Termodinámica dos ácidos nucleicos

A termodinámica dos ácidos nucleicos é o estudo de como a temperatura afecta á estrutura en dobre hélice dos ácidos nucleicos, fundamentalmente do ADN bicatenario. Cando un ADN bicatenario perde a súa estrutura en dobre hélice e as súas dúas febras se separan dise que se produciu a desnaturalización do ADN. A temperatura de fusión do ADN (ou Tm, do inglés melting temperature) defínese como a temperatura á cal a metade da lonxitude das fibras do ADN perde a súa estrutra habitual en dobre hélice e pasa a un estado monocatenario ou de enrolamento aleatorio. Por tanto, esta "fusión" non significa que o ADN pase ao estado líquido, senón que ten que ver co seu estado bicatenario ou monocatenario. A Tm depende da lonxitude da molécula de ADN e da súa secuencia de nucleótidos específica; canto máis longo ou máis contido GC, máis alta é. A desnaturalización dun ADN bicatenario (separación das súas dúas febras) debida á temperatura pode ser total ou parcial.

 Conceptos 

 Hibridación 

A hibridación de ácidos nucleicos é o proceso de establecer unha interacción específica de secuencia non covalente entre dúas ou máis febras de ácido nucleico que presentan complementariedade de bases, orixinando un só complexo, que no caso de dúas febras se denomina dúplex de ácido nucleico. Os oligonucleótidos, o ADN, ou o ARN únense ao seu complemento en condicións normais espontaneamente, polo que dúas febras perfectamente complementarias se unirán unha a outra facilmente. Para reducir a diversidade e obter os complexos máis preferidos enerxeticamente, utilízase no laboratorio unha técnica denominada annealing (véxase máis abaixo). Porén, debido ás diferentes xeometrías moleculares dos nucleótidos, unha soa inconsistencia entre as dúas febras fará que a unión entre elas sexa enerxeticamente menos favorable. A medición dos efectos da incompatibilidade de bases cuantificando a temperatura á cal as dúas febras se unen (anneal) pode proporcionar información sobre a similitude na secuencia de bases entre as dúas febras que se están hibridando. Os complexos poden ser disociados por desnaturalización térmica, tamén chamada fusión. En ausencia de factores negativos externos, o proceso de hibridación e fusión pode repetirse indefinidamente, o cal é a base da técnica da reacción en cadea da polimerase (PCR). Normalmente, os pares de bases de ácidos nucleicos que se forman son A=T e G≡C, e este último é máis estable.

 Desnaturalización do ADN 
miniatura|dereita|Curva de absorbancia durante a desnaturalización dun ADN que mostra o efecto hipercrómico.
A desnaturalización do ADN, tamén chamada fusión do ADN, é o proceso polo cal o ADN bicatenario se desenrosca e separa en dúas febras monocatenarias debido a que rompen as pontes de hidróxeno e as atraccións hidrofóbicas entre as bases. A desnaturalización prodúcese xeralmente por causa dun aumento de temperatura (desnaturalización térmica), pero pode producirse tamén por efecto de substancias químicas como a urea.Heike Summer, René Grämer, and Peter Dröge. Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. 2009; (32): 1485. Published online 2009 Oct 29. doi: 10.3791/1485. Theodore T. Herskovits. Nonaqueous Solutions of DNA; Denaturation by Urea and Its Methyl Derivatives. Biochemistry, 1963, 2 (2), pp 335–340. DOI: 10.1021/bi00902a027. 
 .

Se medimos a cantidade de luz ultravioleta absorbida (absorbancia) durante a desnaturalización dun ADN, obsérvase que esta aumenta conforme aumenta a temperatura e as febras do ADN se van separando. Este efecto chámase efecto hipercrómico e débese a que as interaccións entre as bases (pontes de hidróxeno) cando están en forma de dobre hélice alteran a resonancia dos aneis das bases nitroxenadas facendo que absorban menos luz, pero cando se separa a dobre hélice estas restricións desaparecen e absórbese máis luz.

