ADN glicosilase

As ADN glicosilases (ou DNA glicosilases) son unha familia de encimas implicados na reparación por escisión de bases, clasificados co número EC EC 3.2.2. A reparación por escisión de bases é o mecanismo polo cal as bases danadas do ADN son eliminadas e substituídas. As ADN glicosilases catalizan o primeiro paso deste proceso. Eliminan a base nitroxenada danada pero deixan o esqueleto de azucre-fosfato intacto, creando un sitio apurínico/apirimidínico, xeralmente denominado sitio AP. Isto realízano mediante a xeración dunha rotación de 180º da base danada na dobre hélice seguida da clivaxe do enlace N-glicosídico, que a separa do ADN.

As glicosilases foron primeiramente descubertas nas bacterias, e despois atopáronse en todos os reinos da vida. Ademais do seu papel na reparación por escisión de bases, as ADN glicosilases foron implicadas na represión do silenciamento de xenes en Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum e outras plantas por desmetilación activa. Os residuos de 5-metilcitosina son escindidos e substituídos por citosinas non metiladas permitindo así o acceso á estrutura da cromatina dos encimas e proteínas necesarias para a transcrición e tradución.

 Glicosilases monofuncionais e bifuncionais 

Hai dúas grandes clases de glicosilases: monofuncionais e bifuncionais.  As glicosilases monofuncionais teñen só actividade glicosilase, mentres que as glicosilases bifuncionais tamén presentan actividade de AP liase que lles permite cortar o enlace fosfodiéster do ADN, creando unha rotura de febra simple sen a necesidade da intervención dunha AP endonuclease. A β-eliminación dun sitio AP por unha glicosilase-liase rende un aldehido 3' α,β-insaturado adxacente a un fosfato 5', o cal difire do produto de clivaxe da AP endonuclease. Algunhas glicosilase-liases poden ademais realizar a δ-eliminación, que converte o 3' aldehido nun fosfato 3'.

 Mecanismo bioquímico 

A primeira estrutura cristalina dunha ADN glicosilase obtívose de E. coli. Esta estrutura revelou que o encima fai rotar a base danada na dobre hélice a un peto de sitio activo para alí escindila. Outras glicosidases que se atoparon despois seguen o mesmo paradigma xeral, incluíndo a UNG humana representada máis abaixo. Para clivar o enlace N-glicosídico, as glicosidases monofuncionais usan unha molécula de auga activada para atacar o carbono 1 do substrato. As glicosidadses bifuncionais, ao contrario, usan un residuo amino como nucleófilo para atacar o mesmo carbono, por medio dun intermediario base de Schiff.

 Tipos de glicosilases 

Resolvéronse as estruturas cristalinas de moitas glicosilases. Baseándose na semellanza estrutural, as glicosilases están agrupadas en catro superfamilias. As familias UDG e AAG comprenden glicosilases compactas pequenas, mentres que as familias MutM/Fpg e HhH-GPD comprenden encimas máis grandes e con moitos dominios.

Evolucionaron unha ampla variedade de glicosilases para recoñecer diferentes bases danadas. A táboa seguinte resume as propiedades de glicosilases coñecidas de organismos modelo comunmente estudados.

+ Glicosilases de bacterias, lévedos e humanos E. coli B. cereus Lévedo (S. cerevisiae) Humano Tipo Substratos AlkA AlkE Mag1 MPG monofuncional 3-meA, hipoxantina UDG Ung1 UNG monofuncional uracilo Fpg Ogg1 hOGG1 bifuncional 8-oxoG, FapyG Nth Ntg1 hNTH1 bifuncional Tg, hoU, hoC, urea, FapyG Ntg2 Nei Non presente hNEIL1 bifuncional Tg, hoU, hoC, urea, FapyG, FapyA hNEIL2 sitio AP, hoU hNEIL3 descoñecido MutY Non presente hMYH monofuncional A:8-oxoG Non presente Non presente hSMUG1 monofuncional U, hoU, hmU, fU Non presente Non presente TDG monofuncional apareamento incorrecto T:G Non presente Non presente MBD4 monofuncional Apareamento incorrecto T:G AlkC AlkC Non presente Non presente monofuncional Alquilpurina AlkD AlkD Non presente Non presente monofuncional Alquilpurina

 Uracilo ADN glicosilases 
miniatura|300px|dereita|Estrutura do encima de reparación por escisión de bases uracilo ADN glicosilase. O residuo de uracilo móstrase en amarelo.
A familia proteica da uracilo ADN glicosilase (UDG) comprende de encimas que reverten mutacións no ADN. A mutación máis común é a  desaminación da citosina a uracilo. A UDG repara estas mutacións, polo que é crucial na reparación do ADN, e sen ela estas mutacións poerían orixinar un cancro.

