XRCC4

A proteína XRCC4 (do inglés X-ray repair cross-complementing protein 4, proteína 4 de complementación cruzada de reparación dos raios X), tamén chamada proteína de reparación do ADN XRCC4, é unha proteína que nos humanos está codificada no xene XRCC4 do cromosoma 5. Ademais de nos humanos, esta proteína exprésase tamén na maioría dos demais metazoos, fungos e plantas. A XRCC4 é unha das varias proteínas fundamentais que interveñen na vía da unión de extremos non homólogos (NHEJ) de reparación do ADN, que corrixe as roturas de dobre febra no ADN.

A unión de extremos non homólogos require dous compoñentes principais para conseguir completarse con éxito. O primeiro compoñente é a unión cooperativa e fosforilación de Artemis pola subunidade catalítica da proteína quinase dependente do ADN (DNA-PKcs). Artemis cliva os extremos do ADN danado para preparalo para a ligazón. O segundo compoñente implica a extensión da XRCC4 sobre o ADN para permitir a toma de contacto da ADN ligase IV (LigIV), feita coa axuda da proteína Cernunnos-XLF. A DNA-PKcs e XRCC4 están ancoradas ao heterodímero Ku70 / Ku80, que está unido aos extremos do ADN.

Como XRCC4 é a proteína clave que permite a interacción da LigIV co ADN danado e, por tanto, a ligazón dos extremos, as mutacións no xene XRCC4 causan letalidade embrionaria en ratos e inhibición do desenvolvemento e inmunodeficiencia en humanos. Ademais, certas mutacións no xene XRCC4 están asociadas cun incremento do risco de cancro.

 Roturas de dobre febra no ADN 

As roturas de dobre febra son causadas principalmente por radicais libres xerados por radiacións ionizantes no ambiente e a partir de subprodutos liberados de forma continua durante o metabolismo celular.  As roturas de dobre febra que non son debidamente reparadas poden orixinar unha perda de xenes que codifican importantes proteínas e secuencias reguladoras que cómpren para a expresión xénica imprescindible para a vida da célula. As roturas de dobre febra que non poden utilizar un cromosoma irmán de nova copia xerado durante a replicación do ADN para encher o oco creado, utilizan a vía da unión de extremos non homólogos. Este método de reparación é esencial porque é o último recurso para impedir a perda de longos tramos dun cromosoma.  A unión de extremos non homólogos utilízase tamén para reparar roturas de dobre hélice xeradas durante a recombinación V(D)J cando algunhas rexións xénicas son redistribuídas para crear os sitios de unión exclusivos para un antíxeno dos anticorpos e receptores de células T.

 Fontes de danos no ADN 

Os danos no ADN ocorren moi frecuentemente e xéranse pola exposición a varios axentes xenotóxicos exóxenos e endóxenos. Un deles é a radiación ionizante, como a radiación γ e os raios X, que ionizan os grupos desoxirribosa no esqueleto do ADN e poden inducir roturas de dobre febra. As especies reactivas do oxíxeno, como o superóxido (O2–), peróxido de hidróxeno (H2O2), radicais hidroxilo (HO•), e oxíxeno singlete (1O2), poden producir roturas de dobre febra como resultado da radiación ionizante ou de procesos metabólicos naturais. As roturas de dobre febra poden ser causadas tamén pola acción da ADN polimerase, mentres a célula se intenta replicar o ADN ao longo dunha amosega que foi introducida como resultado dun dano no ADN.

 Consecuencias das roturas de dobre febra 

Hai moitos tipos de danos no ADN, pero as roturas de dobre febra, son as máis nocivas, xa que ambas as febras están completamente separadas do resto do cromosoma. Se non hai un mecanismo de reparación eficiente, os extremos do ADN poden finalmente degradarse, orixinando unha perda permanente de secuencia. Un oco de dobre febra no ADN impide tamén que avance a replicación do ADN, o que ten como resultado a formación dunha copia incompleta dun determinado cromosoma, o que marca a célula para a apoptose. Como ocorre con todos os danos no ADN, as roturas de dobre febra poden introducir novas mutacións, que finalmente poden conducir ao desenvolvemento dun cancro.