O proceso de desnaturalización do ADN pode utilizarse para analizar algúns aspectos do ADN. Como o apareamento de bases guanina-citosina é xeralmente máis forte que o adenosina-timina, a cantidade de guanina e citosina dun ADN, denominada contido GC pode ser estimada medindo a temperatura á que o ADN xenómico funde. Temperaturas de fusión máis altas correspóndense con contidos GC máis altos.

A desnaturalización do ADN pode tamén utilizarse para detectar diferenzas de secuencia entre dúas secuencias de ADN diferentes. O ADN quéntase e desnaturalízase ata que estea no seu estado de febras monocatenarias, e a mestura arrefríase despois para permitir que as febras con secuencias similares se rehibriden. Fórmanse moléculas híbridas entre secuencias similares e as diferenzas de secuencia orixinan unha interrupción no apareamento de bases. A escala xenómica, o método tense utilizado para estimar a distancia xenética entre dúas especies, un proceso coñecido como hibridación ADN-ADN. No contexto dunha soa rexión illada do ADN, poden utilizarse xeles de gradiente de desnaturalización e xeles de gradiente de temperatura para detectar a presenza de pequenas discordancias entre as secuencias, un proceso chamado electroforese en xel en gradiente de temperatura.

Os métodos de análise do ADN baseados na temperatura de fusión teñen a desvantaxe de ser aproximacións para o estudo das secuencias, de modo que a secuenciación de ADN considérase xeralmente como un método máis exacto.

O proceso de fusión do ADN tamén se utiliza en técnicas de bioloxía molecular, especialmente na reacción en cadea da polimerase. Aínda que a temperatura de fusión do ADN non é diagnóstica na técnica, os métodos para estimar a Tm son importantes para determinar cales son as temperaturas máis axeitadas para usalas nun protocolo. As temperaturas de fusión do ADN poden tamén utilizarse como unha aproximación para igualar as forzas de hibridación dun conxunto de moléculas, por exemplo as sondas de oligonucleótidos das micromatrices de ADN (DNA microarrays).

 Annealing 
En xenética, annealing (traducido ás veces por anelamento, temperado, aliñamento, hibridación) significa o apareamento por formación de pontes de hidróxeno para formar unha dobre hélice entre dúas cadeas complementarias de ácidos nucleicos, ADN ou ARN. O termo utilízase moitas veces para describir a unión a unha febra de ADN por apareamento de bases dunha sonda de ADN ou dun cebador ou primer durante a reacción en cadea da polimerase. O termo tamén se usa para describir a re-formación (reannealing) da dobre hélice a partir de ADN que foi previamente desnaturalizado termicamente e separado en febras complementarias. Proteínas como RAD52 axudan ao annealing do ADN.

 Empillamento 
+ Estabilidade de fusión de empillamentos de pares de bases (ADN B) Paso ΔG° de fusión37  (Kcal/mol) T A -0,12 T G or C A -0,78 C G -1,44 A G or C T -1,29 A A or T T -1,04 A T -1,27 G A or T C -1,66 C C or G G -1,97 A C or G T -2,04 G C -2,70

O empillamento (stacking) é a interacción estabilizante entre as superficies planas de bases adxacentes superpostas. O empillamento pode ocorrer con calquera cara da base, é dicir, 5'-5', 3'-3' e viceversa.

Ao empillamento en "moléculas de ácidos nucleiscos libres contribúe principalmente a forza intermolecular, especificamente a atracción electrostática entre aneis aromáticos, un proceso tamén coñecido como empillamento pi. Para sistemas biolóxicos con auga como solvente, o efecto hidrofóbico contribúe e axuda á formación dunha hélice. O empillamento é o principal factor estabilizante na dobre hélice do ADN.

A contribución do empillamento á enerxía libre da molécula pode estimarse experimentalmente observando o equilibrio dobrado-empillado en ADN con amosegas. Tal estabilización é dependente da secuencia. A extensión da estabilización varía coa concentración de sal e a temperatura.

