Interferencia de ARN

A interferencia de ARN ou interferencia por ARN ou ribointerferencia, abreviada como RNAi (do inglés RNA interference), é un sistema celular que intervén no control da inactivación dos xenes e do seu grao de expresión, que é realizado por certos tipos de ARN, chamados ARN interferentes. Por tanto, cómpre distinguir entre:
 Interferencia de ARN (ou RNAi, RNA interference). É o proceso biolóxico antes mencionado.
 ARN interferentes (ou iRNA, interferring RNA). Son certos tipos de ARN encargados de realizar ese proceso biolóxico.

Historicamente a interferencia de ARN foi coñecida tamén con outros nomes, como cosupresión, silenciamento de xenes postranscricional (PTGS), e quelling.

Hai dous tipos de moléculas de ARN pequenas, o microARN (miRNA) e o ARN interferente pequeno (siRNA), que son básicos na interferencia de ARN. Outro tipo de ARN interferente é o piRNA (asociado ás proteínas piwi). Os ARN son un produto directo da transcrición de xenes, e estes pequenos ARN poden unirse a outros ARN específicos (ARNm) facendo que aumenten ou diminúan a súa actividade; por exemplo impedindo que o ARNm sexa traducido a proteínas. A interferencia de ARN ten un importante papel na defensa das células contra xenes parasitos, como virus e transposóns, pero tamén dirixen o desenvolvemento celular e a expresión xenética en xeral.

A vía da interferencia de ARN (RNAi) está presente nos animais e en moitos eucariotas e iníciase polo encima Dicer, que corta os ARN de dobre cadea (dsRNA, double stranded RNA) longos en fragmentos máis curtos de ~20 nucleótidos que se chaman siRNA. Cada siRNA sepárase en dúas cadeas de ARN monocatenarias (ssRNA, single stranded RNA), que se denominan a fibra pasaxeira e a fibra guía. A fibra pasaxeira será degradada, e a fibra guía será incorporada no chamado complexo silenciador inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex). O fenómeno de interferencia mellor estudado é o silenciamento de xenes postranscricional, que ocorre cando a fibra guía se une por apareamento de bases cunha secuencia complementaria dunha molécula de ARN mensaxeiro e induce o seu corte pola Argonauta, o compoñente catalítico do complexo RISC. Este proceso sábese que se propaga sistemicamente a través do organismo a pesar da limitada concentración molar inicial do siRNA.

O efecto selectivo e potente da interferencia de ARN (RNAi) sobre a expresión xénica fai deste proceso unha ferramenta valiosa para a investigación tanto en cultivos celulares coma nos organismos vivos, porque os ARN de dobre cadea introducidos nas células poden inducir a supresión dos xenes específicos que interesen. A interferencia (RNAi) pode tamén utilizarse en exames a grande escala que bloqueen sistematicamente a expresión de cada xene dunha célula, o cal pode axudar a identificar os compoñentes que se precisan para cada proceso celular ou para procesos complexos como a división celular. O aproveitamento desta vía é tamén unha ferramenta moi prometedora en biotecnoloxía e medicina.

Historicamente, a interferencia de ARN era coñecida por outros nomes, como cosupresión, silenciamento de xenes postranscricional, e sufocamento (quelling). Só despois de que se comprendesen ben estes procesos aparentemente non relacionados quedou claro que todos eles describían o mesmo fenómeno, a interferencia de ARN (RNAi). En 2006, Andrew Fire e Craig C. Mello compartiron o Premio Nobel de Medicina e Fisioloxía polos seus traballos publicados en 1998 sobre a interferencia de ARN no verme nematodo Caenorhabditis elegans .

 Mecanismo celular 
miniatura|dereita|A proteína Dicer do protozoo Giardia intestinalis, que cataliza o corte dos dsRNA a siRNA. Os dominios ARNase están coloreados en verde, o dominio PAZ en amarelo, o dominio plataforma en vermello, e a hélice conectora en azul.

A RNAi é un proceso de silenciamento de xenes dependente do ARN que está controlado polo complexo silenciador inducido por ARN (RISC) e é iniciado por moléculas curtas de ARN de dobre cadea (dsRNA) no citoplasma celular, onde interaccionan co compoñente catalítico de RISC, chamado Argonauta. Cando o ARN bicatenario (dsRNA) é de procedencia exóxena (procede da infección dun virus con xenoma de ARN ou de manipulacións de laboratorio), o ARN impórtase directamente ao citoplasma e córtase en fragmentos polo encima Dicer. Pero o dsRNA iniciador pode ser tamén endóxeno (orixinado dentro da célula), como pode ser un pre-microARN expresado a partir dun xene codificante de ARN do xenoma. Os transcritos primarios de cada xene son primeiro procesados para formar a característica estrutura de talo-bucle dos pre-microARN que se encontran no núcleo celular, despois son exportados ao citoplasma para ser escindidos por Dicer. Así, as dúas vías do ARN de dobre cadea, exóxena e endóxena, converxen no complexo RISC.

