Taq polimerase

O encima Taq polimerase (ou ADN polimerase Taq), abreviada como "Taq Pol" ou simplemente "Taq", é unha ADN polimerase termoestable (non se desnaturaliza a altas temperaturas) que procede da bacteria termófila Thermus aquaticus e que se usa moito no laboratorio na técnica da PCR, un método para amplificar a cantidade de curtos segmentos de ADN. Foi illada da mencionada bacteria en 1965 por Thomas D. Brock.

T. aquaticus é unha bacteria que vive en fontes termais. A Taq polimerase foi identificada como un encima que pode resistir as condicións normalmente desnaturalizantes (como a alta temperatura) utilizadas durante a PCR. Este encima substituíu a ADN polimerase de Escherichia coli, que era a que se usaba orixinalmente na PCR, que é moito menos resistente. A temperatura óptima para a Taq polimerase é de 75–80 °C, cunha vida media maior de 2 horas a 92,5 °C, e de 40 minutos a 95 °C, e de 9 minutos a 97,5 °C, e pode replicar unha cadea de ADN de 1000 pares de bases en menos de 10 segundos a 72 °C.

Unha das desvantaxes da Taq é a súa relativamente baixa fidelidade de replicación. A Taq natural carece de actividade exonuclease 3'-5' de corrección de erros (proofreading), e ten unha taxa de erro de arredor de 1 de cada 9.000 nucleótidos. Illáronse algunhas outras ADN polimerases termoestables doutras bacterias termofílicas e arqueas, como a ADN polimerase Pfu, que si teñen actividade de corrección de erros, e úsanse en lugar (ou en combinación) da Taq para facer unha amplificación de maior fidelidade.

A Taq polimerase orixina produtos de ADN nos que sobresae polos seus extremos 3' adenina (A). Isto pode ser útil para a clonación TA, polo que e utiliza un vector de clonación (como un plásmido) do que sobresae unha timina (T) en 3', que se complementa coa A que sobresae do produto da PCR, o que permite a ligación do produto da PCR no plásmido vector.

Probáronse diversas modificacións provocadas na Taq polimerase para mellorar o seu rendemento.

 A Taq polimerase na PCR 
A comezos da década de 1980, Kary Mullis estaba traballando na aplicación de ADNs sintéticos á biotecnoloxía. Tiña traballado con oligonucleótidos de ADN, que se usaban como sondas que se unían a fibras de ADN diana, ou se usaban como cebadores para a secuenciación do ADN e na síntese de ADNc. En 1983, empezou a usar dous cebadores, un para hibridarse a cada fibra dun ADN diana, e engadiu ADN polimerase á reacción. Isto deu lugar a unha replicación do ADN exponencial, que amplificou enormemente as cantidades de ADN entre os cebadores.

Porén, despois de cada rolda de replicación a mestura tiña que ser quentada por riba dos 90 °C para desnaturalizar o ADN acabado de formar, é dicir, para que se separasen as súas dúas cadeas e puidesen actuar como moldes na seguinte rolda de amplificación. Este paso de elevación da temperatura inactivaba a ADN polimerase I de E. coli (fragmento de Klenow) que se usaba antes do descubrimento da Taq polimerase.

O uso da Taq polimerase termoestable evita a necesidade de ter que engadir novos encimas (non desnaturalizados) á reacción da PCR durante o proceso de termociclado. O proceso enteiro pode levarse a cabo nun simple tubo pechado nunha máquina relativamente simple (termociclador). Deste xeito, o uso da Taq polimerase foi a idea chave que fixo que a PCR fose aplicable a unha gran variedade de problemas e experimentos de bioloxía molecular que tiñan que ver coa análise do ADN.

 Patentes 
As patentes da PCR e Taq pertencían a Cetus Corporation na que estaba traballando Hary Mullis. Finalmente, Hoffmann-La Roche comprou as patentes da PCR e Taq a Cetus por 330 millóns de dólares, e por elas chegaría despois a recibir 2.000 millóns en dereitos.Detailed history of Cetus Corporation and the commercial aspects of PCR. En 1989, a revista Science elixiu á Taq polimerase como a súa primeira "molécula do ano". Kary Mullis recibiu o Premio Nobel de Química en 1993, o único que se outorgou por unha investigación realizada nunha empresa privada de biotecnoloxía. A comezos da década de 1990, a técnica da PCR co uso da Taq polimerase utilizábase en moitas áreas, como a investigación básica en bioloxía molecular, probas clínicas, e forenses. Posteriormente empezou a usarse na detección do VIH, virus causante da SIDA.

A compañía Hoffman-La Roche foi demandada nos tribunais por Promega corporation por problemas coa patente. En 1999 os tribunais ditaminaron que a patente de 1990 que implicaba a Taq polimerase emitiuse en parte debido a información enganosa e afirmacións falsas dos científicos de Cetus Corporation, o que daba a razón ao demandante. O xuíz citou descubrimentos previos realizados por outros laboratorios, como o laboratorio de John Trela na Universidade de Cincinnati.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 ADN polimerase
 Replicación do ADN
 Reacción en cadea da polimerase

Categoría:Encimas