 Métodos de reparación de roturas de dobre febra 

Hai dous métodos de reparar as roturas de dobre febra dependendo de cando se produce o dano durante a mitose. Se ocorre unha rotura de dobre febra despois de que se completase a replicación do ADN na fase S do ciclo celular, a vía de reparación das roturas de dobre febra utilizará a recombinación homóloga para aparearse coa febra filla de nova síntese e reparar a rotura. Porén, se a rotura de dobre febra se xera antes da síntese do cromosoma irmán, entón a secuencia molde que é necesaria estará ausente. Non obstante, a vía da unión de extremos non homólogos proporciona unha solución para reparar a rotura e é o principal sistema utilizado para reparar as roturas de dobre febra en humanos e eucariotas multicelulares. Durante a unión de extremos non homólogos, hibrídanse tramos moi curtos de ADN complementario, de 1 bp ou máis á vez, e os colgantes que sobran son eliminados. Como resultado, esta rexión concreta do xenoma pérdese de forma permanente e a deleción pode orixinar un cancro ou o envellecemento prematuro.

 Propiedades 

 Xene e proteína 

O xene humano XRCC4 está localizado no cromosoma 5, na banda 5q14.2. Contén oito exóns e tres variantes de transcrición de ARNm, que codifican dúas isoformas proteicas. A variante de transcrición 1, que é o ARNm RefSeq NM_003401.3, ten 1688 pares de bases de longo e é o máis curto das tres variantes. Perdeu unha secuencia curta na rexión codificante 3’ en comparación coa variante 2.  A isoforma 1 contén 334 aminoácidos. A variante de transcrición 2, que é o ARNm RefSeq NM_022406, ten 1694 pares de bases e codifica a isoforma máis longa, de 336 aminoácidos. A variante de transcrición 3, ou ARNm RefSeq NM_022550.2, ten 1735 pares de bases (o ARNm máis longo), pero tamén codifica a mesma isoforma 1 que a variante 1, e contén unha secuencia adicional no 5' UTR do transcrito de ARNm e carece da secuencia curta da rexión codificante 3' comparada coa variante 2.

 Estrutura 

A proteína XRCC4 é un tetrámero que lembra a forma dunha pesa que contén dous extremos globulares separados por un talo longo e delgado. O tetrámero está composto por dous dímeros, e cada dímero está feito de dúas subunidades proteícas similares. A primeira subunidade (L) contén 203 residuos de aminoácidos e ten un talo máis longo que a segunda subunidade (S), que contén 178 residuos.

Os dominios globulares N-teminais de cada subunidade son idénticos. Están feitos de dúas follas beta antiparalelas que están enfrontadas entre si formando unha estrutura en sándwich beta (é dicir, un barril beta "aplanado") e están separadas por dúas hélices alfa nun lado. O N-terminal empeza cunha folla beta composta das febras 1, 2, 3 e 4, seguida dun motivo hélice-xiro-hélice das dúas hélices alfa, αA e αB, que continúa nas febras 5, 6, 7 e finaliza cun talo en hélice alfa no C-terminal. As hélices αA e αB son perpendiculares entre si, e como un extremo de αB está parcialmente inserido entre as dúas follas beta, causa que destaque. A estrutura en sándwich beta mantense xunta por medio de tres enlaces de hidróxeno entre as febras antiparalelas 4 e 7 e un enlace de hidróxeno entre as febras 1 e 5.

Os dous talos helicoidais entre as subunidades L e S entrelázanse cun só cruzamento levoxiro nunha hélice superenrolada na parte superior, preto dos dominios globulares formando unha configuración en palmeira. Esta rexión interacciona coas dúas hélices alfa do segundo dímero nunha orientación oposta para formar un feixe de catro hélices e o tetrámero con forma de pesa.