Hai varias uracilo ADN glicosilases e outras ADN glicosilases moi relacionadas con ela (EC), como a uracilo ADN glicosilase humana, a uracilo ADN glicosilase termófila, a ADN glicosilase específica da discordancia G:T/U (Mug), e a ADN glicosilase monofuncional selectiva para febras simples (SMUG1).

As uracilo ADN glicosilases retiran o uracilo do ADN, o cal é unha base que normalmente non se encontra no ADN e que pode orixinarse por desaminación espontánea da citosina ou pola incorrecta incorporación de dU en fronte de dA durante a replicación do ADN. O membro prototípico desta familia é E. coli UDG, que foi unha das primeiras glicosilases descubertas. En células de mamífero identificáronse catro actividades diferentes de uracilo ADN glicosilase, incluíndo as dos encimas UNG, SMUG1, TDG, e MBD4. Varían na especificidade de substrato e na localización subcelular. A SMUG1 prefire como substrato o ADN de febra simple, pero tamén retira o U do ADN bicatenario. Ademais de escindir os uracilos non modificados, a SMUG1 pode escindir o 5-hidroxiuracilo, o 5-hidroximetiluracilo e o 5-formiluracilo que leva un grupo oxidado no anel C5. A TDG e a MBD4 son estritamente específicas para o ADN bicatenario. A TDG pode eliminar timina glicol cando está presente en fronte dunha guanina, e tamén derivados do U con modificacións no carbono 5. As evidencias actuais suxiren que, en células humanas, a TDG e a SMUG1 son os principais encimas responsables da reparación dos apareamentos incorrectos U:G causados por desaminación espontánea da citosina, mentres que do uracilo que se orixina no ADN pola incorrecta incorporación de dU se encarga principalmente a UNG. A MBD4 crese que corrixe as discordancias T:G que se orixinan por desaminación da 5-metilcitosina a timina en sitios CpG.Wu P, Qiu C, Sohail A, Zhang X, Bhagwat, AS, Xiaodong C. (2003).  Mismatch Repair in Methylated DNA. STRUCTURE AND ACTIVITY OF THE MISMATCH-SPECIFIC THYMINE GLYCOSYLASE DOMAIN OF METHYL-CpG-BINDING PROTEIN MBD4. 5285-5291. O rato mutante para MBD4 desenvólvese normalmente e non mostra un incremento da susceptibilidade ao cancro ou redución da supervivencia. Pero adquiren máis mutacións de C a T en secuencias CpG nas células epiteliais do intestino delgado.

A estrutura da UNG humana en complexo co ADN revelou que, igual que outras glicosidases, fai rotar o nucleótido sobre o que actúa cara a fóra da dobre hélice e cara ao peto do sitio activo. A UDG sofre un cambio conformacional desde un estado ‘‘aberto’’ non unido ao ADN a un estado ‘‘pechado’’ unido ao ADN.Slupphaug G, Mol CD, Kavli B, Arvai AS, Krokan HE,  Tainer JA. (1996). A nucleotide-flipping mechanism from the structure of human uracil–DNA glycosylase bound to DNA. 384: 87-92.

 Historia 
O primeiro que observou a reparación do uracilo no ADN foi T. Lindahl.Lindahl T. My journey to DNA repair. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2013 Feb;11(1):2-7. doi: 10.1016/j.gpb.2012.12.001. Epub 2012 Dec 21. PMID 23453014 . PMCID 4357663. A UDG foi purificada primeiramente en Escherichia coli, e viuse que hidrolizaba o enlace N-gliosídico que une a base coa desoxirribosa do esqueleto da molécula de ADN.

 Función 
A función da UDG é eliminar mutacións no ADN, concretamente eliminar os uracilos.

 Estrutura 
Estas proteínas teñen unha estrutura de 3-capas alfa/beta/alfa.
A topoloxía do polipéptido da UDG é a dunha proteína clásica alfa/beta. A estrutura consiste principalmente nunha folla beta toda paralela de catro febras en posición central rodeada a cada lado por un total de oito hélices alfa e denomínase folla beta dobremente enrolada paralela.

 Mecanismo 
As uracilo ADN glicosilases son encimas de reparación do ADN que escinden residuos de uracilo do ADN clivando o enlace N-glicosídico e iniciando a vía da reparación por escisión de bases. O uracilo do ADN pode orixinarse por desaminación da citosina para formar apareamentos incorrectos U:G mutaxénicos, ou por medio da incorporación de dUMP pola ADN polimerase que dá lugar á formación de pares U:A. Estes residuos de uracilo aberrantes son xenotóxicos.

 Localización 
En células eucariotas, a actividade de UNG encóntrase no núcleo celular e nas mitocondrias. A proteína UNG1 humana é transportada tanto ás mitocondrias coma ao núcleo.