 Escisión dos ARN bicatenarios 
Os ARN bicatenarios endóxenos inician a interferencia de ARN activando a ribonuclease Dicer, que se une e corta os ARN de dobre cadea (dsRNA), orixinando fragmentos de dobre cadea de 20–25 pares de bases con 2 nucleótidos máis que sobresaen nos extremos 3'. Estudos bioinformáticos dos xenomas de múltiples organismos suxiren que esta lonxitude maximiza a especificidade co xene diana e minimiza os efectos non específicos. Estes curtos fragmentos de ARN bicatenario denomínanse ARN interferentes pequenos (siRNA). Estes siRNA son despois separados en moléculas monocatenarias e integradas nun complexo RISC activo. Despois da integración no RISC, os siRNA únense por apareamento de bases complementarias ao seu ARNm diana e inducen o corte de dito ARNm, impedindo dese modo que poida ser utilizado como molde para a tradución de proteinas.

Os ARN de dobre cadea exóxenos son detectados por unha proteína efectora que se une a eles, chamada RDE-4 no verme Caenorhabditis elegans e R2D2 na mosca Drosophila, que estimula a actividade de Dicer. Esta proteína só se une a ARN bicatenarios longos, mais o mecanismo que determina esta especificidade de tamaño é descoñecido. Esta proteína de unión ao ARN entón facilita a transferencia dos siRNA cortados ao complexo RISC.

En C. elegans, esta resposta de iniciación amplifícase por medio da síntese dunha poboación de siRNA "secundarios" durante a cal os siRNA iniciadores producidos polo Dicer ou siRNA "primarios" son utilizados como moldes. Estes siRNA "secundarios" son estruturalmente distintos dos producidos polo Dicer e parece que son producidos por unha ARN polimerase dependente de ARN (RdRP).

 MicroARN 
miniatura|dereita|Estrutura secundaria en talo-bucle dun pre-microARN da planta Brassica oleracea.

Os microARN (miARN) son ARN non codificantes (non codifican proteínas) codificados xenomicamente (transcríbense de xenes do xenoma) que axudan a regular a expresión xénica, particularmente durante o desenvolvemento. O fenómeno da interferencia de ARN (RNAi), definida de modo xeral, inclúe os efectos de slenciamento de xenes inducidos endoxenamente polos miRNA e tamén o silenciamento desencadeado polos ARN de dobre cadea alleos. Os microARN maduros son estruturalmente similares aos siRNA producidos a partir de ARN bicatenario exóxeno, pero antes de chegaren á súa maduración, os microARN deben primeiro sufrir unha extensa modificación postranscricional. Un microARN exprésase a partir dun xene codificante de ARN moito mís longo como un transcrito primario coñecido como pri-miRNA que é despois procesado polo complexo microprocesador no núcleo celular, orixinando unha estrutura talo-bucle de 70 nucleótidos chamada pre-miRNA. Este complexo consta dun encima RNase III chamado Drosha e unha proteína de unión a ARN bicatenarios chamada Pasha. A porción de dsRNA deste pre-miRNA únese a Dicer, que a corta producindo a molécula madura de microARN que pode integrarse no complexo RISC; deste xeito, os microARN e os siRNA comparten a mesma maquinaria celular nas fases posteriores ao seu procesamento inicial.

Os siRNA derivados de precursores longos de ARN bicatenario (dsRNA) difiren dos microARN en que os microARN, especialmente os de animais, presentan normalmente unha complementariedade de bases incompleta coa súa diana e inhiben a tradución de moitos ARNm diferentes que teñan secuencias similares. Polo contrario, os siRNA normalmente teñen unha complementariedade de bases perfecta e inducen a escisión dun só ARNm diana específico. En Drosophila e C. elegans, os microARN e os siRNA son procesados por distintas proteínas Argonauta e encimas Dicer.

miniatura|esquerda|300px|Esquerda: Un proteína argonauta completa da arquea Pyrococcus furiosus. Dereita: O dominio PIWI dunha proteína argonauta formando un complexo con ARN de dobre cadea.

