Reparación de discordancias no ADN

A reparación de discordancias no ADN (abreviada como MMR, do inglés mismatch repair) é un sistema para o recoñecemento e reparación da inserción errada, deleción, ou incorrecta incorporación e bases (sen respectar a complementariedade), que se pode orixinar durante a replicación do ADN e a recombinación, e tamén para a reparación dalgunhas formas de danos no ADN.

A reparación de discordancias é específica de febra. Durante a síntese de ADN a febra nova sintetizada (febra filla) incluirá comunmente erros. Para empezar a repararse, a maquinaria de reparación distingue a febra filla de nova síntese da febra molde (parental). En bacterias gramnegativas, a hemimetilación transitoria distingue as dúas febras, xa que a parental está metilada e a filla non. Porén, noutros procariotas e eucariotas, o mecanismo exacto non está claro. Sospéitase que, en eucariotas, a febra retardada do ADN de nova síntese contén transitoriamente amosegas (antes de que sexan seladas pola ADN ligase), o que proporciona un sinal que dirixe os sistemas de corrección de probas de discordancias cara á febra apropiada. Isto implica que estas amosegas deben estar presentes na febra guía, e atopáronse recentemente probas sobre isto.
En traballos recentes demostrouse que as amosegas son sitios para a carga dependente de RFC da abrazadeira escorregante de replicación PCNA, dunha maneira específica de orientación, de tal maneira que unha das caras da proteína con forma de donut se xustapón cara ao extremo 3'-OH na amosega. A PCNA orientada dirixe despois a acción da endonuclease MutLalpha cara a unha febra en presenza dunha discordancia e MutSalpha ou MutSbeta.

Calquera evento mutacional que distorsione a estrutura de superhélice do ADN ten o potencial de comprometer a estabilidade xenética da célula. O feito de que os sistemas de reparación e detección de danos sexan tan complexos coma a propia maquinaria de replicación subliña a importancia que na evolución se lle deu á fidelidade na copia do ADN.

Exemplos de bases discordantes son os apareamentos G/T ou A/C, que non respectan o apareamento normal de bases (ver reparación do ADN). As discordancias débense comunmente á tautomerización de bases durante a fase G2 do ciclo celular. Os danos son reparados por recoñecemento da deformidade causada pola discordancia, o que determina as febras molde e non molde, e escinde a base incorporada incorrectamente e substitúea co nucleótido correcto. O proceso de eliminaciónn implica xeralmante a máis nucleótidos que o propio nucleótido discordante. Poden eliminarse xunto con el uns poucos pares de bases ou ás veces ata miles de pares de bases da febra de ADN de nova síntese.

 Proteínas da reparación de discordancias 

A reparación de discordancias é un proceso altamente conservado desde os procariotas aos eucariotas. A primeira proba da reparación de discordancias obtívose na bacteria Streptococcus pneumoniae (xenes hexA e hexB). Traballos posteriores en Escherichia coli identificaron varios xenes que, cando son inactivados mutacionalmente, orixinan cepas hipermutables. Os produtos xénicos denomínanse por esa razón proteínas "Mut", e son os principais compoñentes activos do sistema de reparación de discordancias. Tres destas proteínas son esenciais para detectar a discordancia e dirixir a maquinaria de reparación cara a elas: MutS, MutH e MutL (MutS é un homólogo de HexA e MutL de HexB).

MutS forma un dímero (MutS2) que recoñece a base discordante sobre a febra filla e únese ao ADN mutado. A MutH únese a sitios hemimetilados ao longo da febra de ADN filla, mais a súa acción é latente, e só é activada polo contacto co dímero MutL (MutL2), o cal se une ao complexo MutS-ADN e actúa como un mediador entre MutS2 e MutH, activando este último. O ADN é dobrado en bucle para buscar o sitio de metilación d(GATC) máis próximo á discordancia, o cal pode estar ata a 1 kb de distancia. Despois da activación polo complexo MutS-ADN, a MutH fai unha amosega na febra filla preto do sitio hemimetilado e recruta unha helicase UvrD (ADN helicase II) para separar as dúas febras cunha polaridade específica 3' a 5'. O complexo MutSHL completo deslízase entón ao longo do ADN na dirección da discordancia, liberando a febra para que sexa escindida a medida que avanza. Unha exonuclease rastrea o complexo e dixire a cola de ADN de febra simple. O tipo de exonuclease recrutada depende do lado da discordancia en que MutH cortou a febra, o 5’ ou o 3’. Se a amosega feita por MutH está no extremo 5’ da discordancia, utilízase a exonuclease RecJ ou a ExoVII (ambas as dúas son exonucleases 5’-3’). Porén, se a amosega está no extremo 3’ da discordancia, utilízase a ExoI (un encima 3'-5').

