ARN interferente

O ARN interferente (en inglés interfering RNA, iRNA), é unha molécula de ARN que suprime a expresión de xenes específicos utilizando procesos coñecidos globalmente como interferencia por ARN (RNA interference, RNAi).

 Tipos de ARN interferente 

Os ARN interferentes son moléculas pequenas (de 20 a 25 nucléotidos) que se xeran por fragmentación de precursores máis longos. Poden clasificarse en tres grandes grupos:Grosshans H, Filipowicz W. Molecular biology: the expanding world of small RNAs. Nature. 2008 Jan 24;451(7177):414-6 

miniatura|300px|dereita|Mecanismo de ribointerferencia (RNAi) mediada por siRNA. dsRNA=double stranded RNA= ARN bicatenario.

 siRNA 

Os ARN interferentes pequenos (small interfering RNA), abreviados como siRNA son moléculas de ARN bicatenario perfectamente complementarias en toda a súa lonxitude de aproximadamente 20 ou 21 nucleótidos con 2 nucleótidos desemparellados en cada extremo 3'. Cada fibra de ARN ten nos extremos un grupo fosfato 5' e un grupo hidroxilo (-OH) 3'. Esta estrutura provén do procesamento levado a cabo por Dicer, un encima que corta moléculas longas de ARN bicatenario en varios siRNA.Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 2001 Jan 18;409(6818):363-6  Unha das fibras do siRNA (a fibra "antisentido") ensámblase nun complexo proteico denominado RISC (RNA-induced silencing complex, complexo silenciador inducido por ARN), que utiliza a fibra de siRNA como guía para identificar o ARN mensaxeiro complementario. O complexo RISC cataliza o corte do ARNm complementario en dúas metades, que son degradadas pola maquinaria celular, bloqueando así a expresión do xene. Os siRNA poden ser tamén introducidos de forma exóxena nas células utilizando métodos de transfección baseándose na secuencia complementaria dun xene en particular, coa fin de reducir significativamente a súa expresión.

 miRNA 

Os microARN ou miRNA son pequenos ARN interferentes que se xeran a partir de precursores específicos codificados no xenoma, que ao se transcribiren sofren un pregamento en forquitas intramoleculares que conteñen segmentos de complementariedade imperfecta. O procesamento dos precursores ocorre xeralmente en dúas fases, catalizado por dous encimas, Drosha no núcleo, e Dicer no citoplasma. Unha das fibras do miRNA (a fibra "antisentido"), como ocorre cos siRNA, incorpórase a un complexo similar ao RISC. Dependendo do grao de complementariedade do miRNA co ARNm, os miRNA poden inhibir a tradución do ARNm ou ben inducir a súa degradación. Porén, a diferenza coa vía dos siRNA, a degradación de ARNm mediada por miRNA comeza coa eliminación encimática da cola poli(A) do ARNm.

 piRNA 

Os ARN asociados a piwi (Piwi-interacting RNAs) ou piRNA   xéranse a partir de precursores longos monocatenarios, nun proceso que é independente de Drosha e Dicer. Estes ARN pequenos asócianse cunha subfamilia das proteínas Argonauta denominada proteínas Piwi. Identificáronse decenas de miles de piRNA, pero a súa función é descoñecida (2008). Porén, sábese que, conxuntamente coas proteínas Piwi, son necesarios para o desenvolvemento das células da liña xerminal.

 ARNs interferentes e pseudoxenes 
En 2008, varios estudos en moscasCzech B, Malone CD, Zhou R, Stark A, Schlingeheyde C, Dus M, Perrimon N, Kellis M, Wohlschlegel JA, Sachidanandam R, Hannon GJ, Brennecke J. An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila.Nature 2008 Jun 5;453(7196):798-802 Ghildiyal M, Seitz H, Horwich MD, Li C, Du T, Lee S, Xu J, Kittler EL, Zapp ML, Weng Z, Zamore PD.Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells.Science 2008 May 23;320(5879):1077-81 Kawamura Y, Saito K, Kin T, Ono Y, Asai K, Sunohara T, Okada TN, Siomi MC, Siomi H.Drosophila endogenous small RNAs bind to Argonaute 2 in somatic cells.Nature 2008 Jun 5;453(7196):793-7 Okamura K, Chung WJ, Ruby JG, Guo H, Bartel DP, Lai EC. The Drosophila hairpin RNA pathway generates endogenous short interfering RNAs.Nature 2008 Jun 5;453(7196):803-6  e en ratos,Tam OH, Aravin AA, Stein P, Girard A, Murchison EP, Cheloufi S, Hodges E, Anger M, Sachidanandam R, Schultz RM, Hannon GJ.Pseudogene-derived small interfering RNAs regulate gene expression in mouse oocytes.Nature 2008 May 22;453(7194):534-8 Watanabe T, Totoki Y, Toyoda A, Kaneda M, Kuramochi-Miyagawa S, Obata Y, Chiba H, Kohara Y, Kono T, Nakano T, Surani MA, Sakaki Y, Sasaki H.Endogenous siRNAs from naturally formed dsRNAs regulate transcripts in mouse oocytes.Nature 2008 May 22;453(7194):539-43  proporcionaron nova información: nestes estudos, suxírese unha conexión entre a RNAi e pseudoxenes que fai máis difusa a distinción "tradicional" en tres clases de pequenos ARN: siRNA, miRNA e piRNA (ver un resumo en Sasidharan et al., Nature 2008Sasidharan R, Gerstein M. Protein fossils live on as RNA. Nature 2008 June 5;453(7196):729-31 ).

