Micromatriz de ADN

Sinónimos
 Micromatrices
 Microarray de ADN
 DNA microarray
 Microarranxo de ADN
 Oligonucleótido array
 Micromatriz de ADN
 Gene chip
 ADN array
 Arranxo de ADN
 Biochips de ADN
Unha micromatriz de ADN (DNA microarray), tamén chamada chip de ADN ou biochip de ADN ou microarranxo de ADN, é unha superficie sólida á que se unen un conxunto de "puntos" (sitios, manchas) microscópicos (spots ou features na literatura inglesa) que levan fragmentos de ADN. Os científicos usan estas micromatrices para medir os niveis de expresión dun gran número de xenes simultaneamente ou para xenotipificar múltiples rexións dun xenoma. Cada unha destas "manchas" con ADN contén picomoles (10−12 moles) dunha secuencia de ADN específica, chamada sonda (probe ou reporteiros ou oligos). Estas secuencias poden ser un curto fragmento dun xene ou outro elemento de ADN que se utiliza para hibridalo a unha mostra "diana" (target) de ADNc ou ARNc (tamén chamado ARN antisentido). A hibridación entre a sonda e a diana xeralmente detéctase e cuantifícase porque a diana detectada está etiquetada cun fluoróforo ou con prata ou con quimioluminescencia, o que serve para determinar a abundancia relativa da secuencia do ácido nucleico na diana.

Unha das súas principais aplicacións é identificar xenes cunha expresión diferencial en condicións distintas. Por exemplo, para detectar xenes que producen certas doenzas comparando os niveis de expresión entre células sas e células que están desenvolvendo certos tipos de doenzas.

 A micromatriz básica 
miniatura|300px|Exemplo de chip de ADN con 40.000 sondas.
Como unha matriz (array) pode conter decenas de miles de sondas, un experimento cunha micromatriz (microarray) pode realizar moitas probas xenéticas en paralelo. Por tanto, o uso destas matrices acelerou drasticamente moitos tipos de investigacións. Nas micromatrices estándar as sondas son sintetizadas e despois unidas por medio de enxeñaría de superficie a unha superficie sólida por enlace covalente a unha matriz química (por medio de epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida ou outros). A superficie sólida pode ser vidro ou un chip de silicio, e nese caso denomínanse coloquialmente chip Affy se se utiliza un chip Affymetrix. Outras plataformas de micromatrices, como Illumina, utilizan boliñas, en vez de soportes sólidos grandes. Alternativamente, poden construírse micromatrices por síntese directa de sondas de oligonucleótidos en superficies sólidas. As matrices de ADN diferéncianse doutros tipos de micromatrices só en que ou ben miden o ADN ou usan o ADN como parte do seu sistema de detección.

As micromatrices de ADN poden utilizarse para medir cambios nos niveis de expresión para detectar polimorfismos dun só nucleótido (SNPs), ou para xenotipificar ou resecuenciar unha molécula diana. As micromatrices tamén se diferencian na súa fabricación, funcionamento, exactitude, eficiencia, e custo. Outros factores adicionais nos experimentos con micromatrices son o deseño experimental e os métodos de análise dos datos.

 Principio 
miniatura|400px|Hibridación da diana coa sonda.
O principio fundamental das micromatrices é a hibridación entre dúas febras de ADN, grazas á propiedade que teñen as secuencias de ADN complementarias de aparearse especificamente unha con outra formando enlaces de hidróxeno entre pares de bases nucleotídicas complementarias. Se hai un elevado núumero de pares de bases complementarias nunha secuencia nucleotídica, vaise producir un enlazamento non covalente máis forte entre as dúas febras. Despois de facer un lavado que arrastre as secuencias que non teñan especificidade de enlace, só quedarán hibridadas as febras fortemente apareadas. As secuencias diana etiquetadas flourescentemente que se unen a unha secuencia de sonda xeran un sinal que depende das condicións de hibridación (como a temperatura), e o lavado despois da hibridación. A forza total do sinal xerado desde un dos "puntos" ou "sitios" da micromatriz (spot, feature), depende da cantidade de mostra diana que se una ás sondas presentes nese "punto". As micromatrices usan unha cuantización relativa na cal se compara a intensidade dun destes "puntos" (feature) coa intensidade do mesmo "punto" en diferentes condicións (ver tamén os experimentos de dous canais máis abaixo) e a identidade do "punto" coñécese pola súa posición.

miniatura|900px|none|Pasos necesarios nun experimento de micromatrices.

