Dedo de cinc

miniatura|300px|dereita|Representación da proteína Zif268 (en azul), que contén tres dedos de cinc en complexo co ADN (en laranxa). Destacáronse os residuos de aminoácidos coordinados e os ións cinc (en verde).

Denomínase dedo de cinc a un pequeno motivo estrutural das proteínas, que se caracteriza por presentar unha coordinación dun ou máis ións cinc que estabilizan o pregamento. O termo foi acuñado orixinalmente para describir a aparencia de dedo dunha estrutura hipotetizada do factor de transcrición IIIA do anfibio Xenopus laevis, pero o nome dedo de cinc actualmente abrangue unha ampla variedade de estruturas proteicas.

As proteínas que conteñen dedos de cinc (proteínas dedos de cinc) clasifícanse en varias familias estruturais. A diferenza de moitas outras estruturas supersecundarias claramente definidas, como as grecas ou a forquita β, hai varios tipos distintos de dedos de cinc, cada un dos cales posúe a súa propia arquitectura tridimensional. Unha determinada clase de proteínas dedos de cinc está determinada pola súa estrutura tridimensional, pero tamén se pode recoñecer baseándose na estrutura primaria da proteína ou na identidade dos ligandos coordinados ao ión cinc. Porén, malia a gran variedade destas proteínas, a gran maioría funcionan tipicamente como módulos de interacción que se unen ao ADN, ARN, proteínas, ou outras pequenas e útiles moléculas, e as variacións na estrutura serven principalmente para alterar a especificidade de unión dunha determinada proteína.

Desde o seu descubrimento e a dilucidación das súas estruturas, estes módulos de interacción mostraron ser ubicuos no mundo biolóxico.
Ademais, os dedos de cinc fixéronse moi útiles polas súas capacidades terapéuticas e para a investigación. A modificación por enxeñaría dos dedos de cinc para que teñan unha afinidade para unha secuencia específica é unha área en activa investigación, e as nucleases dedo de cinc e os factores de transcrición dedo de cinc son dúas das máis importantes aplicacións utilizadas ata agora.

 Historia 

Os dedos de cinc identificáronse por primeira vez no anfibio Xenopus laevis. Un estudo da transcrición dunha determinada secuencia de ARN revelou que a forza de unión dun pequeno factor de transcrición (o factor de transcrición IIIA) se debía á presenza de estruturas parecidas a dedos con cinc coordinado. O nome "dedo de cinc" foi proposto na posterior publicación deses traballos, na cal se realizou un detallado estudo desta estrutura. Posteriores traballos indicaron a presenza de dedos de cinc en moitas proteínas.

 Dominio 
Os dominios dedos de cinc (Znf, zinc finger) son motivos proteicos relativamente pequenos, que conteñen múltiples protrusións de dedos de cinc que establecen contactos en tándem coas súas moléculas diana. Algúns destes dominios únense ao cinc, pero moitos non, senón que se unen a outros metais como o ferro, ou a non metais. Por exemplo, algúns membros da familia forman pontes salinas para estabilizar os pregmentos tipo dedos de cinc. Foron identificados primeiramente como motivos proteicos de unión ao ADN no factor de transcrición TFIIIA de Xenopus laevis, pero agora recoñécese que se unen ao ADN, ARN, proteínas e lípidos. As súas propiedades de unión dependen da secuencia de aminoácidos do dominio dedo e da parte que serve de enlace entre os dedos, ou das estruturas de orde máis elevado e do número de dedos. Os dominios Znf aparecen con frecuencia agrupados, e nestas agrupacións os dedos poden ter diferentes especificidades de unión. Hai moitas superfamilias de motivos Znf, que varían en secuencia e estrutura. Presentan considerable versatilidade nos seus modos de unión, mesmo entre membros da mesma clase (por exemplo, algúns únense ao ADN, outros a proteínas), o que suxire que os motivos Znf son armazóns estables que desenvolveron na evolución funcións especializadas. Por exemplo, as proteínas que conteñen dominios Znf funcionan na transcrición de xenes, tradución de proteínas, tráfico do ARNm, organización do citoesqueleto, desenvolvemento epitelial, adhesión celular, pregamento das proteínas, remodelación da cromatina e detección do cinc, entre outras funcións. Os motivos de unión ao cinc son estruturas estables, e raramente sofren cambios conformacionais ao unírense ás súas dianas.

