Bromuro de etidio

O bromuro de etidio é un composto que funciona como axente intercalante usado comunmente como marcaxe fluorescente para ácidos nucleicos en laboratrorios de bioloxía molecular en técnicas como a electroforese en xel de agarosa. Abréviase xeralmente como "EtBr", que é tamén a abreviatura do bromoetano. Cando se expón á luz ultravioleta, emite fluorescencia de cor laranxa, que se intensifica case 20 veces unha vez que se une ao ADN. Leva sendo utilizado en veterinaria desde a década de 1950 co nome de Homidium para tratar a tripanosomíase no gando vacún, unha doenza causada polos protozoos tripanosomas. A alta incidencia de resistencia a antibióticos deste parasito fai que estes non sexan útiles en certas áreas, onde se utiliza no seu lugar o composto relacionado cloruro de isometamidio. O bromuro de etidio pode ser un mutáxeno, un carcinóxeno, ou un teratóxeno, aínda que isto depende do organismo exposto e das circunstancias da exposición.

 Estrutura, química e fluorescencia 
miniatura|esquerda|200px|Espectro de absorción do bromuro de etidio.
Como a maioría dos compostos fluorescentes, o bromuro de etidio é aromático. O seu residuo heterocíclico central denomínase fenantridina, que é isómero da tinguidura fluorescente acridina. A absorción máxima do bromuro de etidio en solución acuosa é de 210 nm e 285 nm, que corresponde á luz ultravioleta. Como resultado desta excitación, o bromuro de etidio emite luz laranxa con lonxitude de onda de 605 nm.

A razón da intensa fluorescencia que presenta o bromuro de etidio despois de unirse ao ADN non se debe probablemente á estabilización ríxida do residuo fenilo, porque se comprobou que o anel fenilo se proxecta fóra das bases intercaladas. De feito, o grupo fenilo está case perpendicular ao plano do sistema do anel, xa que rota sobre o seu enlace para encontrar unha posición na que afecta minimamente ao sistema do anel. Crese máis ben que se debe ao ambiente hidrofóbico que hai entre os pares de bases. Ao moverse neste ambiente hidrofóbico e afastado do solvente, o catión etidio é forzado a repeler calquera molécula de auga que estivese asociada con el. Como a auga é un amortecedor da fluorescencia moi eficiente, a retirada destas moléculas de auga permítelle ao etidio emitir fluorescencia.

 Aplicacións 
miniatura|esquerda|200px|Mostra de ADN separada usando electroforese en xel de ácidos nucleicos e tinguida con bromuro de etidio, que emite luz laranxa despois de unirse ao ADN.
O bromuro de etidio é utilizado comunmente para detectar ácidos nucleicos nos laboratorios de bioloxía molecular. No caso do ADN este é xeralmente bicatenario procedente de PCRs, fragmentos de restrición etc. O ARN monocatenario pode detectarse tamén, xa que xeralmente se reprega sobre si mesmo e así proporciona apareamentos de bases locais para que se intercale a tinguidura. A detección realízase normalmente iluminando con luz ultravioleta o xel de agarosa electroforético que contén os ácidos nucleicos. Como a luz ultravioleta é daniña para a vista e a pel, os xeles marcados con bromuro de etidio adoitan observarse indirectamente usando unha cámara pechada na que se toman imaxes fotográficas da fluorescencia. Cando é necesaria a visión directa, deben protexerse adecuadamente os ollos e a pel. No laboratorio as propiedades intercalantes foron desde hai tempo utilizadas para minimizar a condensación cromosómica cando se expón un cultivo a axentes que deteñen a mitose durante a súa extracción. As preparacións microscópicas resultantes permiten un alto grao de resolución, polo que hai maior confianza para determinar a integridade estrutural na análise microscópica.

O bromuro de etidio foi tamén usado amplamente para reducir o número de copias do ADN mitocondrial en células en proliferación. Os efectos do bromuro de etidio no ADN mitocondrial utilízanse en veterinaria para tratar a tripanosomíase en vacúns, xa que se une ás moléculas de ADN cinetoplástico do protozoo tripanosoma causante da doenza, e cambia a súa conformación á forma ADN Z. Esta forma inhibe a replicación do ADN cinetoplástico, o que é letal para o tripanosoma.