 Tipos 
miniatura|dereita|150px|Dous chips Affymetrix. Pode verse unha correspondencia no fondo á esquerda para comparar o tamaño.
Existen moitos tipos de matrices e a maior distinción que se pode facer entre elas é se están dispostas espacialmente sobre unha superficie ampla ou en boliñas codificadas:
 A matriz de fase sólida tradicional é unha colección de "puntos" ordenados microscopicamente, chamados features, cada unha con miles de sondas específicas idénticas unidas a unha superficie sólida, como un vidro, plástico ou biochip de silicio (xeralmente coñecido por chip xenómico, chip de ADN ou matriz de xenes). Poden situarse miles destas en localizacións coñecidas nunha soa micromatriz de ADN.
 A matriz de boliñas alternativa é unha colección de boliñas de polistireno microscópicas, cada unha das cales leva unha sonda específica e dúas ou máis marcaxes, que non interfiren coa marcaxe fluorescente usada na secuencia diana.

As principais técnicas de micromatrices de ADN son:

 Micromatrices de dous canais (ou dúas cores) 
miniatura|dereita|Diagrama dun experimento típico de chip de ADN con dobre canal.

Neste tipo de chips de ADN (en inglés spotted microarrays), as sondas son oligonucleótidos, ADN complementario (ADNc) ou pequenos fragmentos de reacción en cadea da polimerase, que corresponden a ARN mensaxeiros. Neste tipo de chip de ADN utilízanse preparacións de ADNc obtido a partir de dúas mostras biolóxicas distintas; por exemplo, de células cultivadas en dúas condicións distintas. O ADNc de cada mostra márcase cun fluoróforo diferente, e as dúas preparacións de ADNc marcadas mestúranse e hibridan sobre o mesmo chip de ADN. Unha vez realizado este primeiro paso, procédese ao escaneo do resultado e á visualización do mesmo. Desta forma pódense detectar xenes que se activan ou se reprimen en distintas condicións. A contrapartida destes experimentos é que non se poden observar niveis absolutos na expresión e requiren PCR cuantitativa (qPCR) para unha análise cuantitativa absoluta.

 Chips de oligonucleótidos de ADN 
Nos chips de oligonucleótidos de ADN ou micromatrices de canal único, as sondas deséñanse a partir dunha secuencia coñecida ou dun ARNm predito. Estes chips de ADN dan estimacións do nivel de expresión, mais nunha mesma matriz non se poden observar distintas condicións, polo que hai que utilizar un chip para cada condición.

A idea principal desta técnica é que as sondas se sintetizan in situ (no chip).

Non están baseados na hibridación competitiva, é dicir, un chip, unha mostra.
As secuencias constrúense na superficie do chip mediante o alongamento secuencial dunha cadea en crecemento cun só nucleótido utilizando fotolitografía.

 GeneChips de Affymetrix 
 Affymetrix é a compañía líder neste tipo de chips.
 Denomínanse xenericamente "GeneChips".
 Cada xene é representado por un conxunto de secuencias curtas que o caracterizan.
 Algúns chips teñen xenomas completos con máis de 50.000 grupos de sondas.