Todo o proceso remata ao superar o sitio da discordancia, é dicir, o propio sitio e os nucleótidos que o rodean son completamente escindidos. O oco de febra simple creado pola exonuclease pode despois ser reparado pola ADN polimerase III (axudada por unha proteína de unión á febra simple), que utiliza a outra febra como molde, e finalmente é selado pola ADN ligase. A ADN metilase despois metila rapidamente a febra filla.

 Homólogos de MutS 

O dímero da MutS2 cando se une ao ADN dobra a hélice do ADN e abrangue aproximadamente uns 20 pares de bases. Ten unha actividade débil de ATPase, e a unión a ela do ATP causa a formación de estruturas terciarias na superficie da molécula. A estrutura cristalina de MutS revela que é excepcionalmente asimétrica, e, aínda que a súa conformación activa é un dímero, só unha das dúas metades interacciona co sitio da discordancia.

En eucariotas, os homólogos de MutS (chamados Msh) forman dous heterodímeros principais: Msh2/Msh6 (MutSα) e Msh2/Msh3 (MutSβ). A vía MutSα está implicada principalmente na substitución de bases e reparacións de discordancias de bucle pequeno. A vía MutSβ tamén está implicada na reparación de bucles pequenos, ademais de na reparación de bucles grandes (bucles de ~10 nucleótidos). Porén, a MutSβ non repara substitucións de bases.

 Homólogos de MutL 

A MutL ten tamén unha débil actividade de ATPase (usa o ATP para impulsar o seu movemento). Forma un complexo con MutS e MutH, o que incrementa a pegada de MutS no ADN.

Porén, a procesividade (a distancia na que o encima pode moverse ao longo do ADN antes de disociarse) de UvrD é de só ~40–50 bp. Como a distancia entre a amosega creada por MutH e discordancia pode ser como media de ~600 pares de bases, se non se cargou outra UvrD a sección non desenrolada do ADN pode despois reenrolarse libremente por apareamento de bases coa súa febra complementaria, forzando o proceso a comezar de novo. Porén, cando é axudado por MutL, a taxa de carga de UvrD increméntase moito. Aínda que a procesividade (e a utilización de ATP) de moléculas individuais de UvrD permanece igual, o efecto total sobre o ADN é pulado considerablemente; o ADN non ten a posibilidade de reenrolarse, xa que cada UvrD desenrola de 40 a 50 pares de bases, disóciase, e despois é inmediatamente substituída por outra UvrD, repetindo o proceso. Isto expón grandes seccións do ADN á dixestión pola exonuclease, permitíndolle unha rápida escisión (e posterior substitución) do ADN incorrecto.

Os eucariotas teñen homólogos de MutL chamados Mlh1 e Pms1. Forman un heterodímero que imita a MutL de E. coli. O homólogo humano da MutL procariota ten tres formas designadas MutLα, MutLβ e MutLγ. O complexo MutLα está formado por dúas subunidades, que son MLH1 e PMS2; o heterodímero MutLβ está constituído por MLH1 e PMS1, mentres que MutLγ está formado por MLH1 e MLH3. A MutLα actúa como facilitador, coordinando os eventos da reparación de discordancias. Descubriuse recentemente que unha ADN endonuclease que introduce roturas de febras no ADN despois da activación por discordancias e por outras proteínas necesarias, MutSa e PCNA. Estas interrupcións nas febras serven como puntos de entrada para a actividade exonuclease que elimina o ADN discordante. Os papeis que xogou MutLβ e MutLγ na reparación de discordancias coñécense menos.