 Modificacións postraducionais 

Para que XRCC4 do citoplasma sexa secuestrado ao núcleo para reparar as roturas de dobre febra durante a unión de extremos non homólogos ou para completar a recombinación V(D)J, é necesario que se produza unha modificación postraducional na lisina 210 (K210) cun pequeno modificador relacionado coa ubiquitina (SUMO) ou sumoilación. A modificación SUMO de diversos tipos de proteínas de reparación do ADN pode observarse en topoisomerases, a glicosilase de escisión de bases TDG, a Ku70/80 e a helicase BLM. Un motivo conservado común que é normalmente a diana das modificacións SUMO é ΨKXE (onde Ψ é un aminoácido hidrófobo voluminoso). No caso da proteína XRCC4, a secuencia consenso que rodea a lisina 210 é IKQE. As células de ovario de hámster chinés, CHO, que expresan a forma mutada de XRCC4 en K210 non poden ser modificadas con SUMO, e non se produce o seu recrutamento no núcleo, polo que se  e acumulan no citoplasma. Ademais, estas células son sensibles á radiación e non completan correctamente a recombinación V(D)J.

 Interaccións 
miniatura|Interacción de XRCC4 con outros compoñentes do complexo da unión de extremos non homólogos

Despois da xeración dunha rotura de dobre febra, as proteínas Ku móvense polo citoplasma ata que chegan ao sitio da rotura e únense a el. Ku recruta XRCC4 e o Cer-XLF e ambas as proteínas interaccionan cooperativamente entre si por medio de residuos específicos para formar un complexo nucleoproteico que se envolve arredor do ADN. Cer-XLF é un homodímero que é moi similar a XRCC4 na estrutura e tamaño dos seus dominios N-terminal e C-terminal. Os residuos arxinina 64, leucina 65, e leucina 115 de Cer-XLF interaccionan coas lisinas 65 e 99 de XRCC4 dentro dos seus dominios N-terminais. Xuntos forman un feixe de filamentos que se envolve arredor do ADN nun padrón alternante. A hiperfosforilación dos dominios C-terminais en hélice alfa de XRCC4 feita por DNA-PKcs facilita esta interacción. O dímero XRCC4 únese a un segundo dímero na febra do ADN adxacente para crear un tetrámero para estenderse sobre o ADN roto no inicio da unión de extremos non homólogos. Antes da ligazón, Lig IV únese ao talo C-terminal de XRCC4 no sitio da rotura e despraza o segundo dímero XRCC4. O dominio BRCT2 de Lig IV establece enlaces de hidróxeno con XRCC4 neste dominio entre múltiples residuos e introduce unha retorcedura nas dúas colas de hélice alfa. A abrazadeira hélice-bucle-hélice conectada ao linker BRCT tamén fai un extenso contacto.

 Mecanismo 

 Unión de extremos non homólogos 

No proceso de unión de extremos non homólogos (NHEJ) intervén XRCC4 e varias proteínas estreitamente acopladas que actúan en concerto para reparar as roturas de dobre febra. O sistema empeza coa unión dunha proteína heterodímera chamada Ku70/80 en cada extremo das roturas de dobre febra para mantelas xuntas en preparación para a súa ligazón covalente e impedir a súa degradación. Despois, Ku70/80 secuestra unha subunidade catalítica de proteína quinase dependente de ADN (DNA-PKcs) nos extremos do ADN para permitir a unión da proteína Artemis a un extremo de cada DNA-PKcs. Un extremo da DNA-PKcs únese para estabilizar a zona próxima ás roturas de dobre febra e permitir que se hibriden rexións moi curtas de ADN complementario. A DNA-PKcs fosforila despois Artemis nunha serina/treonina para activar a súa actividade de exonuclease e cliva nucleótidos nas colas de febra simple que non están hibridadas en dirección 5' a 3'. Dúas proteínas XRCC4 son modificadas postraducionalmente para o recoñecemento e localización de Ku70/80 (5). As dúas proteínas XRCC4 dimerízanse e únense a Ku70/80 nos extremos das febras do ADN para promover a ligazón. O XRCC4 forma despois un forte complexo coa ADN ligase IV (LigIV), que é potenciada polo factor similar a XRCC4 Cernunnos, Cer-XLF.  Cer-XLF só se une a XRCC4 sen interacción directa con LigIV. Despois, a LigIV une os extremos do ADN ao catalizar un enlace fosfodiéster covalente.