 Chips de ADN para xenotipificación 
Os chips de ADN poden utilizarse para "ler" as secuencias dun xenoma en determinadas posicións. As matrices de SNP (SNP arrays) son un tipo particular de matrices que se utilizan para identificar variacións individuais e nas poboacións. Os oligonucleótidos pequenos poden identificar polimorfismos dun só nucleótido (SNPs, single nucleotide polymorphisms) que poderían ser os responsables das variacións xenéticas dentro dunha poboación, e a fonte de susceptibilidade a distintas enfermidades xenéticas e mesmo a certos tipos de cancro. En xeral, a aplicación destas técnicas de xenotipificación ou xenotipado é o uso forense e o médico, xa que son rápidas para descubrir ou medir a predisposición a doenzas ou mesmo permitir o uso de certos medicamentos para tratar determinadas doenzas segundo sexa o ADN do doente ou doante. Os chips de ADN de SNPs tamén se utilizan para a identificación de mutacións somáticas en cancros, sobre todo a perda de heterocigose, a amplificación ou a deleción de rexións de ADN no xenoma individual de pacientes afectados, é dicir, a detección de aberracións cromosómicas.

 Aplicacións 
As micromatrices de ADN poden utilizarse para detectar ADN (como na hbridación xenómica comparativa), ou detectar ARN (xeralmente en forma de ADNc despois de facer unha transcrición inversa), o cal pode ser ARN que é traducido a proteínas ou non. O proceso de medir a expresión xénica por medio de ADNc denomínase análise de expresión ou perfil de expresión.

As principais aplicacións son:
 Aplicación ou tecnoloxía Sinopse Perfil de expresión xénica Nun experimento de perfil de ARNm ou de expresión xénica monitorízanse simultaneamente os niveis de expresión de miles de xenes para estudar os efectos de certos tratamentos, doenzas, e estadios de desenvolvemento sobre a expresión xénica. Por exemplo, o perfil de expresión xénica baseado en micromatrices pode usarse para identificar aqueles xenes cuxa expresión cambia en resposta a patóxenos ou outros organismos en comparación coas células non infectadas, ou en estados de enfermidade en comparación co estado san. Hibridación xenómica comparativa Avalía o contido do xenoma en diferentes células ou en organismos estreitamente relacionados. GeneID Son pequenas micromatrices para comprobar os IDs de organismos en mostras de alimentos (como en OMX ), micoplasmas en cultivo celular, ou patóxenos para detectar doenzas, principalmente combinando a PCR coa tecnoloxía de micromatrices. Inmunoprecipitación de cromatina sobre chip (ChIP-on-chip) Poden illarse secuencias de ADN unidas a unha determinada proteína inmunoprecipitando esa proteína (ChIP); estes fragmentos poden despois hibridarse a unha micromatriz (como o tiling array), o que permite a determinación da ocupación dos sitios de unión ás proteínas por todo o xenoma. Exemplos de proteínas que se inmunoprecipitan son as modificacións de histonas (H3K27me3, H3K4me2, H3K9me3 etc.), as proteínas do grupo Polycomb (PRC2:Suz12, PRC1:YY1) e as proteínas do grupo trithorax (Ash1) para estudar a paisaxe epixenética, ou a ARN polimerase II para estudar a paisaxe de transcrición. DamID Analogamente ao ChIP, poden illarse rexións xenómicas ás que se une unha proteína de interese e utilizar unha sonda nunha micromatriz para determinar a ocupación do sitio de unión. A diferenza da ChIP, o DamID non require anticorpos pero fai uso da metilación da adenina preto dos sitios de unión da proteína para amplificar selectivamente ditas rexións, que se introduce expresando pequenas cantidades da proteína de interese fusionadas ao encima bacteriano ADN adenina metiltransferase. Detección de SNP Identificación de polimorfismos dun só nucleótido (SNP) entre alelos nunha poboación ou entre poboacións. Hai varais aplicacións das micromatrices que fan uso da detección de SNP, como a xenotipificación, análises forenses, medición da predisposición xenética a unha doenza, identificación de candidatos a fármacos, avaliación de mutacións na liña xerminal en individuos ou mutacións somáticas en cancros, avaliar a perda de heterocigose, ou a análise de ligamento xenético. Detección de splicing alternativo Un deseño de matriz da zona de unión de exóns (exon junction array) usa sondas específicas para os sitios de empalme potenciais ou esperados de exóns preditos para un xene. É de densidade ou cobertura intermedia, con respecto a unha matriz de expresión xénica típica (con de 1 a 3 sondas por xene) e un tiling array xenómico (con centos ou miles de sondas por xene). Utilízase para probar a expresión de formas de splicing alternativo dun xene. As matrices de exóns teñen un deseño diferente, e empregan sondas deseñadas para detectar cada exón individual para xenes preditos ou coñecidos, e pode utilizarse para detectar diferentes isoformas de splicing. Micromatriz de xenes de fusión Unha micromatriz de xenes de fusión pode detectar transcritos de fusión, por exemplo, de mostras de cancro. Baséase nas micromatrices de splicing alternativo. A estratexia de deseño de oligos permite combinar as medidas de zonas de unión de transcritos quiméricos con medidas de exóns de compañeiros de fusión individuais. Tiling array  Os tiling arrays xenómicos (literalmente matrices "de tellas ou baldosas") consisten en sondas solapadas deseñadas para representar densamente unha rexión xenómica de interese, ás veces tan grande coma un cromosoma humano completo. O propósito é detectar empiricamente a expresión de transcritos ou formas producidas por splicing alternativo, que poderían non ter sido preditas ou coñecidas previamente. É útil para caracterizar rexións que xa foron secuenciadas, pero das que non se coñecen moitas das funcións locais. 