 MutH: unha endonuclease presente en E. coli e Salmonella 

MutH é unha endonuclease moi débil que se activa unha vez que se uniu a MutL (ao cal á súa vez se une a MutS). Fai amosegas no ADN non metilado e na febra non metilada do ADN hemimetilado pero non fai amosegas no ADN completamente metilado. Atopouse en experimentos que a reparación de discordancias é aleatoria se ningunha das febras está metilada. Estes comportamentos fixeron que se propuxese que MutH determina cal das febras contén a discordancia. 
MutH non ten homólogos en eucariotas. A súa función de endonuclease é realizda neles polos homólogos de MutL, os cales teñen certa actividade especializada de exonuclease 5'-3'. A preferencia para a eliminación das discordancias da febra filla de nova síntese en eucariotas poden proporcionala os extremos 3' libres dos fragmentos de Okazaki da febra de nova síntese durante a replicación.

 A PCNA e a abrazadeira escorregante β 

A PCNA e a abrazadeira escorregante β asócianse con MutSα/β e MutS, respectivamente. Aínda que os primeiros informes suxerían que o complexo PCNA-MutSα pode potenciar o recoñecemento da discordancia, demostrouse recentemente que non hai un cambio aparente na afinidade de MutSα polas discordancias en presenza ou ausencia de PCNA. Ademais, os mutantes para MutSα que non poden interaccionar con PCNA in vitro mostran a capacidade de levar a cabo o recoñecemento e escisión de discordancias a niveis case de tipo salvaxe (normais, non mutantes). Tales mutantes son deficientes na reacción de reparación dirixida por unha rotura de febra 5', o que suxire por primeira vez unha función de MutSα nun paso postescisión da reacción.

 Importancia clínica 

 Defectos na reparación de discordancias 

As mutacións nos homólogos humanos das proteínas Mut afectan á estabilidade xenómica, que pode resultar en inestabilidade de microsatélites. A inestabilidade de microsatélites está implicada na maioría dos cancros humanos. Concretamente, a inmensa maioría dos cancros colorrectais non poliposos hereditarios son atribuídos a mutacións nos xenes que codifican os homólogos de MutS e MutL, que son MSH2 e MLH1 respectivamente, o cal serve para clasificalos como xenes supresores de tumores. Un subtipo deste tipo de cancro colorrectal denomínase síndrome de Muir-Torre, que está asociado con tumores de pel.

A síndrome de cancro de reparación de discordancias (tamén chamada deficiencia na reparación de discordancias ou síndrome de Turcot) combina tipicamente a polipose adenomatosa familiar con tumores cerebrais.

 Defectos epixenéticos no cancro 

Só unha minoría dos cancros esporádicos cunha deficiencia de reparación do ADN teñen unha mutación nun xene de reparación do ADN. Porén, a maioría dos cancros esporádicos cunha deficiencia na reparación do ADN teñen unha ou máis alteracións epixenéticas que reducen ou silencian a expresión dos xenes de reparación de ADN. Un 13% dos cancros colorrectais son deficientes na reparación das discordancias no ADN, e un 9,8% debido a unha perda da MLH1, e porcentaxes menores debido á perda da MSH2 (1,4%), MSH6 (0,5%) e PMS2 (1,5%). En 65 de 66 casos de cancros esporádicos nos cales MLH1 era deficiente, a deficiencia era debida á metilación da rexión promotora do xene MLH1.

Outros cancros teñen maiores frecuencias de perda da reparación de discordancias debido á perda da MLH1 (ver táboa abaixo). Como se indica na táboa, avaliáronse os defectos na reparación de discordancias que se debían á perda da expresión de MLH1, e encontrouse que as deficiencias da MLH1 eran en gran medida o resultado da metilación da rexión promotora do xene MLH1.

Outro mecanismo esporádico polo cal se reducen as expresións da MLH1 e MSH2 é a sobreexpresión de miR-155. MiR-155 ten como diana a MLH1 e MSH2. Nos cancros humanos colorrectais atopouse unha correlación inversa entre a expresión de miR-155 e a expresión das proteínas MLH1 ou MSH2.