 Termodinámica do modelo de dous estados e cálculo de Tm 
Utilízanse varias fórmulas para calcular os valores de Tm. Algunhas fórmulas son máis axeitadas para predicir as temperaturas de fusión de dúplex de ADN. Para oligonucleótidos de ADN, é dicir, curtas secuencias de ADN, a termodinámica da hibridación pode ser adecuadamente descrita como un proceso de dous estados. Nesta aproximación non se ten en conta a posibilidade de que existan estados intermedios de unión parcial na formación do estado de dobre hélice a partir de oligonucleótidos dunha soa febra. Asumindo isto, poden describirse elegantemente os parámetros termodinámicos da formación de ácidos nucleicos bicatenarios AB a partir de ácidos nucleicos monocatenarios A e B.

AB ↔ A + B

A constante de equilibrio para esta reacción é . Segundo a ecuación de Van't Hoff, a relación entre a enerxía libre, ΔG, e K é ΔG° = -RTln K, onde R é a constante da lei dos gases perfectos, e T é a temperatura en kelvins da reacción. Isto dá, para o sistema de ácido nucleico,

.

A temperatura de fusión Tm, é a que hai cando a metade do ácido nucleico de dobre cadea está disociado. Se non están presentes outros ácidos nucleicos, entón [A], [B], e [AB] serán iguais, e iguais á metade da concentración inicial de ácido nucleico bicatenario, [AB]inicial. Isto dá unha expresión para o punto de fusión dun ácido nucleico dúplex de

.

Como ΔG° = ΔH° -TΔS°, Tm tamén vén dada por

.

Os termos ΔH° e ΔS° danse xeralmente para a asociación das febras e non para a reacción de disociación (véxase máis abaixo un exemplo no método do veciño máis próximo). Esta fórmula entón convértese en:

, onde [B]total < [A]total.

Como xa se dixo, esta ecuación está baseada na asunción de que só están implicados dous estados na fusión: o estado de dúas febras en dobre hélice e o estado de enrolamento aleatorio de febras separadas. Porén, os ácidos nucleicos pode fundir por medio de varios estados intermedios. Para ter en conta este complicado comportamento, deben utilizarse métodos de mecánica estatística, o que é especialmente importante para secuencias longas.

 Estimación de propiedades termodinámicas a partir dunha secuencia de ácido nucleico 
No parágrafo mostrouse como están relacionados a temperatura de fusión e os parámetros termodinámicos (ΔG° ou ΔH° & ΔS°). A partir da observación das temperaturas de fusión poden determinarse experimentalmente os parámetros termodinámicos. E inversamente, cando se coñecen os parámetros termodinámicos dunha secuencia de ácido nucleico dada, pode predicirse a temperatura de fusión, o que é moi importante para as aplicacións. Para oligonucleótidos pode obterse unha boa aproximación destes parámetros polo método do veciño máis próximo.

 Método do veciño máis próximo 
A interacción entre as bases de diferentes febras depende en parte das bases veciñas. O modelo de veciñño máis próximo, en vez de tratar a hélice de ADN como unha serie de interaccións entre pares de bases, trátaa como unha serie de interaccións entre pares de bases "veciñas". Así, por exemplo, o ADN que se mostra abaixo ten as interaccións co veciño máis próximo indicadas polas frechas.
    ↓↓↓↓↓
5' C-G-T-T-G-A 3'
3' G-C-A-A-C-T 5'
A enerxía libre de formar este ADN a partir de febras individuais, ΔG°, represéntase (a 37 °C) como

ΔG°37(predito) = ΔG°37(CG iniciación) + ΔG°37(CG/GC) + ΔG°37(GT/CA) + ΔG°37(TT/AA) + ΔG°37(TG/AC) + ΔG°37(GA/CT) + ΔG°37(AT iniciación)

O primeiro termo representa a enerxía libre do primeiro par de bases, CG, en ausencia dun veciño máis próximo. O segundo termo inclúe tanto a enerxía libre de formación do segundo par de bases, GC, e a interacción de apiamento entre este par de bases e o par de bases previo. O resto dos termos defínense de forma similar. En xeral, a enerxía libre de formación dun ácido nucleico dúplex é

.