 Conservación 
A secuencia da uracilo ADN glicosilase está extremadamente ben conservada en bacterias e eucariotas e tamén en virus herpes. Encontráronse uracilo ADN glicosilases máis distantemente relacionadas en poxvirus.
Os 77 aminoácidos N-terminais da UNG1 parecen ser necesarios para a localización mitocondrial, pero non puido demostrarse directamente a presenza dun péptido de tránsito mitocondrial. A rexión conservada situada máis cara ao extremo N-terminal contén un residuo de ácido aspártico do que se propuxo, baseándose nas estruturas obtidas con raios X, que actúan como unha base xeral no mecanismo catalítico.

 Familias de UDGs 
Hai dúas familias de UDGs, chamadas Familia 1 e Familia 2. A Familia 1 é activa contra o uracilo que se encontre en ADN monocatenario ou bicatenario. A Familia 2 escinde o uracilo de sitios con discordancias con guanina.

 Glicosilases de bases oxidadas 
miniatura|A 8-oxo-dG (syn) nun par de bases de Hoogsteen coa dA (anti).
Diversas glicosilases evolucionaron para recoñecer bases oxidadas, que se forman comunmente por causa das especies reactivas do oxíxeno xeradas durante o metabolismo celular. A lesións máis frecuentes formadas en residuos de guanina son a 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina (FapyG) e a 8-oxoguanina. A 8-oxoguanina forma os nucleósidos 8-oxoguanosina e 8-oxo-2'-desoxiguanosina. Debido ao incorrecto apareamento coa adenina durante a replicación, a 8-oxoguanina é moi mutaxénica, dando lugar a transversións de G a T. A reparación desta lesión iníciaa a ADN glicosilase bifuncional OGG1, que recoñece a 8-oxoguanina apareada con C. A hOGG1 é unha glicosilase bifuncional que pertence á familia de hélice-forquita-hélice (HhH). A MYH recoñece a adenina apareada incorrectamente con 8-oxoguanina, pero escinde a A, deixando intacta a 8-oxoguanina. Os ratos knockout para OGG1 non mostran un incremento na incidencia de tumores, pero acumulan 8-oxoguanina no fígado a medida que envellecen. Obsérvase un fenotipo similar coa activación de MYH, pero a inactivación simultánea de MYH e OGG1 causa a acumulación de 8-oxoG en múltiples tecidos, incluíndo o intestino delgado. Nos humanos, as mutacions en MYH están asociadas co incremento do risco de desenvolver colon poliposo e cancro de colon. Ademais de OGG1 e MYH, as células humanas conteñen tres ADN glicosilases adicionais, chamadas NEIL1, NEIL2 e NEIL3, que son homologas da Nei bacteriana, e a súa presenza probablemente explica os fenotipos máis suaves que presentan os ratos knockout para OGG1 e MYH.

 Glicosilases de bases alquiladas 

Este grupo comprende o encima E. coli AlkA e proteínas relacionadas de eucariotas superiores. Estas glicosilases son monofuncionais e recoñecen as bases metiladas, como a 3-metiladenina.

 AlkA  
A AlkA é a 3-metiladenina ADN glicosilase II.Structure-function studies of an unusual 3-methyladenine DNA glycosylase II (AlkA) from Deinococcus radiodurans. 2012

 Patoloxía 

 As ADN glicosilases que interveñen na reparación por escisión de bases (BER) poden ser asociadas co risco de cancro en persoas portadoras de mutacións en BRCA1 e BRCA2.

 Deficiencias epixenéticas en cancros 

As alteracións epixenéticas (epimutacións) nos xenes para a reparación por escisión de bases aínda empezaron recentemente a ser avaliadas nuns poucos cancros, o que contrasta cos numerosos estudos previos sobre epimutacións en xenes que actúan noutras vías de reparación do ADN (como a MLH1 na reparación de discordancias e na MGMT en reversións directas).Carol Bernstein and Harris Bernstein (2015). Epigenetic Reduction of DNA Repair in Progression to Cancer, Advances in DNA Repair, Prof. Clark Chen (Ed.), ISBN 978-953-51-2209-8, InTech,  Available from: http://www.intechopen.com/books/advances-in-dna-repair/epigenetic-reduction-of-dna-repair-in-progression-to-cancer Algúns exemplos de epimutacións nos xenes para a reparación por escisión de bases que ocorren en cancros resúmense a continuación.

 MBD4 

miniatura|dereita|Hidrólise de citosina a uracilo.