A definición clásica de pseudoxene é un elemento xenético herdable que é similar a un xene, pero que é afuncional. Porén, o termo "afuncional" é ambiguo: pode significar que non se transcribe, ou que non se traduce ou que non está baixo o control dun promotor. Os pseudoxenes son similares a xenes que codifican proteínas porque normalmente se orixinaron por copia dun xene ancestral, quer por duplicación incorrecta quer por retrotransposición (na que o ADN é primeiro transcrito en ARN e logo "retro-transcrito" en ADN e inserido noutro lugar do xenoma). Como o proceso de copiado non xera unha proteína funcional, os pseudoxenes identifícanse por 'disfuncións' na súa secuencia, como cambios de marco de lectura, ou paradas prematuras. Son interesantes porque constitúen un resto de antigas moléculas codificadas polo xenoma.

Os pseudoxenes son, por tanto, fósiles de xenes de antigas proteínas, e aínda que moitos deles se transcriben, consideráronse como ADN lixo, que consitúe no seu conxunto arredor do 99% do xenoma en humanos. Unha gran parte do ADN "lixo" (junk DNA) está constituída precisamente por pseudoxenes; esta abundancia de pseudoxenes no xenoma (decenas de miles en humanos, case a mesma cantidade de xenes que codifican proteínas) fai improbable que sexan afuncionais. Ademais, unha gran parte deles están sometidos a un proceso de selección natural.Zheng D, Frankish A, Baertsch R, Kapranov P, Reymond A, Choo SW, Lu Y, Denoeud F, Antonarakis SE, Snyder M, Ruan Y, Wei CL, Gingeras TR, Guigó R, Harrow J, Gerstein MB. Pseudogenes in the ENCODE regions: consensus annotation, analysis of transcription, and evolution.Genome Res. 2007 Jun;17(6):839-51  Unha das funcións proposta para os pseudoxenes é a regulación xénica, e o mecanismo proposto para realizar esta función é a interferencia por ARN (RNAi).

Os seis traballos indicados anteriormente describen o descubrimento de pequenas moléculas de siRNA naturais en moscas e ratos, algunhas das cales son potencialmente transcritas a partir de pseudoxenes.

 Endo-siRNA 

En xeral, o proceso de ribointerferencia (RNAi) implica varios tipos de pequenas secuencias de ARN "guía" que regulan os niveis da proteína diana ao destinar para a degradación o ARNm desta. Nos seis estudos indicados, algúns siRNA procedentes de pseudoxenes orixinan dúas das catro categorías de siRNA naturais (ou endo-siRNA):

 a primeira categoría de endo-siRNA media o silenciamento de transposóns, que é unha característica dos piRNA. A diferenza dos piRNA, que constan de 24 a 30 nucleótidos e utilizan Piwi como proteína efectora, os endo-siRNA de primeira categoría teñen de 21 a 22 nucleótidos, e utlilizan Ago2.
 a segunda categoría orixínase por medio de transcrición bidireccional de loci parcialmente superpostos en fibras opostas de ADN. Identificáronse uns 1000 endo-siRNA deste tipo en moscas, e estudos en ratos mostran algúns exemplos. Os xenes diana desta categoría de endo-siRNA están relacionados con funcións dos ácidos nucleicos, como actividade nuclease ou unión a factores de transcrición.
 a terceira categoría de endo-siRNA detectouse só en ratos e son o produto da interacción dun ARNm transcrito a partir dun xene que codifica unha proteína e un transcrito antisentido a partir do pseudoxene correspondente, que pode estar localizado lonxe do xene codificante, no mesmo cromosoma ou noutro.
 os endo-siRNA da cuarta categoría están moi relacionados cos da terceira: orixínanse a partir de secuencias en forma de forquita (hairpin), que en rato poden proceder das estruturas en repetición invertida dos pseudoxenes. Neste caso, o pseudoxene tamén regula o seu xene codificante, pero o precursor de ARN bicatenario procede da transcrición dunha secuencia con repeticións invertidas que dan lugar a unha forquita.

