Inmunoelectroforese

miniatura|Inmunoelectroforese de foguete fundido dunha separación cromatográfica de afinidade de proteínas de soro humano en  ConA. Unha mostra de 15 microlitros de cada fracción é aplicada (empezando desde a esquerda) e déixase difundir durante unha hora, despois a electroforese realízase durante a noite. O pico "a" non é retido, o pico "b" é retido e eluído con metilmanosa, a frecha indica algunhas proteínas lixeiramente retidas.

A inmunoelectroforese é un nome xeral aplicado a varios métodos bioquímicos para a separación e a caracterización de proteínas baseados na electroforese e a reacción con anticorpos. Todas as variantes de inmunoelectroforese requiren inmunoglobulinas (anticorpos), que reaccionan coas proteínas para que sexan separadas ou caracterizadas. Os métodos foron desenvolvidos e usados extensamente durante a segunda metade do século XX. Por orde case cronolóxica apareceron os métodos seguintes: análise inmunoelectroforética (inmunoelectroforese unidimensional ad modum Grabar), inmunoelectroforese cruzada (inmunoelectroforese cuantitativa bidimensional ad modum Clarke e Freeman ou ad modum Laurell), inmunoelectroforese foguete (inmunoelectroforese cuantitativa unidimensional ad modum Laurell), inmunoelectroforese foguete fundido ad modum Svendsen e Harboe, inmunoelectroforese de afinidade ad modum Bøg-Hansen.

A agarosa en láminas de xel ao 1% de aproximadamente 1 mm de grosor tamponadas a alto pH (arredor de 8,6) é o material tradicionalmente preferido para a electroforese con reacción con anticorpos. A agarosa foi elixida como matriz do xel porque ten grandes poros que permiten o libre paso e separación das proteínas, pero proporciona á vez unha áncora para os inmunoprecipitados de proteínas e anticorpos específicos. Realízase a un pH alto porque os anticorpos son practicamente inmóbiles a alto pH. Recoméndase xeralmente un equipo de electroforese cunha placa de arrefriamento horizontal.

Os inmunoprecipitados poden observarse no xel de agarosa húmido, pero son tinguidos con colorantes para as proteínas como o Azul Brillante Coomassie no xel seco. En contraste coa SDS-electroforese en xel, a electroforese en agarosa permite manter as condicións nativas, conservando a estrutura nativa e as actividades das proteínas en investigación, por tanto, a inmunoelectroforese permite a caracterización de actividades encimáticas, de unión a ligandos etc., ademais da separacion electroforética.

 Tipos 
A análise inmunoelectroforética ad modum Grabar é o método clásico de inmunoelectroforese. As proteínas son separadas por electroforese, despois aplícanse os anticorpos nun suco próximo ás proteínas separadas e fórmanse inmunoprecipitados despois dun período de difusión das proteínas separadas e anticorpos. A introdución da análise inmunoelectroforética deu un gran pulo á química de proteínas, algúns dos primeiros resultados foron a resolución de proteínas en fluídos biolóxicos e extractos biolóxicos. Entre as importantes observacións feitas estiveron a caracterización do gran número de proteínas diferentes do soro, a existencia de varias clases de inmunoglobulinas e a súa heteroxeneidade electroforética.

miniatura|esquerda|A glutamato deshidroxenase (pGluDH) de Plasmodium separada por contrainmunoelectroforese

A inmunoelectroforese cruzada tamén se chama inmunoelectroforese cuantitativa bidimensional ad modum Clarke e Freeman ou ad modum Laurell. Neste método as proteínas son primeiramente separadas durante a electroforese de primeira dimensión, despois en vez da difusión cara aos anticorpos, as proteínas son sometidas a electroforese nun xel que contén anticorpos na segunda dimensión. A inmunoprecipitación terá lugar durante a electroforese de segunda dimensión e os inmunoprecipitados teñen unha característica forma de campá, na que cada precipitado representa un antíxeno; a posición dos precipitados é dependente da cantidade das proteínas así como da cantidade de anticorpos específicos no xel, polo que pode realizarse a cuantificación relativa. A sensibilidade e poder de resolución da inmunoelectroforese cruzada é como o da análise inmunoelectroforética clásica e hai múltiples variacións da técnica útiles para varios propósitos. A inmunoelectroforese cruzada foi utilizada para estudos de proteínas en fluídos biolóxicos, particularmente no soro humano, e extractos biolóxicos.

A inmunoelectroforese foguete é unha inmunoelectroforese cuantitativa unidimensional. O método foi utilizado para a cuantificación de proteínas do soro humano antes de que aparecesen os métodos automatizados.

A inmunoelectroforese foguete fusionada é unha modificación dunha inmunoelectroforese cuantitativa unidimensional usada para unha medida detallada de proteínas en fraccións procedentes dos experimentos de separación de proteínas.

A inmunoelectroforese de afinidade está basedada en cambios no padrón electroforético de proteínas por medio de interaccións específicas ou formación de complexos con outras macromoléculas ou ligandos. A inmunoelectroforese de afinidade foi utilizada para a estimación das constantes de unión, como por exemplo coas lectinas ou a caracterización de proteínas con características específicas como conter glicanos ou unión a ligandos. Algunhas variantes da inmunoelectroforese de afinidade son similares á cromatografía de afinidade no uso de ligandos inmobilizados.

A estrutura aberta do inmunoprecipitado no xel de agarosa permite a unión adicional de anticorpos marcados radioactivamente para revelar proteínas específicas. Esta variación foi utilizada para a identificación de alerxias por reacción con IgE.

 Uso actual 
Dous factores detererminan que os métodos inmunoelectroforéticos non se utilicen amplamente. O primeiro é que  dan moito traballo e requiren certa experteza manual. O segundo é que necesitan cantidades bastante grandes de anticorpos policlonais. Hoxe a electroforese en xel seguida de electroblotting é o método preferido para a caracterización de proteínas debido á súa facilidade de operación, a súa alta sensibilidade e o seu baixo requirimento de anticorpos específicos. Ademais, as proteínas son separadas por electroforese en xel baseándose no seu peso molecular aparente, que non é realizado por inmunoelectroforese, pero, non obstante, os métodos inmunoelectroforéticos son aínda útiles cando se necesitan condicións non redutoras.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Ligazóns externas 
 Texto amplo editado por Niels H. Axelsen no Scandinavian Journal of Immunology, 1975 Volume 4 Suplemento

 https://web.archive.org/web/20070612225626/http://www.lib.mcg.edu/edu/esimmuno/ch4/immelec.htm
  Inmunoelectroforese. Inmunodifusión 

Categoría:Técnicas de bioloxía molecular
Categoría:Electroforese
Categoría:Probas inmunolóxicas