Citoxenética

A citoxenética é esencialmente unha rama da xenética, pero que forma parte tamén da bioloxía celular/citoloxía, que estuda o número, morfoloxía e anormalidades dos cromosomasNational Human Genome Research Institute - NIH CytogeneticsNational Cancer Institute - NIH Cytogenetics e o seu comportamento na célula, especialmente durante a mitose e a meiose. As técnicas utilizadas inclúen a determinación de cariotipos, a análise do bandeado G dos cromosomas ou outras técnicas de bandeado, así como as técnicas de citoxenética molecular como a hibridación fluorescente in situ (FISH) e a hibridación xenómica comparativa (CGH).

 Historia 

 Os primeiros tempos 

Os cromosomas observáronse primeiro en células vexetais por Karl Wilhelm von Nägeli en 1842. O seu comportamento en células animais, concretamente de píntega, foi descrito por Walther Flemming, o descubridor da mitose, en 1882. O nome cromosoma foi acuñado polo anatomista alemán, von Waldeyer en 1888.

A seguinte etapa tivo lugar despois do desenvolvemento da xenética a inicios do século XX, cando se apreciou que o conxunto de cromosomas (o cariotipo) portaban os xenes. Levitsky parece que foi o primeiro en definir o cariotipo como a aparencia fenotípica dos cromosomas somáticos, en contraposición aos seus contidos xénicos.Levitsky G.A. 1924. The material basis of heredity. State Publication Office of the Ukraine, Kiev. [in Russian] A investigación sobre o cariotipo humano tardou moitos anos en establecer a cuestión máis básica: cantos cromosomas contén a dotación diploide dunha célula humana normal?Kottler M. 1974. From 48 to 46: cytological technique, preconception and the counting of the human chromosomes. Bull. Hist. Med. 48, 465-502. En 1912, Hans von Winiwarter informou que había 47 cromosomas nas espermatogonias e 48 nas ovogonias, polo que a súa conclusión foi que os humanos tiñamos un sistema de determinación do sexo XX/X0.von Winiwarter H. 1912. Études sur la spermatogenese humaine. Arch. biologie 27, 93, 147-9. Painter en 1922 non estaba seguro de se o número diploide humano era de 46 ou de 48, e ao principio inclinábase máis por 46.Painter T.S. 1922. The spermatogenesis of man. Anat. Res. 23, 129. Modificou despois esta opinión a 48 (o cal é incorrecto) e insistiu que os humanos tiñan un sistema de determinación do sexo XY (XX en mulleres e XY en homes, o cal é correcto).Painter T.S. 1923. Studies in mammalian spermatogenesis II. The spermatogenesis of man. J. Exp. Zoology 37, 291-336. Considerando as técnicas básicas que podía usar, estes resultados foron moi salientables. Nos libros de ciencia, o número de cromosomas humanos permaneceu como 48 durante uns trinta anos. Foi necesario a aparición de novas técnicas para corrixir este erro. Joe Hin Tjio traballando no laboratorio de Albert Levan lab foi o responsable de utilizar o seguinte novo procedemento:

 Usou células en cultivo.
 Pretratou as células cunha solución hipotónica, que fai que inchen e espallen os cromosomas.
 Fixo que se detivese a mitose na metafase usando unha solución de colchicina.
 Esmagou a preparación nun portaobxectos forzando os cromosomas a colocarse nun só plano.
 Recortou unha fotomicrografía dos cromosomas e dispuxo os resultados creando un cariograma imposible de discutir.

Non obstante, ata 1956 non se aceptou xeneralizadamente que o cariotipo humano tiña 46 cromosomas.Tjio J.H & Levan A. 1956. The chromosome number of man. Hereditas 42, 1-6.Hsu T.C. Human and mammalian cytogenetics: a historical perspective. Springer-Verlag, N.Y. Encyclopædia Britannica, The Human Chromosome Os grandes simios teñen 48 cromosomas. O cromosoma 2 humano orixinouse pola fusión de dous cromosomas ancestrais que tiñan os antepasados comúns de homínidos e simios, reducindo este número a 46 na liñaxe dos homínidos. Evolution Pages, Chromosome fusion

 Aplicacións en bioloxía 

 Traballos de McClintock sobre o millo 

Barbara McClintock empezou a súa carreira como citoxenetista do millo. En 1931, McClintock e Harriet Creighton demostraron que a recombinación citolóxica de cromosomas marcados correlacionábase coa recombinación de trazos xenéticos (xenes). McClintock, cando estaba na Institución Carnegie, continuou estudos previos sobre os mecanismos da rotura e fusión de cromosomas no millo. Identificou un evento particular de rotura cromosómica que sempre ocorría no mesmo locus do cromosoma 9 do millo, que ela denominou locus  "Ds" ou de "disociación".Ravindran, Sandeep. "Barbara McClintock and the discovery of jumping genes." 109.50 20198-
20199. Proceedings of the National Academy of the United States of America. Web. 08 Apr 2013. <http://www.pnas.org.pallas2.tcl.sc.edu/content/109/50/20198.full>. McClintock continuou a súa carreira en citoxenética estudando a mecánica e herdanza de cromosomas rotos e en anel (circulares) do millo. Durante os seus traballos citoxenéticos, McClintock descubriu os transposóns, un descubrimento que finalmente faría que se lle outorgase o Premio Nobel en 1983.

