animaisKanduser M, Miklavcic D, Pavlin M (2009). Mechanisms involved in gene electrotransfer using high- and low-voltage pulses -An in vitro study, Bioelectrochemistry 74:265-271 in vitro e en diferentes tecidos, como o muscular,Aihara H, Miyazaki J (1998). Gene transfer into muscle by electroporation in vivo, Nat Biotechnol 16:867-870 tumoral,Cemazar M, Sersa G, Wilson J, Tozer GM, Hart SL, Grosel A, Dachs GU (2002). Effective gene transfer to solid tumors using different nonviral gene delivery techniques: Electroporation, liposomes, and integrin-targeted vector, Cancer Gene Ther 9:399-406 hepático,Heller R, Jaroszeski M, Atkin A, Moradpour D, Gilbert R, Wands J, Nicolau C (1996). In vivo gene electroinjection and expression in rat liver, FEBS Lett 389:225-228 e cutáneoPavselj N, Preat V (2005). DNA electrotransfer into the skin using a combination of one high- and one low-voltage pulse, J Control. Release 106:407-415 in vivo.

 Notas 

Categoría:Biotecnoloxía
Categoría:Bioloxía molecular
Categoría:Técnicas de bioloxía molecular
Categoría:Microbioloxía