 Activación do RISC e catálise 
Os compoñentes activos do complexo silenciador inducido por ARN (RISC) son unhas endonucleases chamadas proteínas argonauta, que cortan a cadea de ARNm diana complementaria en bases do siRNA que se une a ela. Como os fragmentos producidos por Dicer son de dobre cadea, poderían en teoría producir cada unha un siRNA funcional. Porén, só unha das dúas cadeas, a denominada fibra ou cadea guía, se une á proteína argonauta e dirixe o silenciamento xénico. A outra, chamada fibra ou cadea anti-guía ou cadea pasaxeira é degradada durante a activación do RISC. Aínda que se cría inicialmente que unha helicase dependente do ATP separaba estas dúas cadeas, en realidade o proceso é independente do ATP e é realizado directamente polos compoñentes proteicos de RISC. A cadea seleccionada como guía tende a ser aquela cuxo extremo 5' está apareado de forma menos estable co seu complemento, pero a selección da cadea non se ve afectada pola dirección na que Dicer corta o ARN bicatenario antes da incorporación de RISC. En vez diso, a proteína R2D2 pode servir como o factor de diferenciación ao unirse o extremo 5', máis estable, da cadea pasaxeira.

A base estrutural da unión do ARN á proteína argonauta foi examinada por cristalografía de raios X do dominio de unión dunha proteína argonauta unida a ARN. Nel, o extremo 5' fosforilado da cadea de ARN entra nun sitio de unión de superficie básica conservado e toma contacto por medio dun catión divalente (con dúas cargas positivas) como o magnesio e por empillamento (stacking) aromático (un proceso que permite que máis dun átomo comparta un mesmo electrón) entre o nucleótido 5' do siRNA e un residuo conservado de tirosina da proteína. Este sitio crese que forma un sitio de nucleación para a unión do siRNA ao seu ARNm diana.

Non se comprende como o complexo RISC activado localiza os ARNm complementarios na célula. Aínda que se propuxo que o proceso de corte está ligado á tradiución, a tradución do ARNm diana non é esencial para a degradación mediada por interferencia de ARN (RNAi). De feito, a RNAi pode ser máis efectiva contra os ARNm diana que non son traducidos. As proteínas argonauta, o compoñente catalítico do RISC, están localizadas en rexións específicas do citoplasma chamadas corpos P (tamén denominados corpos citoplasmáticos ou corpos GW), que son rexións con alto grao de degradación de ARNm; a actividade dos microARN está tamén agrupada nos corpos P. A distorsión dos corpos P fai decrecer a eficiencia da interferencia de ARN, o que suxire que son o lugar onde se produce unha fase crítica do proceso da interferencia (RNAi).
miniatura|350px|esquerda|O encima Dicer corta en cachos o ARN de dobre cadea, para formar o ARN interferente pequeno ou o microARN. Estes ARN procesados son incorporados no complexo silenciador inducido por ARN (RISC), que ten como diana o ARN mensaxeiro para impedir a tradución.

 Silenciamento transcricional 
Compoñentes da vía da interferencia de ARN tamén son utilizados en moitos eucariotas no mantemento da organización e estrutura do xenoma. A modificación de histonas e a indución asociada da formación de heterocromatina serve para diminuír a expresión de xenes pre-transcricionalmente; este proceso denomínase silenciamento transcricional inducido por ARN (RITS), e lévao a cabo un complexo de proteínas chamado o complexo RITS. Nos lévedos de xemación este complexo contén os seguintes elementos: argonauta, unha proteína Chp1 cromodominio, e unha proteína chamada Tas3 de función descoñecida. Como consecuencia, a indución e propagación de rexións de heterocromatina require a presenza de argonauta e proteínas RdRP (ARN polimerse dependente de ARN). A deleción destes xenes no lévedo de xemación S. pombe distorsiona a metilación de histonas e a formación do centrómero, causando que a anafase sexa lenta ou quede estancada durante a división celular. Nalgúns casos, foron observados procesos reguladoros similares asociados coa modificación de histonas que producían o incremento transcricional da expresión xénica.