 Recombinación V(D)J 

A recombinación V(D)J é o rearranxo de moitos segmentos xénicos distintos no ADN da liña xerminal para producir os dominios proteicos únicos das células inmunitarias B e T, que recoñecen especificamente antíxenos alleos como virus, bacterias e eucariotas patóxenos. As células B producen anticorpos que son segregados ao torrente sanguíneo e as células T producen receptores que unha vez traducidos son transportados á superficie exterior da bicapa lipídica da célula. Os anticorpos están compostos por dúas cadeas pesadas e lixeiras. O sitio de unión ao antíxeno consta de dúas rexións variables, VL e VH. O resto da estrutura do anticorpo consta das rexións constantes, CL, CH, CH2 e CH3. O locus Kappa no rato codifica unha cadea lixeira de anticorpo e contén aproximadamente 300 segmentos xénicos na rexión variable, V, catro segmentos J que codifican unha curta rexión da proteína, e un segmento constante C. Para producir unha cadea lixeira cun único tipo de VL, cando as células B se están diferenciando, o ADN rearránxase ara incorporar unha combinación única dos segmentos V e J. O empalme do ARN une a rexión recombinada co segmento C. O xene da cadea pesada tamén contén numerosos segmentos de diversidade, D, e múltiples segmentos constantes, Cμ, Cδ, Cγ, Cε, Cα. A recombinación xenética ten lugar nunha rexión específica do xene que está localizada entre dous motivos de secuencia conservados chamados secuencias de sinal de recombinación. Cada motivo está flanqueado por unha secuencia de 7 bp e 9 bp que está separada por un espazador de 12 bp, denominado de clase I, ou por un espazador de 23 bp, denominado de clase 2. Unha recombinase constituída polas subunidades RAG1 e RAG2 sempre cliva entre estes dous sitios. A clivaxe ten como resultado a formación de dúas estruturas en forquita para os segmentos V e J, respectivamente, e a rexión non codificante está agora separada dos segmentos V e J por unha rotura de dobre febra. A rexión codificante da forquita sofre o proceso da unión de extremos non homólogos, na que o extremo pechado é clivado e reparado. A rexión non codificante é circularizada e degradada. Así, a unión de extremos non homólogos é tamén importante no desenvolvemento do sistema inmunitario polo seu papel na recombinación V(D)J.

 Patoloxía 

Estudos recentes indican que hai unha asociación entre XRCC4 e a susceptibilidade potencial a varias patoloxías. A ligazón máis frecuentemente atopada é entre as mutacións en XRCC4 e a susceptibilidade a cancros como o cancro de vexiga, de mama e linfomas. Os estudos tamén sinalaron unha ligazón entre as mutacións en XRCC4 e a endometriose. A autoinmunidade é tamén estudada a este respecto. A ligazón entre as mutacións en XRCC4 e certas patoloxías pode proporcionar unha base para biomarcadores de diagnóstico e o desenvolvemento potencial final de novas terapéuticas.

