Unión de extremos non homólogos

A unión de extremos non homólogos (abreviada xeralmente como NHEJ, do inglés Non-homologous end joining) é unha vía de reparación do ADN que arranxa as roturas de dobre febra que sofre o ADN. A NHEJ denomínase "non homóloga" porque as roturas dos extremos son ligadas directamente sen necesidade de que haxa un molde homólogo, en contraste coa reparación dirixida por homoloxía, que require unha secuencia homóloga que guíe a reparación. O termo "unión de extremos non homólogos" foi acuñado en 1996 por Moore e Haber.

A NHEJ utiliza tipicamente curtas secuencias de ADN homólogas chamadas microhomoloxías para que guíen a reparación. Estas microhomoloxías están xeralmente presentes nos tramos de febra simple que sobresaen nos extremos das roturas de dobre febra. Cando estes tramos que sobresaen son perfectamente compatibles, a NHEJ xeralmente repara a rotura de forma precisa.Wilson, T. E., and Lieber, M. R. Efficient processing of DNA ends during yeast nonhomologous end joining. Evidence for a DNA polymerase beta (Pol4)-dependent pathway. (1999) J" Biol. Chem 274, 23599–23609.  PMID 10438542Budman J, Chu G. Processing of DNA for nonhomologous end-joining by cell-free extract. EMBO J. 2005 Feb 23;24(4) 849-60.  PMID 15692565 Tamén pode ocorrer unha reparación imprecisa que orixina a perda de nucleótidos, pero é moito máis común cando estes tramos que sobresaen non son compatibles. Unha NHEJ inapropiada pode orixinar translocacións e fusión de telómeros, que son marcas distintivas das células tumorais.

A NHEJ está conservada evolutivamente en todos os reinos da vida e é a vía de reparación de roturas de dobre febra predominante en células de mamíferos. Porén, no lévedo de xemación (Saccharomyces cerevisiae) a recombinación homóloga domina cando o organismo crece en condicións de laboratorio.

Cando se inactiva a vía NHEJ, poden repararse as roturas de dobre febra por unha vía máis tendente ao erro chamada unión de extremos mediada por microhomoloxía (MMEJ). Nesta vía, a resección dos extremos revela curtas microhomoloxías a cada lado da rotura, que son despois aliñadas para guiar a reparación. Isto contrasta coa NHEJ clásica, que usa as microhomoloxías que están xa expostas nos tramos que sobresaen de cadea simple nos extremos con roturas de dobre cadea. A reparación por MMEJ, por tanto, leva á deleción das secuencias de ADN entre as microhomoloxías.

 En bacterias 

Moitas especies de bacterias, como Escherichia coli, carecen dunha vía de unión de extremos, polo que dependen totalmente da recombinación homóloga para reparar as roturas de dobre febra. Porén, identificáronse proteínas da NHEJ en diversas bacterias, incluíndo Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, e Mycobacterium smegmatis. As bacterias utilizan unha versión moi compacta da NHEJ na cal todas as actividades necesarias están contidas en só dúas proteínas: o homodímero Ku e a ligase/polimerase/nuclease LigD multifuncional. En micobacterias, a NHEJ é moito máis tendente ao erro do que en lévedos, e a miúdo engádense bases ou son eliminadas nos extremos das roturas de dobre febra durante a reparación. Moitas das bacterias que posúen proteínas da NHEJ pasan unha porción significativa do seu ciclo de vida nunha fase haploide estacionaria, na cal non se dispón dun molde para a recombinación. A NHEJ puido ter evlucionado para axudar a estes organismos a sobrevivir ás roturas de dobre febra inducidas durante o desecamento. Os bacteriófagos relacionados Corndog e Omega de Mycobacterium smegmatis, tamén codifican os homólogos de Ku e aprovéitanse da vía NHEJ para recircularizar os seus xenomas durante a infección. A diferenza da recombinación homóloga, que foi estudada extensamente en bacterias, a NHEJ foi descuberta orixinalmente en eucariotas e só foi identificada en procariotas na pasada década.

 En eucariotas 
A diferenza das bacterias, a NHEJ en eucariotas utiliza varias proteínas, que participan nos seguintes pasos:

 Unión e fixación dos extremos 

En lévedos, o complexo Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) é recrutado nas roturas de dobre febra moi cedo e pénsase que promove unha ponte que une os dous extremos do ADN.Chen, L., Trujillo, K., Ramos, W., Sung, P., and Tomkinson, A. E. Promotion of Dnl4-catalyzed DNA end-joining by the Rad50/Mre11/Xrs2 and Hdf1/Hdf2 complexes. (2001) Mol" Cell 8, 1105–1115. PMID 11741545 O complexo correspondente en mamíferos Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) está tamén implicado na NHEJ, pero pode funcionar en moitos pasos da vía ademais de simplemente manter próximos os extremos. A DNA-PKcs tamén se pensa que participa na formación de pontes entre os extremos durante a NHEJ de mamíferos.