As publicacións indicadas mostran que as proteínas de rato afectadas polas categorías terceira e cuarta de endo-siRNA están xeralmente implicadas en funcións específicas, como a regulación da dinámica do citoesqueleto, o que indica que a regulación subxacente mediada por pseudoxenes foi seleccionada expresamente para iso, e non xerada simplemente polo emparellamento ao chou de transcritos de xenes e pseudoxenes.

Tamén se encontraron precursores en forquita de endo-siRNA en moscas, pero hai poucas evidencias que os relacionen con pseudoxenes. A maior parte dos endo-siRNA asociados con pseudoxenes, por tanto, foron detectados en ratos. Unha posible explicación é que o xenoma de rato contén moitos máis pseudoxenes ca o xenoma da mosca.Identification of pseudogenes in the Drosophila melanogaster genome.Nucleic Acids Res. 2003 Feb 1;31(3):1033-7 

Porén, para demostrar de forma concluínte a actividade dos pseudoxenes, son necesarios máis experimentos. Por exemplo, eliminar un pseudoxene e demostrar o efecto sobre o xene codificante potencialmente regulado polo pseudoxene.

Como se indicaba ao principio, ademais de conectar pseudoxenes e ribointerferencia (RNAi), estes estudos tamén fan máis difusas as diferenzas entre os tres tipos "tradicionais" de ARN interferente (siRNA, miRNA e piRNA), que son distintos na súa bioxénese e nas súas funcións celulares. Estes estudos indican que os endo-siRNA regulan transposóns (como os piRNA), que poden xerarse a partir de estruturas en forquita (como os miRNA) e que, en moscas, o seu procesamento implica un cofactor similar ao dos miRNA.

O feito de que as liñas de separación entre os distintos tipos de ARN interferente sexan máis difusas, unido ás novas conexións entre pseudoxenes e siRNA, ten interesantes consecuencias evolutivas. En plantas propúxose que as duplicacións invertidas dun xene codificante poderían ser un mecanismo de xeración de novos miRNA.Allen E, Xie Z, Gustafson AM, Sung GH, Spatafora JW, Carrington JC.Evolution of microRNA genes by inverted duplication of target gene sequences in Arabidopsis thaliana.Nature Genet. 2004 Dec;36(12):1282-90  Deste xeito, algúns endo-siRNA codificados por pseudoxenes poderían proporcionar unha conexión intermedia para comprendermos a evolución da regulación xénica mediada por miRNA.Chapman EJ, Carrington JC. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways.Nature Rev.Genet. 2007 Nov;8(11):884-96  Aínda que especulativo, un estudo recente do contexto xenómico de máis de 300 loci miRNA en humanos identificou dous en pseudoxenes,Devor EJ.Primate microRNAs miR-220 and miR-492 lie within processed pseudogenes.J.Hered.2006 Mar-Apr;97(2):186-90  o que apoiaría dita hipótese.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 Interferencia de ARN (RNAi)
 Riboswitch ou ribointerruptor: son formas de ARN que actúan como interruptores de "encendido-apagado" de grande precisión.
 ARNnc (ARN non codificante): ARN funcional que non codifica proteínas.
 Pseudoxene

 Ligazóns externas 
 Animación do proceso de RNAi (en inglés), de Nature
 NOVA scienceNOW explains RNAi – Un vídeo de 15 minutos (en inglés) do magacín Nova 
 Planting the Seeds of a New Paradigm
 Silencing Genomes  Experimentos de RNAi e bioinformática en C. elegans para alumnos. Do Dolan DNA Learning Center of Cold Spring Harbor Laboratory (en inglés).
 RNAi screens in C. elegans in a 96-well liquid format and their application to the systematic identification of genetic interactions (a protocol)
 2 American ‘Worm People’ Win Nobel for RNA Work, from NY Times Nano RNA Delivery - Novel delivery agents could mean a more targeted way to turn off disease genes, Technology Review'', abril 29, 2008

Categoría:ARN
Categoría:Xenética molecular