 Poboacións naturais de Drosophila 
Na década de 1930, T. Dobzhansky e os seus colaboradores recolleron exemplares de Drosophila pseudoobscura e D. persimilis das súas poboacións silvestres en California e estados veciños. Usando a técnica de PainterPainter T.S. 1933. A new method for the study of chromosome rearrangements and the plotting of chromosome maps. Science 78: 585-586. estudaron os cromosomas politénicos deses dípteros e descubriron que as poboacións silvestres eran polimórficas para as inversións cromosómicas. Todas as moscas tiñan aspecto similar fose cal fose a inversión que levasen: este é un exemplo de polimorfismo críptico.

Acumuláronse rapidamente evidencias que mostraban que a selección natural era a responsable disto. Usando un método inventado por L'Héritier e Teissier, Dobzhansky criou poboacións destas moscas en gaiolas de poboación, as cales lles permitían alimentarse, cruzarse e ser mostreadas, pero non lles permitían escapar. Isto tiña a vantaxe de eliminar a migración como unha posible explicación dos resultados. Os continxentes de moscas que contiñan inversións a unha frecuencia inicial coñecida poden ser mantidos en condicións controladas. Atopouse que os diversos tipos de cromosomas non flutuaban ao chou, como se fosen neutros selectivamente, senón que se axustaban a certas frecuencias ás cales quedaban estabilizados. Na época en que Dobzhansky publicou a terceira edición do seu libro en 1951Dobzhansky T. 1951. Genetics and the origin of species. 3rd ed, Columbia University Press, Nova York. estaba convencido de que os morfos cromosómicos estaban sendo mantidos na poboación pola vantaxe selectiva dos heterocigotos, igual que na maioría dos polimorfismos.Dobzhansky T. 1970. Genetics of the evolutionary process. Columbia University Press N.Y.[Dobzhansky T.] 1981. Dobzhansky's genetics of natural populations. eds Lewontin RC, Moore JA, Provine WB and Wallace B. Columbia University Press N.Y.

 Lilas e ratos 

As lilas son organismos moi axeitados para o exame citolóxico da súa meiose, xa que os seus cromosomas son grandes e cada etapa morfolóxica da meiose pode identificarse microscopicamente doadamente. Hotta et al. presentaron probas da existencia dun padrón común de corte de amosegas no ADN e posterior síntese de reparación nas células meióticas de roedores machos e de lilas durante as etapas de cigoteno–paquiteno da meiose cando se supoñía que ocorría o sobrecruzamento. A presenza dun padrón común entre organismos tan afastados filoxeneticamente como son un animal e unha planta, fixo que os autores chegasen á conclusión de que a organización do sobrecruzamento meiótico, polo menos en eucariotas superiores, ten probablemente unha distribución universal.

 Anormalidades cromosómicas humanas e aplicacións médicas 
miniatura|Tanslocación Filadelfia t(9;22)(q34;q11.2) vista na leucemia mielóxena crónica.

Conforme melloraron os procedementos que permitían unha fácil numeración dos cromosomas, fixéronse rapidamente descubrimentos sobre cromosomas aberrantes ou de casos de número anormal de cromosomas. Nalgúns trastornos xenéticos, como a síndrome de Down, a citoxenética revelou a natureza do defecto cromosómico: unha trisomía "simple". As anormalidades que se orixinan por fenómenos de non-disxunción poden tamén causar que se formen células con aneuploidías (adicións ou delecións de cromosomas enteiros) nun dos pais ou no feto. En 1959, J. LejeuneLejeune J, Gautier M, Turpin MR. Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. C R Acad Sci (París) 1959;248:1721-2. descubriu que os pacientes de síndrome de Down tiñan xeralmente unha copia extra do cromosoma 21. A síndrome de Down tamén se denomina trisomía 21.

Outras anormalidades numéricas descubertas afectaban os cromosomas sexuais. Unha muller que ten un só cromosoma X, a cal en total ten 45 cromosomas, padece a síndrome de Turner, mentres que un cromosoma X extra nun home, que en total terá 47 cromosomas, causa a síndrome de Klinefelter. Moitas outras combinacións de cromosomas sexuais son compatibles coa vida, como a XXX, XYY e XXXX. A capacidade dos mamíferos de toleraren as aneuploidías nos cromosomas sexuais débese a que os cromosomas X poden desactivarse (forman os corpos de Barr), o cal é necesario nas femias para compensaren o feito de teren dúas copias dese cromosoma. Non todos os xenes dese cromosoma X son inactivados, razón pola cal se observa un efecto fenotípico nos individuos con cromosomas X extra.