 Alternativas 
Hai alternativas ao uso do bromuro de etidio, que son pretendidamente menos perigosas e teñen un mellor funcionamento.Dean Madden, Safer stains for DNA. acceso 2009-12-08. Por exemplo, algúns investigadores usan varias tinguiduras ou marcaxes baseadas no SYBR e hai outras tinguiduras de uso emerxente como a Novel Juice. As tinguiduras SYBR son menos mutaxénicas que o bromuro de etidio na proba de Ames con extracto de fígado. Con todo, atopouse que o Verde SYBR I (SYBR Green I) era, en realidade, máis mutaxénico que o bromuro de etidio para as células bacterianas expostas á luz UV (que se usa para visualizar ambas as tinguiduras). Este pode ser o caso tamén doutras tinguiduras supostamente "máis seguras", pero aínda que os detalles de mutaxenicidade e toxicidade están dispoñibles Novel Juice testing report non foron publicados en revistas científicas revisadas por pares. A MSDS para o SYBR Safe informa dun LD50 para ratos de >5 g/kg, o cal é maior que o do bromuro de etidio (1,5g/kg), pero en ambos os casos son varias ordes de magnitude maiores que as concentracións usadas en bioloxía molecular. Ademais, moitas tinguiduras alternativas están en suspensión en DMSO, que ten implicacións para a saúde de seu, incluíndo un incremento da absorción na pel de compostos orgánicos. Malia as vantaxes de funcionamento de usar tinguiduras SYBR en troques de bromuro de etidio para propósitos de tinguidura, moitos investigadores seguen preferindo este último porque é considerablemente máis barato.

 Riscos para a saúde 
miniatura|esquerda|200px|O bromuro de etidio intercalado entre dous pares de bases adenina-timina. A intercalación pode causar mutacións no ADN.
O bromuro de etidio crese que actúa como un mutáxeno porque se intercala na dobre hélice do ADN (é dicir, insírese entre as dúas febras), deformando o ADN. Isto podería afectar aos procesos biolóxicos do ADN, como a replicación e a transcrición. Atopouse que o bromuro de etidio é mutaxénico para as bacterias na proba de Ames, pero só despois dun tratamento con homoxenado de fígado, que simula a degradación metabólica da molécula que está sendo probada. A non detección de mutaxenicidade en ausencia de homoxenado de fígado indica que o bromuro de etidio non é directamente mutaxénico, senón que o son os seus metabolitos. A identidade destes metabolitos mutaxénicos descoñécese. En USA o Programa Nacional Mutaxénico considerouno como non mutaxénico para as ratas e ratos. Estas conclusións apóianse nun estudo de carcinoxenidade subcrónica en ratos, onde non se detectaron efectos mutaxénicos. O uso de bromuro de etidio (marca Homidium) en animais para tratar a infección por tripanosomas suxire que a toxicidade e mutaxenicidade non son altas. Realizáronse estudos en animais para avaliar o bromuro de etidio como potencial axente antitumoroxénico quimioterápico. O seu uso quimioterapéutico débese á súa toxicidade para as mitocondrias. Un estudo máis recente indica que actúa como un veleno para a topoisomerase I, igual que varios fármacos anticanceríxenos en humanos. Os estudos antes mencionados non apoian a idea que xeralmente se ten de que o bromuro de etidio é un potente mutáxeno para os humanos, pero indican que pode ser tóxico en altas concentracións.

A maior parte dos usos do bromuro de etidio no laboratorio (0,25–1 microgramo/mL) están por debaixo dos niveis necesarios para a toxicidade, e son 3 ordes de magnitude máis baixos que as doses terapéuticas usadas no gando. O nivel é alto dabondo para que a exposición poida interferir coa replicación do ADN mitocondrial nalgunhas liñas celulares humanas, aínda que as implicacións disto non están claras. Cómpre facer ensaios en humanos e estudos máis amplos en animais mamíferos para chegar a comprender o risco potencial que supón o bromuro de etidio para os que traballan nos laboratorios.

O bromuro de etidio pode engadirse ao medio YPD e usarse como un inhibidor do crecemento celular.Caesar, Robert, Jonas Warringer, and Anders Blomberg. "Physiological Importance and Identification of Novel Targets for the N-Terminal Acetyltransferase NatB -- Caesar et al. 5 (2): 368 --." Eukaryotic Cell. 16 Dec. 2005. Web. 31 Jan. 2010. <http://ec.asm.org/cgi/content/full/5/2/368 >.

 Utilización e eliminación 
O bromuro de etidio non está considerado nas regulacións como un residuo perigoso a baixas concentracións, pero é tratado como residuo perigoso por moitas organizacións. Os materiais con estes residuos deben ser manipulados de acordo coa folla de datos de seguridade deste material (MSDS).
A eliminación no laboratorio de bromuro de etidio é obxecto de controversia. O bromuro de etidio pode ser degradado quimicamente, ou recollido ou incinerado. É común que os residuos de bromuro de etidio que están por debaixo dunha concentración esixida se eliminen como outro lixo normal (por exemplo, verténdoos por un desaugadoiro). Unha práctica común é tratar o bromuro de etidio con hipoclorito de sodio (lixivia) antes da súa eliminación. Segundo Lunn e Sansone, a degradación química usando lixivia rende compostos que son mutaxénicos na proba de Ames. Faltan datos sobre os efectos mutaxénicos dos produtos de degradación. Lunn e Sansone describen métodos máis efectivos para a súa degradación. Non obstante, recoméndase a eliminación do bromuro de etidio de solucións con resinas de intercambio iónico de amberlita ou carbón vexetal activado. Para este uso disponse de varios produtos comerciais.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Bibliografía 


Categoría:Aminas
Categoría:Compostos de amonio cuaternario
Categoría:Carcinóxenos