 Expresión deficiente en cancros 

+Cancros deficientes en MLH1Tipo de cancroFrecuencia da deficiencia en cancrosFrecuencia da deficiencia en defectos de campo adxacentesEstómago32%24%-28%Estómago (tumores de tipo foveolar)74%71%Estómago con alta incidencia no val de Caxemira73%20%Esófago73%27%Carcinoma de células escamosas de cabeza e pescozo31%-33%20%-25%Cancro de pulmón de células non pequenas69%72%Colorrectal10%

 Deficiencia nos defectos de campo 

Un defecto de campo é unha área ou "campo" de epitelio que foi precondicionado por cambios epixenéticos e/ou mutacións, polo que predispón ao desenvolvemento de cancro. Como indicou Rubin, "A gran maioría dos estudos na investigación do cancro fixéronse en tumores ben definidos in vivo, ou en focos neoplásticos discretos in vitro. Porén, hai probas de que máis do 80% das mutacións somáticas encontradas en fenotipos mutadores humanos colorrectais ocorren antes do comezo da expansión clonal terminal." De xeito similar, Vogelstein et al. sinalaron que máis da metade das mutacións somáticas identificadas en tumores ocorrían na fase preneoplástica (nun defecto de campo), durante o crecemento de células aparentemente normais.

Na táboa de arriba, detectáronse deficiencias en MLH1 nos defectos de campo (tecidos histoloxicamente normais) que rodeaban a maioría dos cancros. Se a MLH1 é reducida epixeneticamente ou silenciada, probablemente non lle confire vantaxe selectiva a unha célula nai. Porén, a expresión reducida ou ausente da MLH1 causaría un incremento das taxas de mutación, e un ou máis dos xenes mutados poden proporcionar á célula vantaxes selectivas. O xene MLH1 con expresión deficiente podería entón ser portado como xene un pasaxeiro (autostopista) selectivamente neutro ou só lixeiramente deletéreo cando a célula nai mutada xera un clon expandido. A presenza continua dun clon cun MLH1 reprimido epixeneticamente continuaría xerando máis mutacións, algunhas das cales poderían producir un tumor.

 Deficiencia da MMR en humanos 

En humanos, sete proteínas de repaación de discordancias no ADN (MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1 e PMS2) traballan coordinaamente en pasos secuenciais para iniciar a reparación das discordancias. Ademais, hai subvías dependentes de Exo1 e independentes de Exo1.

Outros produtos xénicos implicados na reparación de discordancias (despois de feita a iniciación por xenes da reparación de discordancias) en humanos inclúen a ADN polimerase delta, a PCNA, a RPA, a HMGB1, o RFC e a ADN ligase I, xunto con factores modificadores das histonas e a cromatina.

 Carencia de MMR e frecuencia de mutación 

O recoñecemento e reparación de discordancias son importantes para as células porque se non se fan o resultado é inestabilidade de microsatélites e unha elevada taxa de mutación espontánea (fenotipo mutador). Entre 20 cancros avaliados o cancro de colon inestable en microsatálites deficiente na reparación de discordancias tiña a segunda frecuencia de mutación máis alta (despois do melanoma).

Porén, a ausencia de reparación de discordancias a miúdo ocorre en coordinación coa perda doutros xenes de reparación do ADN. Nun exemplo, que implica aos xenes MLH1 e MLH3, Jiang et al. realizaron un estudo no que avaliaron a expresión dos ARNm de 27 xenes de reparación do ADN en 40 astrocitomas comparada coa de tecidos cerebrais normais de individuos sen astrocitoma. Entre os 27 xenes de reparación do ADN avaliados, 13 xenes de reparación do ADN, que eran MLH1, MLH3, MGMT, NTHL1, OGG1, SMUG1, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, RAD50, XRCC4 e XRCC5, estaban todos significativamente regulados á baixa en cada un dos tres graos (II, III e IV) dos astrocitomas. A represión destes 13 xenes en astrocitomas de grao inferior e tamén de alto grao suxeriu que poderían ser importantes nos estadios iniciais e nos avanzados dos astrocitomas. Noutro exemplo, Kitajima et al. encontraron que a inmunorreactividade en 135 espécimes de cancro gástrico e a perda da expresión de MLH1 e MGMT estaba estreitamente correlacionada e parecían estar sincronicamente aceleradas durante a progresión do tumor.

A expresión deficiente de moitos xenes de reparación do ADN atópase a miúdo en cancros, e pode contribuír á aparición de miles de mutacións que se encontran usualmente en cancros.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Reparación por escisión de bases
 Reparación por escisión de nucleótidos

 Bibliografía 








 Ligazóns externas 
 Reparación do ADN 


Categoría:Reparación do ADN