 Fabricación 
miniatura|300px|Un robot imprimindo unha micromatriz de ADN na Universidade de Delaware.
As micromatrices poden fabricarse de diferentes xeitos, dependendo do número de sondas a examinar, custos, requirimentos de personalización, e o tipo de cuestión científica que se vai examinar. As matrices poden ser de só 10 sondas ou de ata 2,1 millóns de sondas a escala micrométrica vendidas comercialmente. É normal o uso de robots que se encargan da maior parte do proceso de manipulación dos chips (sintetizar o ADN molde que se une ao chip, unilo, engadir os reactivos necesarios etcétera).

O chip é unha placa pequena de arredor de 6 cm x 3 cm sobre a cal se fixan as febras monocatenarias (en lugar das bicatenarias habituais) de ADN, cada un correspondente a unha febra complementaria de ARN mensaxeiro. Poden fixarse sobre un chip varias decenas de miles de fragmentos de ADN.

As sondas deposítanse sobre a lámina de maneira similar á dunha impresora de inxección de tinta. Desta maneira, un brazo robótico con múltiples agullas mergúllase primeiro en pociños que conteñen as sondas (preparadas previamente) e despois deposita ringleiras de diminutas pinguiñas dunha solución de ADN en posicións específicas do chip. Deste conxunto de ringleiras vén o nome de microarray ou micromatriz. O ADN é despois secado e tratado de maneira que quede fixado ao chip. Esta "grella" ou retícula bidimensional de ringleiras e columnas ou micromatriz de sondas do tipo spotted microarray xa está preparada para recibir as dianas derivadas das mostras que se queren analizar.

As micromatrices de oligonucleótidos fabrícanse xeralmente doutra maneira, xa que as sondas se sintetizan nucleótido a nucleótido na superficie da propia matriz (en vez de depositar sondas previamente formadas).

 Micromatrices e bioinformática 
dereita|miniatura|160px|Os valores de expresión xénica dos experimentos de micromatrices poden representarse como mapas de calor para visualizar o resultado das análises de datos.

A chegada da tecnoloxía dos experimentos de micromatrices baratos orixinou varios retos bioinformáticos:

 Os múltiples niveis de replicación no deseño experimental (deseño experimental).
 O número de plataformas e grupos independentes e formatos de datos (estandarización).
 O tratamento dos datos (análise estatística).
 A exactitude e precisión (relación entre a sonda e o xene)
 O enorme volume de datos e a capacidade de compartilos (almacenamento de datos).

 Tecnoloxías alternativas 
Os avances na secuenciación en paralelo masiva levaron ao desenvolvemento da tecnoloxía RNA-Seq, que permite utilizar unha estratexia de escopeta de transcriptoma completo para caracterizar e cuantificar a expresión xénica. A diferenza das micromatrices, que necesitan dispoñer dun xenoma e transcriptoma de referencia antes de facer o experimento de micromatrices propiamente dito, a tecnoloxía RNA-Seq pode usarse tamén para novos organismos modelo cuxos xenomas aínda non foron secuenciados.