O mecanismo polo cal o complexo RITS induce a formación e organización da heterocromatina non se coñece ben, e a maioría dos traballos están enfocados o estudo da "rexión tipo apareamento" (mating-type region) dos lévedos de xemación, o cal pode non ser representativo das actividades noutras rexións xenómicas ou organismos. Para o mantemento das rexións de heterocromatina xa existentes, o RITS forma con siRNA un complexo complementario dos xenes locais e únese de forma estable ás histonas locais metiladas, actuando co-transcricionalmente para degradar calquera transcrito de pre-ARNm en formación que empece a formar a ARN polimerase. A formación desta rexión de heterocromatina, pero non o seu mantemento, é dependente de Dicer, probablemente porque se require Dicer para xerar o complemento inicial de siRNAs que se unirá aos transcritos que se formen posteriormente. Suxeriuse que o mantemento da heterocromatina funciona como un bucle de retroalimentación autorreforzado, xa que os novos siRNA se forman pola RdRP (ARN polimerase dependente de ARN) a partir de transcritos nacentes ocasionais para a súa incorporación en complexos RITS locais. A relevancia das observacións nas "rexións tipo apareamento" en lévedos e en centrómeros de mamíferos non está clara, xa que o mantemento da cromatina en células de mamíferos pode ser independente dos compoñentes da vía da interferencia de ARN (RNAi).

 Influencias entre a RNAi e a modificación do ARN 
O tipo de modificación ou "edición" do ARN máis frecuente en eucariotas superiores converte os nucleótidos de adenosina dos ARN de dobre cadea en nucleótidos de inosina por acción do encima adenosina desaminase (ADAR). En 2000 propúxose inicialmente que as vías da interferencia de ARN (RNAi) e da "edición" A→I do ARN poderían competir por un mesmo substrato de ARN de dobre cadea. De feito, algúns pre-microARN sofren a modificación A→I, e este mecanismo pode regular o procesamento e a expresión dos microARN maduros. Ademais, polo menos unha adenosina desaminase de mamífero pode secuestrar siRNA a partir dos compoñentes da vía de interferencia de ARN. Outros apoios a este modelo veñen de estudos de estirpes de C. elegans sen adenosina desaminase que indican que a modificación A→I do ARN pode contrarrestar o silenciamento por interferencia de ARN de xenes endóxenos e transxenes.
miniatura|300px|dereita|Ilustración das principais diferenzas entre o silenciamento de xenes en plantas e animais. O microARN expresado de forma nativa na célula ou o siRNA exóxeno son procesados por Dicer e integrados no complexo RISC, que media no silenciamento de xenes.

 Variación entre organismos 
Os organismos vivos varían na súa capacidade de tomar ARN de dobre cadea e utilizalo na vía da interferencia de ARN. Os efectos da interferencia de ARN en plantas e C. elegans poden ser tanto sistémicos coma herdables, aínda que non en Drosophila ou nos mamíferos. Nas plantas, pénsase que a interferencia de ARN se propaga pola transferencia de siRNA entre células a través dos plasmodesmos (canles das paredes celulares que comunican dúas células). A herdabilidade procede da metilación do ADN dos promotores que son dianas dos ARN interferentes; o novo patrón de metilación é copiado en cada nova xeración de células. Unha distinción xeral entre plantas e animais está no modo de unión ao obxectivo dos microARN producidos endoxenamente; nas plantas os microARN son xeralmente perfectamente ou case perfectamente complementarios dos seus xenes diana e inducen o corte directo de ARNm polo RISC, mentres que os microARN de mamíferos tenden a ser máis diverxentes en secuencia e inducen a represión da tradución. Este efecto sobre a tradución pode ser producido ao inhibir as interaccións dos factores iniciadores da tradución coa cola de poliadenina do ARNm.

Algúns protozoos, como Leishmania major e Trypanosoma cruzi, carecen por completo da vía da interferencia de ARN (RNAi). A maioría ou todos os compoñentes da RNAi tampouco se atopan nalgúns fungos, singularmente no lévedo Saccharomyces cerevisiae. Porén, un estudo recente revela a presenza de interferencia de ARN noutras especies de lévedos de xemación, como Saccharomyces castellii e Candida albicans, demostrando ademais que inducir dúas proteínas relacionadas coa interferencia de ARN de S. castellii facilita a interferencia de ARN en S. cerevisiae. O feito de que certos fungos ascomicetos e basidiomicetos estean perdendo as vías da interferencia de ARN indica que as proteínas requiridas para o silenciamento de ARN se perderon independentemente en moitas liñas evolutivas fúnxicas, posiblemente debido á evolución dunha nova vía con función similar, ou á ausencia de vantaxe selectiva en certos nichos ecolóxicos.