 Susceptibilidade ao cancro 

Os polimorfismos de XRCC4 foron ligados a un risco de susceptibilidade para os cancros, como o cancro de vexiga, cancro de mama, cancro de próstata, carcinoma hepatocelular, linfomas e mieloma múltiple. Con respecto ao cancro de vexiga, por exemplo, a ligazón entre XRCC4 e a susceptibilidade ao cancro estaba baseada en estudos histolóxicos de casos de control hospitalarios de variantes xénicas de XRCC4 e XRCC3 e as súas posibles asociacións co risco do cancro de vexiga urotelial. Atopouse unha ligazón co risco de cancro de vexiga urotelial para XRCC4, pero non para XRCC3 En canto ao cancro de mama, a ligazón cun "incremento do risco de cancro de mama" estaba baseada nun exame de polimorfismos funcionais do xene XRCC4 levada a cabo en conexión cunha metaanálise de cinco estudos de casos control. Hai tamén polo menos un estudo histolóxico dun caso control hospitalario, indicando que os polimorfismos no XRCC4 pode ter unha "influencia" na susceptibilidade do cancro de próstata. A deleción condicional (mediada por CD21-cre) do xene XRCC4 en células B de ratos deficientes en p53 tiña como resultado linfomas de células B que eran Ig negativos en superficie, e estes linfomas a miúdo tiñan unha "translocación cromosómica recíproca" fusionando IgH a Myc (e tamén tiñan "grandes delecións cromosómicas ou translocacións" que afectaban a IgK ou a IgL, e IgL "fusionábase" a oncoxenes ou a IgH). Os linfomas pro-B deficientes en XRCC4 e p53 "activan rutineiramente c-myc por amplificación xénica"; e ademais, hai que salientar que os linfomas de céulas B periféricas deficientes en XRCC4 e p53 "acivan ectopicamente de forma rutineira" unha soa copia de c-myc. En vista da observación dalgúns autores de que “os encimas de reparación do ADN son correctores dos danos no ADN inducidos por carcinóxenos e fármacos anticancro”, non é sorprendente pensar que os “SNPs en xenes de reparación do ADN poden xogar un papel importante” na susceptibilidade ao cancro. Ademais dos cancros identificados máis arriba, os polimorfismos en XRCC4 foron identificados como unha ligazón potencial con varios cancros adicionais como o cancro oral, de pulmón, gástrico e gliomas.

 Senescencia 

A diminución da capacidade de reparar as roturas de dobre febra no ADN por medio de unión de extremos non homólogos pode ser un factor significativo no proceso de envellecemento. Li et al. encontraron que nos humanos a eficiencia na reparación por unión de extremos non homólogos declina desde os 16 aos 75 anos. O seu estudo indicou que a diminución na expresión de XRCC4 e outras proteínas de unión de extremos non homólogos orixina un declive asociado á idade na eficiencia e fidelidade da unión de extremos non homólogos. Os autores suxeriron que o declive relacionado coa idade na expresión de XRCC4 pode contribuír á senescencia celular.

 Autoinmunidade 

Baseándose nos descubrimentos seguintes: (1) varios polipéptidos da vía de unión de extremos non homólogos son "dianas potenciais de autoanticorpos", e (2) "un dos epítopos autoinmunes de XRCC4 coincide coa secuencia que é un nexo para os eventos reguladores inducidos pola radiación", suxeriuse que a exposición a axentes que introducen roturas de dobre febra no ADN "pode ser un dos factores" que median as respostas autoinmunes.

 Susceptibilidade á endometriose 
Especulouse que "os xenotipos e alelos relacionados co codón de XRCC4 247*A e o promotor 1394*T de XRCC4 . . . poderían ser asociados cunha maior susceptibilidade á endometriose e patoxénese".

 Potencialidade como biomarcador do cancro 

En vista das posibles asociacións dos polimorfismos de XRCC4 coa susceptibilidade ao cancro (ver discusión máis arriba), XRCC4 podería ser utilizado como un biomarcador para o cribado do cancro, particularmente con respecto ao cancro de próstata, de mama e de vexiga. De feito, os polimorfismos de XRCC4 foron identificados especificamente como características co potencial de ser novos marcadores útiles para a "prevención primaria e intervención anticancro" no caso do cancro de vexiga urotelial.

 Radiosensibilización de células tumorais 

Dado o papel de XRCC4 na reparación de roturas de dobre febra, investigáronse as relacións entre a perda da función de XRCC4 e a radiosensibilización de células tumorais. Por exemplo, informouse que "a selección como dianas mediada por RNAi de secuencias codificantes e non codificantes en mensaxes de xenes de reparación do ADN radiosensibiliza eficientemente células tumorais humanas".