 Clases 

Inicialmente, o termo dedo de cinc usábase só para describir os motivos de unión ao ADN que se encontraban en Xenopus laevis, pero agora denomínanse así diversas estruturas que presentan coordinación dun ión cinc. En xeral, os dedos de cinc coordinan ións cinc cunha combinación de residuos de cisteína e histidina. Orixinalmente, utilizouse o número e orde destes residuos para clasificar os diferentes tipos de dedos de cinc (por exemplo, Cys2His2, Cys4, e Cys6). Máis recentemente, está utilizándose un método máis sistemático para a clasificación das proteínas dedos de cinc. Este método clasifica as proteínas dedos de cinc en "grupos de pregamento" baseados na forma de conxunto do esqueleto proteico no dominio pregado. Os "grupos de pregamento" máis comúns de dedos de cinc son o de tipo Cys2His2 (que é o "dedo de cinc clásico"), a clave de sol (treble clef), e a fita de cinc.

A seguinte táboa  mostra as distintas estruturas e as súas características fundamentais:

 Grupo de pregamento  Estrutura representativa  Colocación do ligando Cys2His2  150px Dous ligandos forman un cotelo e dous máis forman o C-terminal da hélice. Cotelo Gag  150px  Dous ligandos forman un cotelo e dous máis forman unha curta hélice ou bucle. Clave de sol (Treble clef)    Dous ligandos forman un cotelo e dúas máis forman o N-terminal da hélice. Fita de cinc  150px  Dous ligandos forman cadanseu cotelo. Zn2/Cys6  150px  Dous ligandos forman o N-terminal da hélice e dous máis forman un bucle. Dominio tipo TAZ2    Dous ligandos forman o extremo terminal das dúas hélices.

 Cys2His2 

O grupo de pregamento de tipo Cys2His2 é con diferenza a clase mellor caracterizada de dedo de cinc e é moi común entre os factores de transcrición de mamíferos. Estes dominios adoptan un pregamento simple ββα e teñen a seguinte secuencia motivo de aminoácidos:

X2-Cys-X2,4-Cys-X12-His-X3,4,5-His

Esta clase de dedos de cinc pode ter diversas funcións como a unión ao ARN e mediar interaccións proteína-proteína, pero é mellor coñecida polo seu papel en proteínas que se unen ao ADN con especificidade de secuencia como Zif268 (Egr1). En tales proteínas, os dominios dedos de cinc aparecen como repeticións en tándem con dous, tres ou máis dedos formando o dominio de unión ao ADN da proteína. Estas series en tándem poden unirse ao suco maior do ADN e están tipicamente espazadas a intervalos de 3 pares de bases. A hélice α de cada dominio (a miúdo chamada a "hélice de recoñecemento") pode establecer contactos específicos de secuencia con bases do ADN; e residuos dunha soa hélice de recoñecemento poden contactar con 4 bases ou máis para orixinar un patrón de contactos solapados con dedos de cinc adxacentes.

 Cotelo Gag 

O grupo de pregamento cotelo gag (gag knuckle) defínese por ter dúas curtas cadeas β conectadas por un xiro (cotelo de cinc) seguidas por unha curta hélice ou bucle e lembra ao motivo clásico Cys2His2 cunha gran porción da hélice e a forquita β truncadas.

A proteína da nucleocápside retroviral (NC) do VIH e outros retrovirus similares son exemplos de proteínas que presentan este motivo. O dedo de cinc cotelo gag da proteína NC do VIH é a diana dun tipo de drogas coñecidas como inhibidores de dedos de cinc.

 Clave de sol 

O motivo clave de sol (treble-clef) consta dunha forquita β no extremo N-terminal e unha hélice α no extremo C-terminal, que contribúen cada un con dous ligandos para a unión dos dedos de cinc, aínda que poden estar presentes tamén un bucle e unha segunda forquita β de lonxitude e conformación variables entre a forquita β N-terminal e a hélice α C-terminal. Estes dedos están presentes en diversos grupos de proteínas que frecuentemente non comparten secuencia ou similitude funcional entre si. As proteínas mellor caracterizadas que conteñen dedos de cinc clave de sol son os receptores nucleares de hormonas.

 Fita de cinc 

O pregamento fita de cinc (zinc ribbon) caracterízase por ter dúas forquitas β que forman dous subsitios de unión ao cinc estruturalmente semellantes.

 Zn2/Cys6 

Os membros canónicos desta clase conteñen un clúster de cinc binuclear no cal se unen dous ións cinc a seis residuos de cisteína. Estes dedos de cinc poden atoparse en varios factores de transcrición como na proteína de lévedos Gal4.