A trisomía 13 foi asociada coa síndrome de Patau e a trisomía 18 coa síndrome de Edwards.

En 1960, Peter Nowell e David HungerfordNowell PC, Hungerford DA. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia. Science 1960;132:1497-1501. descubriron un pequeno cromosoma especial nos leucocitos de pacientes de leucemia mielóxena crónica. Este cromosoma anormal foi denominado cromosoma Filadelfia, xa que ambos os científicos estaban traballando en Filadelfia, Pensilvania, onde o atoparon. Trece anos máis tarde, co desenvolvemento de técnicas máis avanzadas, Janet Rowley demostrou que ese cromosoma era resultado dunha translocación cromosómica entre os cromosomas 9 e 22. A identificación do cromosoma Filadelfia por citoxenética serve para o diagnóstico da leucemia mielóxena crónica.

 Aparición das técnicas de bandeado 
miniatura|250px|Cariotipo masculino humano.

A finais da década de 1960, Torbjörn Caspersson desenvolveu unha técnica de tinguidura con quinacrina fluorescente (bandeado Q), que orixinaba padróns de bandas tinguidas únicas para cada par cromosómico. Isto permitiu que os pares cromosómicos de igual forma e tamaño se puidesen diferenciar polo seu distinto padrón de bandas horizontais. Os padróns de bandeado utilízanse agora para dilucidar os puntos de rotura e os cromosomas constituíntes implicados nas translocacións cromosómicas. As delecións e inversións nun determinado cromosoma poden tamén ser identificadas e descritas con máis precisión usando unha nomenclatura de bandas estandarizada. O bandeado G (que utiliza tripsina e tinguidura Giemsa/ Wright) foi desenvolvido case ao mesmo tempo a inicios da década de 1970 e permite a visualización de padróns de bandas usando un microscopio de campo brillante.

Os diagramas que identifican os cromosomas baseados nos padróns de bandas coñécense como idiogramas. Estes mapas convertéronse en básicos nos campos oncolóxico e prenatal para usar a citoxenética no laboratorio clínico, onde a realización de cariotipos permite observar as alteracións cromosómicas. As técnicas ampliáronse para permitir o cultivo de amniocitos libres recollidos do líquido amniótico, e técnicas para todos os tipos de cultivos que permiten unha mellor resolución das bandas.

 Os comezos da citoxenética molecular 

Na década de 1980 houbo moitos avances en citoxenética molecular. Aínda que as sondas etiquetadas con radioisótopos se utilizaban para hibridarse co ADN desde 1969, despois empezaron a usarse sondas etiquetadas fluorescentemente. Hibridándoas con preparacións cromosómicas usando as técnicas existentes, estas pasaron a coñecerse como hibridación fluorescente in situ (FISH). Este cambio incrementou significativamente o uso de técnicas de sondas, xa que as sondas etiquetadas fluorescentemente teñen un uso máis seguro. Maiores avances na micromanipulación e exame dos cromosomas desembocaron na técnica da microdisección de cromosomas, na cal podían illarse as aberracións na estrutura cromosómica, e despois clonarse e estudarse en maior detalle.

 Técnicas 

 Cariotipificación 

A análise cromosómica de rutina (cariotipificación) é a análise dos cromosomas en metafase, que foron bandeados usando tripsina seguida de Giemsa, Leishmanns, ou unha mestura de ambos. Isto crea padróns de bandeado únicos nos cromosomas. O mecanismo molecular e razón destes padróns non se coñece, mais probablemente está relacionado coa temporización da replicación e o empaquetamento da cromatina.

Nos laboratorios de citoxenética utilízanse varias técnicas de bandeado de cromosomas. O bandeado de quinacrina (bandeado Q) foi o primeiro método de tinguidura usado para producir padróns de bandeado específicos. Este método require microscopio de fluorescencia e xa non se usa tanto coma o bandeado con Giemsa (bandeado G). O bandeado inverso, ou bandeado R, necesita un tratamento con calor e inverte os padróns usuais brancos e negros que se vén nas bandas G e Q. Este método é especialmente útil para tinguir os extremos distais dos cromosomas. Outras técnicas de tinguidura son o bandeado C e a tinguidura das rexións organizadoras nucleolares (tinguiduras NOR). Estes últimos métodos tinguen especificamente certas porcións do cromosoma. O bandeado C tingue a heterocromatina constitutiva, que xeralmente se encontra preto do centrómero e a tinguidura NOR salienta os satélites e talos dos cromosomas acrocéntricoss.