 Sistemas procarióticos relacionados 
A expresión xénica en procariotas está influenciada por un sistema baseado no ARN similar nalgúns aspectos á RNAi. Nestes seres vivos, xenes que codifican ARN controlan a abundancia de ARNm ou a tradución producindo un ARN complementario que se une por apareamento de bases complementarias co ARNm. Porén, estes ARN reguladores xeralmente non se consideran análogos aos microARN porque non está implicado no proceso o encima Dicer. Suxeriuse que os sistemas procarióticos de interferencia CRISPR (loci chamados Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) son análogos aos sistemas eucarióticos de interferencia de ARN, aínda que ningún dos compoñentes proteicos é ortólogo.

 Funcións biolóxicas 
 Immunidade 
A interferencia de ARN é unha parte vital da resposta inmune a virus e outros materiais xenéticos alleos, especialmente en plantas, nas que pode tamén previr a auto-propagación de transposóns. As plantas como Arabidopsis thaliana expresan múltiples homólogos de Dicer que se especializan en reaccionar de modo diferente cando a planta se expón a diferentes tipos de virus. Xa antes de que a vía da interferencia de ARN (RNAi) fose completamente comprendida, sabíase que o silenciamento de xenes inducido en plantas podía estenderse a través de toda a planta cun efecto sistémico, e podía ser transferido por medio de enxertos. Desde entón este fenómeno foi recoñecido como unha característica do sistema inmune adaptativo das plantas, e permite a toda a planta responder a un virus despois de ter un encontro inicial con el localizado. En resposta a isto, en moitos virus de plantas evolucionaron mecanismos elaborados que suprimen a resposta de RNAi da célula da planta. Isto inclúe a evolución de proteínas virais que se unen a fragmentos curtos de ARN de dobre cadea con extremos de cadea simple que sobresaen, como os que teñen os ARN sometidos á acción de Dicer. Algúns xenomas de plantas tamén expresan siRNA endóxenos en resposta á infección por diversos tipos de bacterias. Estes efectos poden ser parte dunha resposta xeneralizada da planta a patóxenos, que diminúe a actividade de calquera proceso metabólico da célula hóspede que axude ao proceso de infección.

Aínda que os animais xeralmente expresan poucas variantes do encima Dicer comparados coas plantas, a interferencia de ARN (RNAi) nalgúns animais tamén dá lugar a unha resposta antiviral. Tanto en Drosophila inmatura coma adulta, a interferencia de ARN é importante na inmunidade innata antiviral e é activa contra patóxenos como o virus X de Drosophila. Un papel similar na inmunidade pode funcionar en C. elegans, xa que a cantidade de proteínas argonauta se incrementa en resposta a virus, e os vermes que aumentan a expresión de compoñentes da vía da RNAi son resistentes á infección viral.

A función da interferencia de ARN na inmunidade innata en mamíferos está mal comprendida, e hai relativamente poucos datos dispoñibles. Non obstante, a existencia de virus que codifican xenes capaces de suprimir a resposta de RNAi das células de mamíferos pode ser unha evidencia en favor da existencia dunha resposta inmune dependente da RNAi en mamíferos. Porén, esta hipótese da inmunidade mediada pola interferencia de ARN en mamíferos é discutida e non está ben demostrada. Tamén existen funcións alternativas á interferencia de ARN en virus de mamíferos, como os microARN expresados polos virus herpes que poden actuar como causantes da organización da heterocromatina para mediar a latencia viral.

 Diminución da expresión dun xene 
Os microARN expresados endoxenamente, incluíndo tanto microARN intrónicos coma interxénicos, son moi importantes na represión da tradución e na regulación do desenvolvemento do organismo, especialmente na temporización da morfoxénese e no mantemento de tipos celulares indiferenciados ou diferenciados incompletamente como as células troncais ou nais. A función dos microARN expresados endoxenamente na diminución da expresión xénica describiuse por primeira vez en C. elegans en 1993. En plantas esta función descubriuse cando se demostrou que o "microARN JAW" de Arabidopsis estaba implicado na regulación de varios xenes que controlan a forma das plantas. Nas plantas, a maioría dos xenes regulados por microARN son de factores de transcrición; deste modo, a actividade dos microARN ten un alcance particularmente amplo e regula redes xénicas completas durante o desenvolvemento por medio da modulación da expresión de xenes reguladores chave, incluíndo factores de transcrición como as proteínas F-box. En moitos organismos, entre eles os humanos, os microARN foron tamén vinculados coa formación de tumores e a desregulación do ciclo celular. Neste caso, os micro ARN poden funcionar como oncoxenes ou como supresores de tumores.