 Miscelánea 

 Aplicacións 

Poden utilizarse varias técnicas de enxeñaría de proteínas para alterar a especificidade da unión ao ADN dos dedos de cinc Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001). "Design Andselection Ofnovelcys2His2Zincfingerproteins". Annual Review of Biochemistry 70: 313–340. doi 10.1146/annurev.biochem.70.1.313. PMID 11395410. e poden usarse repeticións en tándem deses dedos de cinc producidos por enxeñaría para que se unan a unha secuencia de ADN desexada.Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003). "Drug discovery with engineered zinc-finger proteins". Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361–368. doi:10.1038/nrd1087. PMID 12750739. Fusionando un segundo dominio proteico, como pode ser un activador transcricional ou un represor, a unha serie de dedos de cinc producidos por enxeñaría que se unan preto do promotor dun xene dado pódese alterar a transcrición dese xene. As fusións entre series ou matrices (arrays) de dedos de cinc producidos por enxeñaría e dominios proteicos que clivan ou modifican dalgún outro modo ao ADN poden usarse para afectar ás actividades de determinados loci xenómicos. As aplicacións máis comúns das matrices de dedos de cinc producidos por enxañaría inclúen os factores de transcrición dedo de cinc e as nucleases dedo de cinc, pero foron descritas outras aplicacións. As matrices de dedos de cinc típicas producidas por enxeñaría teñen entre 3 e 6 motivos de dedos de cinc e únense a sitios diana que van de 9 a 18 pares de bases de longo. As que teñen 6 motivos de dedo de cinc son particularmente interesantes porque se unen a un sitio diana que é dabondo longo como para que haxa unha alta probabilidade de que sexa único nun xenoma de mamífero.

 Nucleases dedo de cinc 

As matrices de dedos de cinc producidas por enxeñaría fusiónanse frecuentemente cun dominio de clivaxe do ADN (xeralmente o dominio de clivaxe FokI) para xerar nucleases dedo de cinc. Estas fusións dedo de cinc-FokI convertéronse en reactivos útiles para manipular os xenomas de moitos organismos superiores como Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, tabaco, millo, peixe cebra, e varios tipos de células de mamíferos, e ratas. Pódese tomar como diana unha rotura da dobre hélice dun locus xenómico determinado para introducir mutacións de cambio da pauta de lectura na secuencia codificante dun xene debido á tendencia ao erro da vía de reparación do ADN non homólogo. Se utilizamos tamén unha "secuencia doante" de ADN homólogo o locus xenómico pode converterse nunha secuencia definida por medio da vía de reparación dirixida á homoloxía. Estanse a realizar ensaios clínicos para avaliar as nucleases dedo de cinc que rompen o xene CCR5 nas células T CD4+ humanas como un posible tratamento para a SIDA.

 Métodos de enxeñaría de dedos de cinc 

A maioría das matrices de dedos de cinc producidas por enxeñaría están baseadas no dominio dedo de cinc do factor de transcrición murino Zif268, aínda que algúns grupos utilizaron as producidas baseándose no factor de transcrición SP1 humano. O Zif268 ten tres motivos dedo de cinc que en conxunto se unen a unha secuencia de 9 pares de bases con alta afinidade. En 1991 resolveuse a estrutura desta proteína unida ao ADN e isto estimulou as investigacións sobre as matrices de dedos de cinc. En 1994 e 1995, varios grupos de investigadores utilizaron a técnica do phage display para alteraren a especificidade dun só dedo de cinc de Zif268. O phage display é unha técnica de laboratorio para o estudo das interaccións entre proteína ou proteína-ADN na que se utilizan bacteriófagos para conectar as proteínas coa información xenética que as codifica, que permite examinar grandes librarías de proteínas. Actualmente úsanse dous métodos principais para xerar por enxeñaría matrices de dedos de cinc, a ensamblaxe modular e un sistema de selección bacteriano, e hai algún debate sobre cal deles é o máis axeitado para a maioría das aplicacións.

