Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens (á que recentemente se lle cambiou o nome a Rhizobium radiobacter) é unha especie bacteriana que causa a formación de tumores nunhas 140 especies de plantas eudicotiledóneas. Ten forma de bacilo, é gramnegativa e vive no solo. A doenza orixínase na planta pola inserción no xenoma da planta dun pequeno segmento de ADN (chamado ADN-T, ou ADN de transferencia), procedente dun plásmido da bacteria, chamado plásmido Ti, que se incorpora de xeito semialeatorio no xenoma da planta.

A. tumefaciens é unha alfaproteobacteria da familia Rhizobiaceae, na que se inclúen tamén os simbiontes de legumes fixadores de nitróxeno. A diferenza dos simbiontes fixadores de nitróxeno, as especies de Agrobacterium que producen tumores son patóxenas e non benefician en absoluto á planta. A ampla variedade de plantas afectadas por Agrobacterium fai que esta bacteria sexa unha importante preocupación para a agricultura. Economicamente, A. tumefaciens é un importante patóxeno das nogueiras, vides, Prunus, remolachas, ravos picantes (Armoracia rusticana), e ruibarbos.

 Conxugación 

Para ser virulenta, esta bacteria debe conter un plásmido indutor de tumores (plásmido Ti ou pTi), de 200 kb, que contén o ADN-T (o ADN que se transfire) e todos os xenes necesarios para transferilo á célula da planta. Moitas cepas de A. tumefaciens non conteñen o pTi.

Como o plásmido Ti é esencial para causar enfermidades na planta, os eventos de prepenetración que teñen lugar an rizosfera promoven a conxugación bacteriana, na que as bacterias intercambian plásmidos entre elas. En presenza de substancias chamadas opinas, A. tumefaciens produce un sinal de conxugación difusible chamado 30C8HSL ou autoindutor de Agrobacterium. Este activa o factor de transcrición TraR, regulando positivamente a transcrición dos xenes necesarios para a conxugación.

 Método de infección 
A. tumefaciens infecta a planta por medio dos seus plásmidos Ti. O plásmido Ti integra un segmento do seu ADN, chamado ADN-T, no ADN dun cromosoma da célula hóspede da planta. A. tumefaciens ten flaxelos que lle permiten nadar polo solo dirixíndose a onde hai moléculas producidas na fotosíntese (fotoasimilados) que se acumulan na rizosfera arredor das raíces. Algunhas cepas poden moverse quimiotacticamente cara aos exsudados químicos das plantas, como a acetosiringona e azucres. A acetosiringona é recoñecida pola proteína VirA, unha proteína transmembrana codificada no xene virA do plásmido Ti. Os azucres son recoñecidos pola proteína chvE, unha proteína codificada no cromosoma da bacteria presente no espazo periplásmico.Stanton B. Gelvin,Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana 47907-1392, Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool, http://mmbr.asm.org/cgi/reprint/67/1/16

Para a indución de tumores cómpren polo menos 25 xenes vir do plásmido Ti. Ademais do seu papel de percepción de compostos, virA e chvE inducen outros xenes vir. A proteína virA ten actividade de autoquinase, xa que se autofosforila nun residuo de histidina. Despois, a proteína virA fosforila a proteína virG no seu residuo aspartato. A proteína virG é unha proteína citoplasmática producida a partir do xene virG do plásmido Ti. É un factor de transcrición, que induce a transcrición dos operóns vir. A proteína chvE regula o segundo mecanismo da activación dos xenes vir. Incrementa a sensibilidade da proteína VirA a compostos fenólicos.

A adhesión á planta é un proceso que ten lugar en dúas etapas. Despois dunha adhesión inicial feble e reversible, a bacteria sintetiza fibrilas de celulosa que ancoran a bacteria á planta con feridas á cal foi atraída. Neste proceso están implicados catro xenes principais, que son: chvA, chvB, pscA, e att. Os produtos dos primeiros tres xenes están implicados aparentemente na propia síntese das fibrilas de celulosa. Estas fibrilas tamén serven para ancorar as bacterias unhas a outras, o que facilita a formación dunha microcolonia.