 Amplificación da expresión dun xene 
As secuencias de ARN (siRNA e microARN) que son complementarias de partes dun promotor poden incrementar a transcrición dun xene, un fenómeno denominado activación de ARN ou RNAa. Coñécese parte do mecanismo polo que estes ARN amplifican a expresión dun xene: están implicados Dicer e Argonauta, posiblemente por medio da desmetilación de histonas.. Tamén se propuxo que os microARN amplifican a expresión dos seus xenes diana parando o ciclo celular, pero os mecanismos polos que o realizan non están clarosVasudevan, S.; Tong, Y.; Steitz, J. A. (2007). "Switching from Repression to Activation: MicroRNAs Can Up-Regulate Translation". Science 318 (5858): 1931–1934. doi:10.1126/science.1149460. PMID 18048652.​.

 Evolución 
Baseándose en análises filoxenéticas de máxima parsimonia, o antepasado común máis recente de todos os eucariotas moi probablemente posuía xa un sistema primitivo de interferencia de ARN; a ausencia desta vía en certos eucariotas pénsase que se debe unha característica secundaria derivada. Este sistema ancestral de RNAi contiña seguramente polo menos unha proteína similar a Dicer, unha Argonauta, unha proteína PIWI, e unha ARN polimerase dependente de ARN, que tamén podían desempeñar outras funcións na célula. Un estudo de xenómica comparada de ampla escala indica igualmente que o grupo coroa eucariótico xa posuía estes compoñentes, os cales puideron entón ter asociacións funcionais máis estreitas con sistemas de degradación xeneralizada de ARN como o complexo exosoma. Este estudo tamén suxire que a familia de proteínas argonauta de unión ao ARN, que comparten os eucariotas, a maioría das arqueas, e polo menos algunhas bacterias (como Aquifex aeolicus), é homólogo e evolucionou orixinalmente a partir de compoñentes do sistema de tradución.

En xeral hai acordo en que a función ancestral do sistema de RNAi era a defensa inmune contra elementos xenéticos exóxenos como transposóns e xenomas virais. Outras funcións relacionadas como as modificacións de histonas puideron estar xa presentes no antepasado dos eucariotas modernos, aínda que outras funcións como a regulación do desenvolvemento embrionario por microARN se cre que evolucionaron máis tarde.

Os xenes da interferencia de ARN, como compoñentes do sistema inmunitario innato antiviral en moitos eucariotas, están implicados na carreira armamentística evolutiva cos xenes virais. Nalgúns virus evolucionaron mecanismos para suprimir a resposta da RNAi nas células hóspedes, un efecto que foi detectado especialmente nos virus de plantas. Demostrouse en estudos das taxas evolutivas en Drosophila que os xenes na vía da RNAi están suxeitos a unha forte selección direccional e están entre os xenes de evolución máis rápida no xenoma de Drosophila.

 Aplicacións tecnolóxicas 
 Knockdown de xenes 
A vía da interferencia de ARN é a miúdo aproveitada en bioloxía experimental para estudar a función dos xenes en cultivos celulares e in vivo en organismos modelo. Nestes experimentos sintetízase ARN de dobre cadea cunha secuencia complementaria dun xene de interese e introdúcese nunha célula ou organismo, onde é recoñecido como material xenético exóxeno e activa a vía da interferencia (RNAi). Usando este mecanismo, os investigadores poden causar unha diminución drástica da expresión dun xene diana. Estudando os efectos desta diminución poden coñecerse as funcións fisiolóxicas do produto do xene. Como a RNAi non pode suprimir completamente a expresión do xene, esta técnica denomínase "knockdown", para distinguila dos procedementos "knockout" nos que a expresión do xene é completamente eliminada.

Dedicáronse grandes esforzos en bioloxía computacional dirixidos a deseñar reactivos de ARN de dobre cadea que maximicen o knockdown pero minimicen os efectos "fóra de obxectivo" destas técnicas. Os efectos fóra do obxectivo orixínanse cando un ARN introducido ten unha secuencia de bases que pode aparearse complementariamente con múltiples xenes á vez e así reducir a expresión de todos eles. Estes problemas ocorren máis frecuentemente cando o ARN de dobre cadea (dsRNA) contén secuencias repetitivas. Estímase por estudos nos xenomas do H. sapiens, C. elegans, e S. pombe que arredor do 10% dos posibles siRNA van ter efectos fóra do obxectivo substanciais. Desenvolveuse unha gran cantidade de ferramentas de software para aplicar algoritmos para o deseño de siRNA xeral, específico de mamíferos, e específico de virus, que son comprobados automaticamente para determinar a súa posible reactividade cruzada.

