Gene targeting

A técnica do gene targeting (tamén chamada estratexia de substitución baseada na recombinación homóloga) é unha técnica xenética que utiliza a recombinación homóloga para cambiar un xene endóxeno. O método pode utilizarse para eliminar un xene (deleción dun xene), eliminar exóns, engadir un xene, e introducir mutacións puntuais. Este termo utilízase maioritariamente na literatura así tal como se di en inglés e significa modificación xenética dirixida a un xene determinado (targeting é seleccionar ou apuntar a un obxectivo).

O gene targeting pode ser permanente ou condicional. As condicións poden ser específicas dun determinada momento do desenvolvemento ou vida do organismo ou limitadas a un tecido específico do corpo, por exemplo. A técnica require a creación dun vector específico para cada xene que interese, pero pode ser utilizada para calquera xene, sen importar a súa actividade transcricional ou tamaño.

Mario R. Capecchi, Martin J. Evans e Oliver Smithies foron galardoados co Premio Nobel de Medicina de 2007 polos seus traballos sobre os "principios para introducir modificacións en xenes específicos en ratos utilizando células nai embrionais", ou gene targeting.

 Métodos 
Os métodos desta técnica foron establecidos para varios organismos modelo e poden variar dependendo da especie utilizada. En xeral, xérase en bacterias un construto de targeting feito de ADN, que contén xeralmente parte do xene ao que vai ir dirixido, xunto cun xene reporteiro, e un marcador seleccionable (dominante).

Para aplicar o gene targeting a xenes do rato, este construto insírese despois en células nai embrionarias de rato en cultivo. Despois, selecciónanse as células que teñen a inserción correcta, que poden ser utilizadas para contribuír a formar un tecido do rato por medio dunha inxección no embrión. Finalmente, selecciónanse os ratos quimera nos que as células modificadas orixinaron os órganos reprodutores por medio de cruzamentos entre os animais. Unha vez conseguido iso, todo o corpo do rato está baseado no xenoma das células nai embrionarias previamente seleccionadas.

Para aplicar o gene targeting a xenes do musgo Physcomitrella patens, este construto incúbase xunto con protoplastos acabados de illar e
con polietilenglicol. Todos os gametófitos de musgos son organismos haploides,Ralf Reski (1998): Development,
genetics and molecular biology of mosses. Botanica Acta 111, 1-15. e a formación dos filamentos da planta chamados protonemas pode ser estudada directamente por medio do gene targeting, aplicando un tratamento con antibióticos ou por PCR. Esta é a única planta en que se aplicou este procedemento de xenética inversa, que é tan eficiente coma en lévedos.Ralf Reski (1998): Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics. Trends Plant in Science 3, 209-210.  
Utilizando modificacións destes procedementos, o gene targeting foi tamén aplicado con éxito en vacas, ovellas, porcos e moitos fungos.