O método máis simple para xerar matrices de dedos de cinc é combinar "modulos" máis pequenos de dedos de cinc de especificidade coñecida. A estrutura da proteína dedo de cinc Zif268 de unión ao ADN descrita por Pavletich e Pabo nas súas publicacións de 1991 foi fundamental para a maioría deste traballo e describe o concepto da obtención de dedos de cinc para cada un dos 64 tripletes posibles de pares de bases e despois a mestura e unión complementaria destes dedos para o deseño de proteínas con calquera secuencia de especificidade desexada. 
A maioría do proceso de ensamblaxe molecular común implica combinar dedos de cinc separados, cada un dos cales pode recoñecer unha secuencia de 3 pares de bases de ADN para xerar matrices de 3, 4, 5 ou 6 dedos que recoñecen os sitios diana que van de 9 a 18 pares de bases de lonxitude. Outro método utiliza módulos de 2 dedos para xerar matrices de dedos de cinc con ata seis dedos de cinc. O Laboratorio Barbas do Instituto de Investigación Scripps usou a técnica de phage display para desenvolver e caracterizar dominios dedo de cinc que recoñecen a maioría das secuencias de tripletes de ADN , mentres que outro grupo illou e caracterizou dedos de cinc determinados no xenoma humano. Un inconveniente potencial coa ensamblaxe modular en xeral é que as especificidades dun determinado dedo de cinc poden solaparse e poden depender do contexto dos dedos de cinc que o rodean e o ADN. Un estudo recente demostrou que unha grande proporción de matrices de 3 dedos xeradas por ensamblaxe molecular fallan á hora de unirse á súa diana con suficiente afinidade nun ensaio de dous híbridos bacteriano e fallan na súa función de nucleases dedo de cinc, pero o grao de éxito era algo maior cando se usaban como diana os sitios da forma GNNGNNGNN.

Un estudo posterior utilizou a ensamblaxe modular para xerar nucleases dedo de cinc con tres matrices dedo ou con 4 e obtivo maior éxito coas de 4 dedos. Tamén se informou dunha variante da ensamblaxe modular que ten en conta o contexto dos dedos veciños e este método tende a orixinar proteínas cun rendemento relativo mellorado con respecto á ensamblaxe modular estándar.Sander JD, Dahlborg EJ, Goodwin MJ, Cade L, Zhang F, Cifuentes D, Curtin SJ, Blackburn JS, Thibodeau-Beganny S, et al. (2010). "Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA)". Nature Methods 8 (1): 67–69. doi:10.1038/nmeth.1542. PMC 3018472. PMID 21151135. //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3018472/.

Utilizáronse numerosos métodos de selección para xerar matrices de dedos de cinc que poden unirse a secuencias determinadas. Os esforzos de selección iniciais utilizaron a técnica do phage display para seleccionar proteínas que se unen a un ADN diana dado a partir dun gran conxunto de matrices de dedos de cinc parcialmente aleatorias. Esta técnica é difícil de usar en máis dun dedo de cinc á vez, así que se desenvolveu un proceso multifases que xerou unha matriz de 3 dedos de cinc completamente optimizada ao engadir e optimizar un só dedo de cinc á vez. Esforzos máis recentes utilizaron sistemas dun híbrido de lévedos, ou dun híbrido bacterianos ou sistemas de dous híbridos, e células de mamíferos. Un prometedor novo método para seleccionar novas matrices de 3 dedos, que os seus creadores denominaron "OPEN", utiliza un sistema de dous híbridos bacteriano. Este sistema combina conxuntos preseleccionados de dedos de cinc que foron seleccionados para que se unisen a un triplete dado e despois utiliza unha segunda rolda de selección para obter matrices de 3 dedos que poidan unirse a unha secuencia determinada de 9 pares de bases. Este sistema foi desenvolvido polo Consorcio Dedos de Cinc (Zinc Finger Consortium) como unha alternativa ás fontes comerciais de matrices de dedos de cinc producidas por enxeñaría. É un pouco difícil comparar directamente as propiedades de unión das proteínas xeradas con este método coas das proteínas producidas por ensamblaxe molecular, xa que nunca se informou dos perfís de especificidade das proteíans xeradas polo método OPEN.

 Exemplos 

Como exemplo indícanse os dominios dedo de cinc de tipo CysCysHisCys (C2HC) encontrados en eucariotas. Entre as proteínas que conteñen estes dominios están:

 Familia MYST de histona acetiltransferases.
 Factor de transcrición Myt1 da mielina.
 Proteína 18 supresora de tumorixenicidade (ST18).

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Nuclease dedo de cinc
 Inhibidor do dedo de cinc
 Receptor de hormonas esteroides

 Ligazóns externas 


 The double helix between the zinc finger
 Ferramentas para o deseño de dedos de cinc e sitio de información
 Human KZNF Gene Catalog
 Zinc finger C2H2-type domain in PROSITE
 Entrada para o dedo de cinc da clase C2H2 na base de datos SMART
 The Zinc Finger Consortium
 ZiFiT- Zinc Finger Design Tool
 Zinc Finger Consortium Materials de Addgene

Categoría:Estrutura das proteínas