A proteína Ku eucariota é un heterodímero que consta de Ku70 e Ku80, e forma un complexo coa DNA-PKcs, que está presente en mamíferos pero ausente en lévedos. A Ku é unha molécula con forma de cesta que escorrega sobre o extremo do ADN e se move cara a adiante. A Ku pode funcionar como un sitio de atraque para outras proteínas da NHEJ, e interacciona co complexo da ADN ligase IV e a proteína XLF.

 Procesamento dos extremos 

O procesamento dos extremos implica a eliminación dos nucleótidos danados ou con discordancias na complementariedade por nucleases e a resíntese por ADN polimerases. Este paso non é necesario se os extremos son xa compatibles e teñen os extremos 3' hidroxilo e 5' fosfato.

Sábese pouco sobre a función das nucleases na NHEJ. Unha é Artemis, que cómpre para a abertura das forquitas que se forman nos extremos do ADN durante a recombinación V(D)J, un tipo específico de NHEJ, e pode tamén participar no recortes dos extremos durante a NHEJ xeral.Ma, Y., Pannicke, U., Schwarz, K., and Lieber, M. R. Hairpin opening and overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologous end joining and V(D)J recombination. (2002) Cell 108, 781–794. PMID 11955432 A Mre11 ten actividade de nuclease, pero parece estar implicada na recombinación homóloga, pero non na NHEJ.

As polimerases da familia X das ADN polimerases Pol λ e Pol μ (Pol4 en lévedos) enchen os ocos na febra do ADN durante a NHEJ. Os lévedos que carecen de Pol4 non poden unir os tramos 3' que sobresaen que se requiren para encher os ocos, pero seguen sendo eficientes para encher os ocos nos tramos 5' que sobresaen. Isto débese a que o cebador terminal usado para iniciar a síntese de ADN é menos estable nos tramos 3' que sobresaen, e necesita unha polimerase da NHEJ especializada.

 Ligazón 
O clomplexo da ADN ligase IV, consta da subunidade catalítica ADN ligase IV e o seu cofactor XRCC4 (Dnl4 e Lif1 en lévedos), realiza o paso de ligazón da reparación. A proteína XLF, tamén coñecida como Cernunnos, é homóloga da Nej1 de lévedos e tamén é necesaria para a NHEJ.  Aínda que se descoñece que o papel preciso da proteína XLF, sábese que interacciona co complexo XRCC4/ADN ligase IV e probablemente participa no paso de ligazón.Callebaut I, Malivert L, Fischer A, Mornon JP, Revy P, de Villartay JP. "Cernunnos Interacts with the XRCC4{middle dot}DNA-ligase IV Complex and Is Homologous to the Yeast Nonhomologous End-joining Factor Nej1. J Biol Chem. 2006 May 19;281(20) 13857-60.  PMID 16571728 Recentes evidencias suxiren que a XLF promove a readenilación da ADN ligase IV despois da ligazón, recargando a ligase e permitíndolle que catalice unha segunda ligazón.

 Outros 
En lévedos, a Sir2 foi identificada orixinalmente como unha proteína da NHEJ, pero agora sábese que é necesaria para a NHEJ só porque cómpre para a transcrición de Nej1.

 Regulación 
A elección entre a NHEJ e a recombinación homóloga para a reparación de roturas de dobe febra está regulada no paso inicial de resección do extremo 5' na recombinación. Neste paso, a febra 5' da rotura é degradada polas nucleases para crear colas 3' de cadea simple longas. As roturas de dobre febra que non foron extirpadas poden volverse a unir por NHEJ, pero a eliminación de incluso só uns poucos nucleótidos inhibe fortemente a NHEJ e destina a rotura a unha reparación por recombinación. A NHEJ é activa durante todo o ciclo celular, pero é máis importante durante a fase G1 cando se dispón dun molde non homólogo para a recombinación. Esta regulación realízaa a quinase dependente de ciclina Cdk1 (Cdc28 en lévedos), que é "apagada" na fase G1 e expresada nas fases S e G2. A Cdk1 fosforila a nuclease Sae2, permitindo que se inicie a extirpación de nucleótidos.