Dependo do organismo e o sistema experimental, o ARN exóxeno pode ser unha cadea longa deseñada para ser cortada por Dicer, ou un ARN curto deseñado para servir como substrato para os siRNA. Na maioría das células de mamíferos, úsanse ARN máis curtos porque as moléculas de ARN de dobre cadea longas inducen a resposta de interferón en mamíferos, un tipo de inmunidade innata que reacciona non especificamente co material xenético alleo. Nos ovocitos de rato e nas células das fases embrionarias iniciais do rato está ausente esta reacción ao ARN de dobre cadea (dsRNA) exóxeno e son, por tanto, un sistema modelo común para estudar os efectos do knockdown de xenes en mamíferos. Tamén se puxeron a punto técnicas especializadas de laboratorio para mellorar a utilidade da RNAi en sistemas de mamíferos evitando a introdución directa de siRNA; por exemplo, por medio da transfección estable con plásmidos que codifican a secuencia apropiada a partir da cal se pode transcribir un siRNA, ou por sistemas vector de lentivirus máis elaborados, que permiten a activación inducible ou a desactivación da transcrición, coñecidas como interferencia de ARN condicional.

 Xenómica funcional 
miniatura|esquerda|250px|Adulto normal da mosca Drosophila, un organismo modelo común utilizado nos experimentos de RNAi.
miniatura|esquerda|250px|Verme adulto da especie C. elegans, que creceu coa supresión por RNAi dun receptor de hormona nuclear implicado na regulación da desaturase. Estes vermes teñen un metabolismo dos ácidos graxos anormal pero son viables e fértiles.

A maioría das aplicacións da xenómica funcional da RNAi en animais utilizaron a C. elegans e Drosophila, xa que estes son os organismos modelo nos que a interferencia de ARN (RNAi) é máis efectiva. C. elegans é especialmente útil para a investigación da RNAi por dúas razóns: a primeira é que os efectos do silenciamento de xenes son xeralmente herdables, e a segunda é que a introdución do ARN bicatenario (dsRNA) é extremadamente simple. Por medio dun mecanismo cuxos detalles non se coñecen ben, as bacterias como Escherichia coli que levan o dsRNA desexado poden servir de alimento aos vermes e así transferirlles o seu cargamento de ARN por vía intestinal. Esta "introdución durante a alimentación" é tan efectiva para inducir o silenciamento de xenes coma outros métodos máis custosos e que levan moito máis tempo, como meter os vermes nunha solución de dsRNA ou inxectar dsRNA nas gónadas. Aínda que a introdución é máis difícil na maioría dos demais organismos, estanse a facer esforzos para realizar exames xenómicos a larga escala en cultivos celulares de células de mamíferos.

O deseño de librarías de interferencia de ARN de todo o xenoma poden requirir máis sofisticación ca o deseño dun só siRNA para un conxunto determinado de condicións experimentais. Úsanse frecuentemente redes neurais artificiais para deseñar librarías de siRNA e para predicir a súa probable eficiencia no knockdown de xenes. Os exames xenómicos en masa considéranse un método moi prometedor para a anotación do xenoma (asociar información da súa estrutura e función aos xenes) e supuxeron o desenvolvemento de métodos de exame ou cribado de alto rendemento baseados en micromatrices ou microarrays. Porén, a utilidade destes exames e a capacidade das técnicas desenvolvidas en organismos modelo para xeneralizalas a outras especies (mesmo relacionadas) foi cuestionado; por exemplo xeneralizar resultados de C. elegans a nematodos parasitos relacionados.

A xenómica funcional que utiliza a interferencia de ARN é unha técnica particularmente atractiva para o mapeado xenómico e a anotación do xenoma en plantas porque moitas plantas son poliploides, o cal supón grandes retos para os métodos de enxeñaría xenética máis tradicionais. Por exemplo, a RNAi foi usada con éxito en estudos de xenómica funcional en trigo de panificación (que é hexaploide) e tamén en modelos de planta máis comúns como Arabidopsis e millo.

 Medicina 
Tamén se utiliza a RNAi en terapéutica. Aínda que é difícil introducir ARN bicatenarios longos en células de mamíferos debido á resposta de interferón, o uso de moléculas que imitan aos siRNA foi moi exitosa. Entre as primeiras aplicacións para probas clínicas están o tratamento da dexeneración macular e das infeccións polo virus respiratorio sincicial, pero a RNAi tamén mostrou a súa efectividade en reverter os fallos hepáticos inducidos en modelos de rato.