 Potencialidades terapéuticas 

Discutiuse na literatura sobre o papel potencial de XRCC4 no desenvolvemento de novas terapéuticas. Por exemplo, Wu et al. suxeriron que como o xene XRCC4 é "crítico no NHEJ" e está "positivamente asociado coa susceptibilidade ao cancro", algúns SNPs do XRCC4 como G-1394T (rs6869366) "pode servir como SNP común para a detectar e predicir varios cancros (ata agora para os cancros de mama, gástrico e de próstata . . .)"; e, aínda que son necesarias máis investigacións, "poden servir como dianas candidatas para fármacos anticancro personalizados". Tamén se mencionou a posibilidade de detección da endometriose por este método, e isto pode posiblemente levar ao desenvolvemento final de tratamentos. Ao avaliaren máis posibilidades de tratamentos anticancro, Wu et al. tamén comentaron na importancia de “cotratamentos de axentes que danan o ADN e radiacións”. Especificamente, Wu et al. sinalaron que o “balance entre os danos no ADN e a capacidade dos mecanismos de reparación do ADN determina o resultado terapéutico final” e “a capacidade das células cancerosas de completar os mecanismos de reparación do ADN é importante para a resistencia terapéutica e ten un impacto negativo sobre a eficacia terapéutica”, e así teorizaron que “a inhibición farmacolóxica de dianas recentemente detectadas da reparación do ADN con varios compostos de moléculas pequenas . . . ten o potencial de amplificar a citotoxicidade de axentes anticancro”.

 Ananismo primordial microcefálico 

En humanos, as mutacións no xene XRCC4 causan ananismo primordial microcefálico, un fenotipo caracterizado por unha marcada microcefalia, dismorfismo facial, atraso no desenvolvemento e estatura baixa. Aínda que a diversidade da unión das inmunoglobulinas está alterada, estes individuos non mostran un fenotipo inmunolóxico recoñecible. En contraste cos individuos cunha mutación LIG4, a pancitopenia resultante na insuficiencia de medula ósea non se observa en individuos con deficiencia de XRCC4. A nivel celular, a alteración de XRCC4 induce hipersensibilidade a axentes que inducen roturas de dobre febra, reparación defectiva de roturas de dobre febra e incremento da apoptose despois de danos no ADN.

 Anricorpos anti-XRCC4 

Desenvolvéronse anticorpos anti-XRCC4, como os anticorpos fosfoespecíficos para pS260 e pS318 en XRCC4.;  Os anticorpos para XRCC4 poden ter diversos usos, incluíndo os inmunoensaios para investigacións en áreas como os danos no ADN e a súa reparación, unión de extremos non homólogos, factores de transcrición, epixenética e sinalización nuclear.

 Historia 
As investigacións levadas a cabo na década de 1980 revelaron que un tipo de célula mutante de ovario de hámster chinés chamada XR-1 era "extremadamente sensible" a morrer cando era exposta a raios gamma durante a fase G1 do ciclo celular, pero, eses mesmos estudos mostraban que tiñan "unha resistencia case normal" aos danos por raios gamma durante o final da fase S; e no curso desta investigación, a sensibilidade no ciclo celular de XR-1 estaba correlacionada coa súa incapacidade de reparar as roturas de dobre febra no ADN producidas pola radiación ionizante e encimas de restrición. En particular, nun estudo usando híbridos de células somáticas de células XR-1 e fibroblastos humanos, Giaccia et al. (1989) demostraron que a mutación XR-1 era unha mutación recesiva; e para complementar eses traballos, Giaccia et al. (1990) levaron a cabo máis estudos nos que examinaron a mutación XR-1 (de novo usando híbridos de células somáticas formados entre células XR-1 e fibroblastos humanos) e conseguiron mapar o xene complementador humano no cromosoma 5 usando análise de segregación de cromosomas.  Giaccia et al, asignaron provisionalmente a este xene humano o nome “XRCC4” (siglas de “X-ray-complementing Chinese hamster gene 4”, xene 4 de hámster chinés complementador de raios X) e determinaron que (a) o xene agora chamado XRCC4 restauraba bioquimicamente os defectos no hámster aos niveis normais de resistencia á radiación de raios gamma e bleomicina e (b) o xene XRCC4 restauraba a eficiencia na reparación de roturas de dobre febra no ADN. Baseándose nestes descubrimentos, Giaccia et al. propuxo que o xene XRCC4 por si só era responsable do fenotipo XR-1.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Bibliografía 

















 Ligazóns externas 


Este artigo incorpora textos procedentes da United States National Library of Medicine, en dominio público.

Categoría:Proteínas
Categoría:Reparación do ADN