O xene VirC é o xene de virulencia máis importante, e a súa intervención é un paso necesario na recombinación. Selecciona a sección do ADN na planta hóspede que será substituída, e corta nesa febra do ADN.

Despois da produción de fibrilas de celulosa, prodúcese unha proteína da membrana externa dependente do calcio chamada ricadhesina, que tamén contribúe a adherir a bacteria á parede celular. Poden atoparse homólogos desta proteína noutros rizobios.

Posibles compostos da planta que inician Agrobacterium para infectar células da planta son:U.S. Patent 6483013
 Acetosiringona e outros compostos fenólicos.
 Alfa-hidroxiacetosiringona.
 Catecol.
 Ácido ferúlico.
 Ácido gálico.
 Ácido p-hidroxibenzoico.
 Ácido protocatechuico.
 Ácido pirogálico.
 Ácido resorcílico.
 Ácido sinapínico.
 Ácido sirínxico.
 Vanillina.

 Formación do pilus T 

Para transferir o ADN-T á célula da planta, A. tumefaciens utiliza un mecanismo de secreción de tipo IV, no que se ten que orixinar un pilus T. Cando se detecta a acetosiringona e outras substancias, desencadéase unha transdución de sinais que activa a expresión de 11 xenes situados no operón VirB, os cales son responsables da formación do pilus T.

Primeiramente, fórmase a pro-pilina, que é un polipéptido de 121 aminoácidos que debe ser procesado eliminándolle 47 residuos para así formar unha subunidade de pilus T. A subunidade circularízase ao formarse un enlace peptídico entre os dous extremos do polipéptido.

Os produtos dos outros xenes VirB utilízanse para transferir as subunidades a través da membrana plasmática. Estudos feitos en sistemas de dobre híbrido en lévedos proporcionaron probas de que VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 e VirB10 poden codificar compoñentes do transportador. Cómpre tamén a actuación dunha ATPase para o transporte activo das subunidades.

 Transferencia do ADN-T á célula da planta 
miniatura|300px|dereita|A: Agrobacterium tumefaciens
B: Xenoma de Agrobacterium  C: Plásmido Ti
 a: ADN-T
, b: Xenes Vir
, c: Orixe de replicación
, d: Xenes para o catabolismo de opinas
D: Célula da planta
E: Mitocondria
F: Cloroplasto
G: Núcleo
O ADN-T debe ser cortado e escindido do plásmido circular. O complexo VirD1/D2 fai un corte no ADN nas secuencias dos extremos esquerdo e dereito do ADN-T. A proteína VirD2 únese covalentemente ao extremo 5'. A VirD2 contén un motivo que fai que o complexo nucleoproteico se una ao sistema de secreción de tipo IV (T4SS).

No citoplasma da célula receptora, o complexo ADN-T queda cuberto por proteínas VirE2, as cales son exportadas a través do sistema T4SS independentemente do complexo ADN-T.
Uns sinais de localización nuclear (NLS), localizados no VirE2 e VirD2, son recoñecidos pola proteína importina alfa, a cal despois se asocia coa importina beta e co complexo do poro nuclear para transferir o ADN-T ao interior do núcleo. O VIP1 tamén parece ser unha proteína importante no proceso, que posiblemente actúa como un adaptador para traer a VirE2 á importina. Unha vez dentro do núcleo, a VIP2 pode levar o ADN-T a áreas da cromatina que están sendo transcritas activamente, para que así o ADN-T poida integrarse no xenoma do hóspede.

 Xenes do ADN-T 
 Hormonas 
Para causar a formación dun tumor na planta, o ADN-T codifica xenes para a produción das hormonas auxinaa (xeralmente ácido indol-3-acético) por medio da vía IAM. Esta vía biosintética non é a utilizada por moitas plantas para a produción de auxina, polo que isto significa que a planta non ten ningunha maneira molecular de regulala e a auxina prodúcese de forma continua (constitutivamente). Tamén se expresan os xenes para a produción de citocininas. Isto estimula a proliferación celular e a formación do tumor.