A frecuencia do gene targeting pode ser aumentada significativamente utilizando endonucleases obtidas por enxeñaría como nucleases dedos de cinc,Bibikova, M.; Beumer, K.; Trautman, J.; Carroll, D. (2003). "Enhancing Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases". Science 300 (5620): 764. doi:10.1126/science.1079512. PMID 12730594. endonucleases homing,Grizot, S.; Smith, J.; Daboussi, F.; Prieto, J.; Redondo, P.; Merino, N.; Villate, M.; Thomas, S.; Lemaire, L.; Montoya, G.; Blanco, F. J.; Pâques, F.; Duchateau, P. (2009). "Efficient targeting of a SCID gene by an engineered single-chain homing endonuclease". Nucleic Acids Research 37 (16): 5405–5419. doi:10.1093/nar/gkp548. PMC 2760784. PMID 19584299. e nucleases baseadas en efectores TAL obtidos por enxeñaría.Miller, J. C.; Tan, S.; Qiao, G.; Barlow, K. A.; Wang, J.; Xia, D. F.; Meng, X.; Paschon, D. E.; Leung, E.; Hinkley, S. J.; Dulay, G. P.; Hua, K. L.; Ankoudinova, I.; Cost, G. J.; Urnov, F. D.; Zhang, H. S.; Holmes, M. C.; Zhang, L.; Gregory, P. D.; Rebar, E. J. (2010). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology 29 (2): 143–148. doi:10.1038/nbt.1755. PMID 21179091. Ata agora, este método con nucleases foi aplicado a varias especies, como a mosca Drosophila melanogaster, o tabacoCai, C. Q.; Doyon, Y.; Ainley, W. M.; Miller, J. C.; Dekelver, R. C.; Moehle, E. A.; Rock, J. M.; Lee, Y. L.; Garrison, R.; Schulenberg, L.; Blue, R.; Worden, A.; Baker, L.; Faraji, F.; Zhang, L.; Holmes, M. C.; Rebar, E. J.; Collingwood, T. N.; Rubin-Wilson, B.; Gregory, P. D.; Urnov, F. D.; Petolino, J. F. (2008). "Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases". Plant Molecular Biology 69 (6): 699–709. doi:10.1007/s11103-008-9449-7. ISSN 0167-4412. PMID 19112554.
,Townsend, J. A.; Wright, D. A.; Winfrey, R. J.; Fu, F.; Maeder, M. L.; Joung, J. K.; Voytas, D. F. (2009). "High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases". Nature 459 (7245): 442–445. Bibcode:2009Natur.459..442T. doi:10.1038/nature07845. PMC 2743854. PMID 19404258. millo,Shukla, V. K.; Doyon, Y.; Miller, J. C.; Dekelver, R. C.; Moehle, E. A.; Worden, S. E.; Mitchell, J. C.; Arnold, N. L.; Gopalan, S.; Meng, X.; Choi, V. M.; Rock, J. M.; Wu, Y. Y.; Katibah, G. E.; Zhifang, G.; McCaskill, D.; Simpson, M. A.; Blakeslee, B.; Greenwalt, S. A.; Butler, H. J.; Hinkley, S. J.; Zhang, L.; Rebar, E. J.; Gregory, P. D.; Urnov, F. D. (2009). "Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases". Nature 459 (7245): 437–441. Bibcode:2009Natur.459..437S. doi:10.1038/nature07992. PMID 19404259. células humanas,Urnov, F. D.; Miller, J. C.; Lee, Y. L.; Beausejour, C. M.; Rock, J. M.; Augustus, S.; Jamieson, A. C.; Porteus, M. H.; Gregory, P. D.; Holmes, M. C. (2005). "Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases". Nature 435 (7042): 646–651. Bibcode:2005Natur.435..646U. doi:10.1038/nature03556. PMID 15806097. ratos,Cui, X.; Ji, D.; Fisher, D. A.; Wu, Y.; Briner, D. M.; Weinstein, E. J. (2010). "Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases". Nature Biotechnology 29 (1): 64. doi:10.1038/nbt.1731. PMID 21151125. e ratas.

 Comparación co gene trapping 
O gene trapping está baseado na inserción aleatoria dun casete xénico mentres que o gene targeting está dirixido a un xene específico. Os casetes do gene trapping constan dun xene reporteiro sen prromotor e/ou un marcador xenético seleccionable flanqueado por un sitio de empalme 3' augas arriba (aceptor de empalme ou splice acceptor, SA) e unha secuencia de terminación transcricional augas abaixo (secuencia de poliadenilación). Estes casetes poden utilizarse para moitas cousas en bioloxía molecular, mentres que as rexións homólogas flanqueantes dos casetes do gene targeting necesitan ser adaptados para cada xene. Isto fai que o gene trapping sexa máis axeitado para proxectos a grande escala que o gene targeting. Por outra parte, o gene targeting pode utilizarse para xenes con baixo nivel de transcrición que non serían detectados aplicando o gene trapping. Ademais, a probabilidade do trapping increméntase co tamaño dos intróns. Para o gene targeting estes xenes compactos poden ser alterados con similar facilidade.

 Aplicacións
O gene targeting foi moi utilizado para o estudo de enfermidades xenéticas humanas ao eliminar ("knocking out"), ou engadir ("knocking in"), mutacións específicas de interese a diversos modelos. Previamente fora utilizado para modelos de células de rato en enxeñaría xenética, pero os avances nas tecnoloxías do gene targeting están permitindo actualmente a creación dunha nova onda de modelos de enfermidades humanas isoxénicos. Estes son os modelos máis exactos in vitro dos que dispoñen os investigadores actualmente, e están facilitando o desenvolvemento de novas drogas personalizadas e de métodos diagnósticos, especialmente no campo do cancro.A Panel of Isogenic Human Cancer Cells Suggests a Therapeutic Approach for Cancers with Inactivated p53 Proc Natl Acad Sci U S A Printed online at www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0813333106

Notas

 Véxase tamén
Outros artigos
 Gene trapping (técnica de knockout de xenes aleatoria)
 Recombinación xenética
 Recombinación homóloga
 Receptor de tipo Toll (exemplo de xene ao que se lle aplicou o gene targeting para a análise)
 Knockout de xenes

Ligazóns externas
 guide to gene targeting da University of California, San Diego
 outline of gene targeting  da University of Michigan
 gene targeting diagram & summary do Heydari lab, Wayne State University 
 gene targeting vectors do inGenious Targeting Laboratory 
 research highlights on reporter genes usados en gene targeting Negra
 gene replacement in barley 

Categoría:Técnicas de bioloxía molecular
Categoría:Bioloxía molecular
Categoría:Xenética