Cada termo ΔG° ten un parámetro de entalpía, ΔH°, e outro de entropía, ΔS°, polo que o cambio na enerxía libre tamén virá dado por

.

Os valores de ΔH° e ΔS° determináronse para os dez posibles pares de interaccións. Estes son os dados na Táboa 1, xunto co valor de ΔG° calculado a 37 °C. Usando estes valores, o valor de ΔG37° para a hélice de ADN mostrado arriba calculouse que é −22,4 kJ/mol. O valor experimental é −21,8 kJ/mol.
+ Táboa 1.  Parámetros de veciño máis próximo para dúplex ADN/ADN en 1 M NaCl. Secuencia do veciño máis próximo  (5'-3'/3'-5') °  kJ/mol °  J/(mol·K) °37  kJ/mol AA/TT −33,1  −92,9  −4,26 AT/TA −30,1  −85,4  −3,67 TA/AT −30,1  −89,1  −2,50  CA/GT −35,6  −95,0  −6,12 GT/CA −35,1  −93,7  −6,09 CT/GA −32,6  −87,9  −5,40 GA/CT −34,3  −92,9  −5,51 CG/GC −44,4  −113,8  −9,07 GC/CG −41,0  −102,1  −9,36 GG/CC −33,5  −83,3  −7,66 Par de bases terminal A-T 9,6  17,2  4,31 Par de bases terminal G-C 0,4  −11,7  4,05
Os parámetros asociados cos dez grupos de veciños mostrados na Táboa 1 determínanse a partir dos puntos de fusión de oligonucleótidos dúplex curtos. Curiosamente, dedúcese que só oito dos dez grupos son independentes.

O modelo do veciño máis próximo pode estenderse para pares que non son pares de Watson e Crick para incluír parámetros para interaccións entre discordancias na secuencia e pares de bases veciñas. Isto permite a estimación de parámetros termodinámicos de secuencias que conteñan discordancias illadas, como por exemplo (as frechas indican as discordancias na secuencia)
          ↓↓↓
5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'
3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'

Estes parámetros foron afinados en experimentos de fusión e na literatura pode atoparse unha ampliación da Táboa 1 que inclúe discordancias na secuencia.

Un modo máis realista de modelizar o comportamento dos ácidos nucleicos sería ter parámetros que dependan dos grupos veciños a ambos os lados dun nucleótido, o que daría unha táboa con entradas como "TCG/AGC". Porén, isto implicaría traballar con arredor de 32 grupos, e o número de experimentos necesarios para obter datos fiables para tantos grupos sería considerable. Como as predicións feitas a partir do método do veciño máis próximo concordan razoablemente ben cos resultrados experimentais, os esforzos extra que comprirían para desenvolver un modelo diferente poden non pagar a pena.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Punto de fusión (paso de sólido a líquido)
 Cebador (primer) para cálculos de Tm
 Par de bases
 ADN complementario
 Western blot

 Ligazóns externas 
 Tm cálculos en OligoAnalyzer – Integrated DNA Technologies
 Cálculos de termodinámica do ADN – Tm, perfil de fusión, discordancias, cálculos de enerxía libre
 Cálculos de Tm – en bioPHP.org.
 https://web.archive.org/web/20080516194508/http://www.promega.com/biomath/calc11.htm#disc
 Cálculos de Tm de Invitrogen
 software de AnnHyb Open Source para cálculos de Tm usando o método do veciño máis próximo
 Notas técnicas de Sigma-Aldrich
 Cálculos de Primer3 
 "Discovery of the Hybrid Helix and the First DNA-RNA Hybridization" de Alexander Rich
 uMelt: Predición da curva de fusión
 Sequence Tm Utility v1.5
 Nearest Neighbor Database: Proporciona unha descrición dos parámetros do veciño máis próximo dunha interacción ARN-ARN e exemplos do seu uso.

Categoría:ADN
Categoría:Ácidos nucleicos
Categoría:Bioloxía molecular
Categoría:Biotecnoloxía