A MBD4 (proteína 4 de dominio de unión a metil-CpG) é unha glicosilase empregada nun paso inicial da reparación por escisión de bases. A proteína MBD4 únese preferencialmente a sitios CpG completamente metilados e ás bases alteradas de ditos sitios. Estas bases alteradas orixínanse da hidrólise frecuente de citosina a uracilo (ver imaxe) e a hidrólise da 5-metilcitosina a timina, producindo os pares de bases G:U e G:T. Se non se eliminan os uracilos ou timinas incorrectos nestes pares de bases antes da replicación do ADN, causarán mutacións por transición. A MBD4 cataliza especificamente a eliminación de T e U emparellados con guanina (G) dentro de sitios CpG. Esta é unha importante función de reparación, xa que aproximadamente 1/3 de todas as mutacións dun só par de bases intraxénicas nos cancros humanos teñen lugar en dinucleótidos CpG e son o resultado de transicións de G:C a A:T. Estas transicións comprenden as mutacións máis frecuentes en cancros humanos. Por exemplo, case o 50% das mutacións somáticas do xene supresor de tumores p53 en cancro colorrectal son transicións de G:C a A:T en sitios CpG. Así, un decrecemento na expresión da MBD4 podería causar u incremento nas mutacións carcinoxénicas.

A expresión de MBD4 está reducida en case todos os neoplasmas de cancros colorrectais debido á metilación da rexión promotora da MBD4. Ademais a MBD4 é deficiente debido á mutación en aproximadamente o 4% dos cancros colorrectais.

Unha maioría dos campos normais histoloxicamente que rodean os recrementos neoplásticos (adenomas e cancros de colon) no colon tamén mostran unha expresión reducida do ARNm da MBD4 (un defecto de campo) compardo cun tecido histoloxicamente normal de individuos que nunca tiveron un neoplasma de colon. Este descubrimento suxire que o silenciamento epixenético da MBD4 é un paso inicial na carcinoxénese colorrectal.

Nunha poboación chinesa examinada, o polimorfismo Glu346Lys na MBD4 estaba asociado cunha redución dun 50% do risco de padecer cancro cervical, o que suxire que as alteracións na MBD4 poden ser importantes no cancro.

 NEIL1 

A NEIL1 recoñece e elimina certas bases danadas por oxidación do ADN e despois corta o sitio abásico por β,δ-eliminación, deixando extremos 3' e 5' fosfato. A NEIL1 recoñece pirimidinas oxidadas, formamidopirimidinas, residuos de timina oxidados no grupo metilo, e ambos os estereoisómeros da timina glicol. Os mellores substratos para a NEIL1 humana parecen ser as lesións de hidantoína, guanidinohidantoína e espiroiminodihidantoína, que son produtos da ulterior oxidación da 8-oxoG. A NEIL1 ten a capacidade tamén de eliminar lesións de ADN de febra simple así como das estruturas de burbulla e forcada do ADN. Unha deficiencia da NEIL1 causa un incemento da mutaxénese no sitio dun par 8-oxo-Gua:C, e a maioría das mutacións son transversións de G:C a T:A.

Un estudo feito en 2004 atopou que o 46% dos cancros gástricos primarios tiñan reducida a expresión do ARNm de NEIL1, aínda que se descoñece o mecanismo de redución. Este estudo tamén encontrou que o 4% dos cancros gástricos tiñan mutacións en NEIL1. Os autores suxeriron que a baixa actividade de NEIL1 que se orixina pola expresión reducida e/ou mutación en NEIL1 está a miúdo implicada na carcinoxénese gástrica.

Realizouse un exame da metilación do promotor anormal de 145 xenes de reparación do ADN no carcinoma de células escamosas de tecidos da cabeza e pescozo en 20 pacientes e de mostras de mucosa de cabeza e pescozo de 5 pacientes non cancerosos. O estudo mostrou que o xene da NEIL1, que presentaba unha hipermetilación substancialmente incrementada, era o que tiña a frecuencia de metilación máis significativamente diferente. Ademais, a hipermetilación correspondíase cunha diminución na expresión do ARNm de NEIL1. Ademais, estudos de 135 tecidos tumorais e 38 normais tamén mostraron que o 71% das mostras de tecidos de carcinoma de células escamosas de cabeza e pescozo tiñan unha elevada metilación do promotor de NEIL1.

Nunha avaliación de 8 xenes de reparación do ADN en tumores de cancro de pulmón de células non pequenas, o 42% estaba hipermetilado na rexión promotora de NEIL1. Esta foi a anormalidade na reparación do ADN máis frecuente que se encontrou entre os 8 xenes estudados. O xene da NEIL1 era ademais un dos seis xenes de reparación do ADN que se encontrou que estaban hipermetilados nas súas rexións promotoras no cancro colorrectal.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Ligazóns externas 


Categoría:Dominios proteicos
Categoría:Reparación do ADN
Categoría:Hidrolases