 Opinas 
O ADN-T contén xenes que codifican encimas que causa que a planta produza derivados de aminoácidos especializados que a bacteria pode metabolizar, chamadas opinas. As opinas son unha clase de compostos químicos que serven como fonte de nitróxeno para A. tumefaciens, pero non para a maioría dos demais organismos. O tipo específico de opina producido polas plantas infectadas por A. tumefaciens C58 é a nopalina.Escobar MA, Dandekar AM. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 2003 Aug;8(8):380-6. PMID 12927971.

Secuenciáronse completamente dous plásmidos Ti de tipo nopalina, que son: pTi-SAKURA e pTiC58. A. tumefaciens C58 foi o primeiro patovar secuenciado totalmente, e foi illado por primeira vez dos tumores das cereixeiras. O xenoma foi secuenciado simultaneamente por Goodner et al. e Wood et al. en 2001. O xenoma de A. tumefaciens C58 consta dun cromosoma circular, dous plásmidos, e un cromosoma linear. A presenza dun cromosoma circular pechado por enlaces covalentes é o normal nas bacterias, con poucas excepcións. Porén, a presenza á vez dun cromosoma circular e outro lineal é exclusiva dun grupo deste xénero. Os dous plásmidos son pTiC58, responsable dos procesos implicados na virulencia, e o pAtC58, denominado o plásmido "críptico".

O plásmido pAtC58 está implicado no metabolismo das opinas e na conxugación con outras bacterias en ausencia do plásmido pTiC58. Se o plásmido pTi é eliminado, non se produce o crecemento do tumor, que é a característica para clasificar esta especie de bacterias.

 Aplicacións biotecnolóxicas 
miniatura|Plantas que foron transformadas usando Agrobacterium.
A capacidade de transmisión de ADN de Agrobacterium foi exhaustivamente explorado en biotecnoloxía como un medio para inserir xenes alleos en plantas. Marc Van Montagu e Jeff Schell, (da Universidade de Gante e Plant Genetic Systems, Bélxica) descubriron o mecaismo de transferencia entre Agrobacterium e plantas, o cal deu lugar ao desenvolvemento de métodos para alterar a bacteria xerando un sistema de traspaso do xene para modificar plantas por enxeñaría xenética. O ADN-T de plásmidos que se transfire á planta é un vehículo ideal para o seu uso en enxeñaría xenética. Isto faise clonando a secuencia do xene desexado no ADN-T que se inserirá no ADN do hóspede. Este proceso realizouse usando o xene da luciferase do vagalume para producir un resplandor na planta. Esta produción de luminescencia foi unha ferramenta útil no estudo da función do cloroplasto da planta e como xene reporteiro.Root M. 1988. Glow in the dark biotechnology. Bioscience. 38:745-747. É tamén posible transformar a planta Arabidopsis thaliana mergullando as súas flores nun caldo de Agrobacterium; deste xeito, as sementes producidas nas flores serán transxénicas. Baixo as condicións de laboratorio, o ADN-T foi tamén transferido a células humanas, demostrando a versatilidade das aplicacións da inserción.

O mecanismo polo cal Agrobacterium insire materiais na célula hóspede por un sistema de secreción de tipo IV é moi similar aos mecanismos usados polos patóxenos para inserir materiais (xeralmente proteínas) en células humanas por secreción de tipo III. Tamén emprega un tipo de sinalización conservado en moitas bacterias gramnegativas chamado percepción do quórum. Isto fai que Agrobacterium sexa tamén un importante obxecto de estudo na investigación médica.

 Notas 

 Dickinson, M. (2003). Molecular Plant Pathology. BIOS Scientific Publishers.


 Véxase tamén 
 Outras lectruras 

 Ligazóns externas 
 Páxina do xenoma de Agrobacterium tumefacien C58 — secuenciado por Cereon Genomics/Universidade de Richmond
 Páxina do xenoma de Agrobacterium tumefacien C58 — secuenciado por DuPont/Universidade de Washington/Universidade de Campinas

Categoría:Rhizobiales
Categoría:Fitopatoloxía
Categoría:Biotecnoloxía