 Recombinación V(D)J 

A NHEJ desempeña un papel esencial na recombinación V(D)J, que é o proceso por medio do cal se xera a diversidade dos receptores da célula B e da T no sistema inmunitario dos vertebrados.Jung D, Alt FW. Unraveling V(D)J recombination; insights into gene regulation. Cell. 2004 Jan 23;116(2) 299-311. Review.  PMID 14744439 Na recombinación V(D)J, créanse roturas de dobre febra que rematan en forquita pola nuclease RAG1/RAG2, a cal cliva o ADN nos puntos onde hai secuencias sinal de recombinción. Estas forquitas son despois abertas pola nuclease Artemis e unidas por medio de NHEJ. Unha ADN polimerase especializada chamada desoxinucleotidil transferase terminal (TdT), que só se expresa no tecido linfático, engade nucleótidos sen usar molde aos extremos antes de unir a rotura. Este proceso acopla as rexións "variable" (V), "de diversidade" (D), e "de unión" (J), as cales ao ensamblárense orixinan a rexión variable dos xenes dos receptores BCR (de células B) e TCR (de células T). A diferenza da NHEJ celular típica, na cal unha reparación exacta é o resultado máis favorable, a reparación tendente ao ero na recombinación V(D)J é beneficiosa porque maximiza a diversidade na secuencia codificante dos xenes. Os pacientes que preentan mutacións en xenes que interveñen na NHEJ non poden producir células B e T funcionais e sofren unha inmunodeficiencia combinada grave.

 Nos telómeros 

Os telómeros están normalmente protexidos por unha "caparuza" que lles impide ser recoñecidos como roturas de dobre febra. A perda das proteínas desta caparuza causa o acurtamento dos telómeros e unha unión incorrecta durante a NHEJ, producindo cromosomas dicéntricos (con dous centrómeros), que son separados durante a mitose. Paradoxalmente, algunhas proteínas da NHEJ están implicadas na formación das caparuzas dos telómeros. Por exemplo, a Ku localiza os telómeros e a súa deleción orixina un acurtamento dos telómeros. A Ku tamén é necesaria para o silenciamento subtelomérico, o proceso polo cal os son "apagados" os xenes localizados preto dos telómeros.

 Consecuencias da disfunción 
Varias síndromes humanas están asociadas cunha NEHJ disfuncional.  As mutacións hipomórficas en LIG4 e XLF causan as síndromes LIG4 e XLF-SCID, respectivamente. Estas síndromes teñen moitas características comúns, como a radiosensibilidade celular, microcefalia e inmunodeficiencia combinada grave (SCID, severe combined immunodeficiency) debido a unha recombinación V(D)J defectuosa. As mutacións de perda de función en Artemis causan tamén SCID, pero estes pacientes non mostran os defectos neurolóxicos asociados coas mutacións de LIG4 ou XLF. A diferenza na gravidade pode explicarse polo papel exercido polas proteínas mutadas. Artemis é unha nuclease e crese que só é necesaria para reparar roturas de dobre cadea con extremos danados, mentres que a ADN ligase IV e XLF cómpren para todos os eventos da NHEJ.

Moitos xenes da NHEJ foron sometidos a knockout en ratos. A deleción de XRCC4 ou LIG4 causa letalidade embrionaria en ratos, o que indica que a NHEJ é esencial para a viabilidade dos mamíferos. A diferenza disto, os ratos que carecen de Ku ou de DNA-PKcs son viables, probablemente porque pode haber un baixo nivel de unión de extremos aínda en ausencia destes compoñentes. Todos os ratos mutantes para a NHEJ mostran o fenotipo SCID, sensibilidade á radiación inonizante e apoptose neuronal.

 Envellecemento 

Desenvolveuse un sistema para medir a eficiencia da NHEJ en ratos.  A eficiencia da NHEJ pode compararse entre tecidos dun mesmo rato e entre ratos de distintas idades. A eficiencia é maior en fibroblastos de riles, pulmón e pel, e menor nos fibroblastos do corazón e astrocitos do cerebro. Ademais, a eficiencia da NHEJ diminúe coa idade. Esta diminución é de 1,8 veces a 3,8 veces, dependendo do tecido, no rato de 5 meses de idade comparado co de 24 meses. Unha capacidade reducida da NHEJ pode causar un incremento no número de roturas de dobre febra non reparadas ou defectuosamente reparadas, que poden despois contribuír ao envellecementoBernstein H, Payne CM, Bernstein C, Garewal H, Dvorak K (2008).  Cancer and aging as consequences of un-repaired DNA damage. In: New Research on DNA Damages (Editors: Honoka Kimura and Aoi Suzuki) Nova Science Publishers, Inc., New York, Chapter 1, pp. 1-47. open access, but read only https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.php?products_id=43247  ISBN  978-1604565812  (teoría do envellecemento por danos no ADN). Unha análise do nivel da proteína Ku80 do NEHJ en humanos, vacas e ratos indicou que os niveis de Ku80 varían drasticamente entre especies, e que estes niveis están fortemente correlacionados coa lonxevidade das especies.

 Lista de proteínas implicadas na NHEJ en células humanas 
 Ku70/80
 DNA-PKcs
 ADN ligase IV
 XRCC4
 XLF
 Artemis
 ADN polimerase mu
 ADN polimerase lambda
 PNKP
 Aprataxina
 APLF
 BRCA1
 BRCA2

 Notas 

Categoría:Reparación do ADN