 Historia 
A tecnoloxía de micromatrices evolucionou desde a técnica do Southern blot, na que o ADN fragmentado está unido a un substrato e despois é sondado cunha secuencia de ADN coñecida. O primeiro informe do uso deste enfoque técnico foi a análise de 378 colonias bacterianas lisadas en matriz, cada unha das cales levaba unha diferente secuencia, a cal era probada en múltiples réplicas para a expresión de xenes en tecido tumoral e normal múltiple. Isto foi ampliado despois a unha análise de máis de 4000 secuencias humanas con computador con escaneo e procesamento de imaxes para a análise cuantitativa das secuencias en tumores de colon humanos e tecidos normais, e despois para comparar tecidos de colon con diferentes riscos xenéticos. O uso dunha colección de diferentes ADNs en matrices para obter un perfil de expresión foi tamén descrito en 1987, e os ADNs en matriz foron utilizados para identificar xenes cuxa expresión está modulada polo interferón. Estas matrices de xenes iniciais fixéranse colocando "puntos" con ADNc en papel de filtro cun aparato. Os primeiros informes sobre o uso de micromatrices miniaturizadas para obter perfís de expresión xénica fixéronse en 1995, e en 1997 publicouse o exame en micromatrices dun xenoma eucariota completo (de Saccharomyces cerevisiae).

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Micromatriz de oligonucleótidos específicos de metilación
 Microfluídica ou lab-on-chip
 Micromatriz de fenotipos
 Análise en serie de expresión xénica
 RNA-Seq
 Secuenciación de xenoma completo
 ELISA
 Micromatriz de proteínas
 Micromatriz de anticorpos
 Micromatriz de tecidos
 Micromatriz de compostos químicos

 Ligazóns externas 
 Os chips de ADN na atención á saúde e no descubrimento de fármacos (en inglés)
 Como funcionan os chips de ADN? (animación en inglés)
 PLoS Biology Primer: Microarray Analysis (en inglés) 
 Design DNA microarray probes (en inglés)
 GENIOM®-The Instrument: Design, production and application of custom microarrays in the researcher’s lab today (en inglés)
 Leming Shi's Genome Chip Resources (en inglés)
 Nature Genetics Free Issue on Gene Chips (en inglés)
 DNA Microarray Methodology (en inglés) 
 How to build your own arrayer (en inglés)
 DNA microarray and DNA analysis technology (en inglés)
 How to build your own ink jet microarrayer (en inglés)
 Microarray protocols, how-to documents, free software (en inglés)
 Microarrayer tools and resources (en inglés)
 Rundown of microarray technology (en inglés)
 Large-Scale Gene Expression and Microarray Links and Resources (en inglés)
 Microarray data analysis (en inglés)
 Microarray Data Classification Server (MDCS) (en inglés)
 TiMAT: Tiling Microarray Analysis Tools (en inglés)
 The Microarray Gene Expression Data Society, and home of MIAME (en inglés) 
 Try DNA microarray yourself in an interactive demonstration (en inglés) 
 ArrayExpress at the European Bioinformatics Institute (en inglés)
 Gene Expression Omnibus (GEO) at NCBI (en inglés)
 Genevestigator at ETH Zurich (en inglés)
 Center for Functional Genomics, SUNY Albany's core lab providing microarray and related services to all (en inglés)
 The Science Creative Quarterly's overview of Microarrays - con excelentes imaxes sobre a técnica (en inglés)
 PLoS Biology Primer: Microarray Analysis  (en inglés)
 Rundown of microarray technology (en inglés)
 ArrayMining.net - un servidor libre de análises de micromatrices on line
 Microarray - How does it work?  (en inglés)
 PNAS Commentary: Discovery of Principles of Nature from Mathematical Modeling of DNA Microarray Data  (en inglés)

Categoría:Técnicas de bioloxía molecular
Categoría:Expresión xénica
Categoría:Bioinformática
Categoría:ADN
Categoría:Microtecnoloxía
Categoría:Micromatrices