No bandeado de alta resolución tínguense os cromosomas durante a profase ou a metafase temperá (prometafase), antes de que cheguen á súa máxima condensación. Como os cromosomas profásicos e prometafásicos están máis alongados que os metafásicos, o número de bandas observable en todos os cromosomas increméntase desde unhas 300-450 a 800. Isto permite a detección de anormalidades menos obvias que normalmene non se ven co bandeado convencional.

 Preparacións en portaobxectos 

As células da medula ósea, sangue, líquido amniótico, sangue do cordón umbilical, tumores e tecidos (como a pel, cordón umbilical, vilosidades coriónicas, fígado e moitos outros órganos) poden cultivarse usando técnicas de cultivo estándar para incrementar o seu número. Despois engádese ao cultivo un inhibidor mitótico (colchicina, colcemida). Isto detén a división celular durante a mitose, o cal permite un incremento de células mitóticas no campo para analizalas. As células son despois centrifugadas e retíranse os medios e os inhibidores mitóticos, que son substituídos por unha solución hipotónica. Isto causa que os leucocitos ou fibroblastos inchen para que os cromosomas se espallen cando se poñen nun portaobxectos, así como se produza a lise dos eritrocitos. Unha vez que se puxeron as células nunha solución hipotónica, engádese o fixador de Carnoy (3:1 de metanol a ácido acético glacial). Isto mata as células e endurece os núcleos dos leucocitos que quedan. As células fíxanse xeralmente de forma repetida para eliminar calquera residuo ou os eritrocitos que puidesen quedar. A suspensión de células bótase despois en portaobxectos de espécime. Despois de envellecer as preparacións nun forno ou agardar uns poucos días, están listas para o bandeado e análise.

 Análise 

A análise dos cromosomas bandeados faina un especialista en citoxenética nun laboratorio clínico cun microscopio. Xeralmente analízanse vinte células, o que é dabondo para descartar o mosaicismo ata un nivel aceptable. Os resultados resúmense e danse a un citoxenetista titulado para a revisión, e para que se redacte unha interpretación tendo en conta a historia clínica previa do paciente e outros descubrimentos clínicos que se atoparan. Os resultados emítense e infórmase deles usando o Sistema Internacional de Nomenclatura Citoxenética Humana 2009 (International System for Human Cytogenetic Nomenclature 2009, ISCN2009).

 Hibridación in sutu fluorescente 

miniatura|Células en interfase positivas para un rearranxo cromosómico t(9;22).
A hibridación in situ fluorescente (FISH) baséase no uso dunha sonda etiquetada fluorescentemente que se hibrida con preparacións celulares citoxenéticas.

Ademais de nas preparacións estándar, a FISH pode realizarse tamén en:
Frotis de medula ósea.
Frotis sanguíneo.
Preparacións de tecidos incrustados en parafina.
Mostras de tecidos disociados encimaticamente.
Medula ósea non cultivada.
Amniocitos non cultivados.
Preparacións centrifugadas (cytospin).

 Preparacións en portaobxectos 
Esta sección refírese especificamente á elaboración de preparacións estándar citoxenéticas.

A preparación en portaobxectos é envellecida usando unha solución salina que adoita consistir en 2X SSC (sal, citrato de sodio). Despois a preparación deshidrátase en etanol, e engádese a mestura da sonda. A mostra de ADN e a sonda de ADN son despois codesnaturalizadas usando unha placa quentada e permitindo que se volvan a hibridar (re-anneal) durante polo menos 4 horas. As preparacións son despois lavadas para eliminar o exceso de sondas non unidas, e contratinguidas con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ou ioduro de propidio.

 Análise 
A análise dos espécimes de FISH faise por microscopía de fluorescencia por un técnico de laboratorio clínico especialista en citoxenética. Para exames de oncoloxía xeralmente examínase un gran número de células en interfase para descartar unha enfermidade residual a baixo nivel, xeralmente cóntanse e examínanse entre 200 e 1000 células. Para o exame de problemas conxénitos adoitan examinarse 20 células en metafase.

 Futuro da citoxenética 
Os avances agora están enfocados na citoxenética molecular, incluíndo os sistemas automatizados para contar os resultados das preparacións de FISH estándar e as técnicas de cariotipificación virtual, como as matrices de hibridación xenómica comparativa (CGH) e as de polimorfismo dun único nucleótido (SNP).

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Citotaxonomía
 Cariotipo
 Citoxenética molecular
 Ploidía
 Cariotipo virtual

 Ligazóns externas 
 Cytogenetic Directory
 Cytogenetics Resources
 Human Cytogenetics - Chromosomes and Karyotypes
 Gladwin Medical Blog 
 Cytogenetics - Technologies,markets and companies
 Cytogenetics-methods-and-trouble-shooting