Outros usos médicos propostos céntranse nas terapias antivirais, como tratamentos microbicidas tópicos (realizados na Harvard University Medical School; en ratos polo momento), que usan a RNAi para tratar a infección polo virus herpes simplex tipo 2 e a inhibición da expresión xénica viral de células cancerosas, o knockdown de receptores e correceptores do hóspede para o VIH, silenciamento dos virus da hepatite A e da hepatite B, silenciamento da expresión xénica da influenza, e a inhibición da replicación viral en casos de sarampelo. Tamén se propuxeron tratamentos potenciais para enfermidades neurodexenerativas, con atención particular ás enfermidades de poliglutaminas como a enfermidade de Huntington. A interferencia de ARN tamén se contempla como un método prometedor para o tratamento do cáncer por medio do silenciamento de xenes que están sobreactivados diferencialmente nas células tumorais ou xenes implicados na división celular. Unha área chave de investigación no uso da RNAi para aplicacións médicas é o desenvolvemento de métodos seguros de introdución dos ARN, o cal ata agora implica fundamentalmente a sistemas con vector viral similares aos propostos para a terapia xénica.

Malia a proliferación de estudos prometedores en cultivos celulares de fármacos baseados na interferencia de ARN, hai algunha preocupación sobre a seguridade de dita interferencia, especialmente polos efectos potenciais "fóra do obxectivo" nos cales tamén se ve reprimido outro xene cunha secuencia casualmente similar á do xene diana. Un estudo xenómico computacional estimou que a taxa de erro das interaccións fóra do obxectivo é de arredor do 10%. Un importante estudo da enfermidade hepática nos ratos produciu unha alta proporción de mortes nos animais experimentais, o que se suxeriu que pode ser o resultado da "sobresaturación" da vía dos ARN bicatenarios (dsRNA), debido ao uso de shRNA (small hairpin RNA) que teñen que ser procesados no núcleo e exportados ao citoplasma utilizando un mecanismo activo. Todas estas son consideracións que se están a investigar activamente, para reducir o seu impacto nas aplicacións terapéuticas potenciais da RNAi.

Estanse preparando tamén aplicacións baseadas na interferencia de ARN que teñen como obxectivo as infeccións persistentes por VIH-1. Os virus como o VIH-1 son dianas particularmente difíciles para o ataque por interferencia de ARN porque son propensos a escapar del, polo que se requiren estratexias de RNAi combinatoria para previr o escape viral. O futuro das terapéuticas por RNAi antiviral é moi prometedor, pero segue tendo a máxima importancia incluír moitos controis nos modelos das probas pre-clínicas para demostrar de forma inequívoca a acción específica da secuencia dos indutores da RNAi.

 Biotecnoloxía 
A interferencia de ARN utilízase en diversas aplicacións biotecnolóxicas, especialmente na enxeñaría xenética de plantas comestibles que produce baixos niveis de toxinas vexetais naturais. Tales técnicas toman vantaxe do fenotipo RNAi estable e herdable en poboacións de plantas. Por exemplo, as sementes de algodón son ricas en proteínas nutritivas pero conteñen de forma natural un produto terpenoide tóxico chamado gosipol, o que as fai inadecuadas para o consumo humano. A interferencia de ARN foi usada para producir poboacións de algodón con sementes de baixo contido en delta-cadineno sintase, un encima chave para a produción do gosipol, sen que isto afecte á produción do encima noutras partes da planta, onde o gosipol é importante para impedir os danos causados por pragas. Esforzos similares dirixíronse cara á redución dun produto cianoxénico natural chamado linamarina nas plantas de mandioca.

Aínda que polo momento ningún produto vexetal orixinado por enxeñaría xenética baseada na interferencia de ARN pasou da fase puramente experimental, os esforzos realizados no seu desenvolvemento xa reduciron con éxito os niveis de alérxenos no tomate e fixeron descender os niveis dos precursores de probables carcinóxenos na planta do tabaco. Outras características de plantas que foron modificadas por enxeñaría xenética son a produción de produtos naturais sen efectos narcóticos na papoula do opio, a resistencia a diversos virus comúns das plantas, e a fortificación de plantas como os tomates con antioxidantes dietarios. Produtos comercializados inicialmente, como o tomate Flavr Savr e dous cultivares de papaia resistentes ao virus das manchas circulares da papaia, foron orixinalmente desenvolvidas utilizando a tecnoloxía antisentido pero aproveitando probablemente a vía da RNAi.

 Rastreo de RNAi a escala xenómica 
A investigación da RNAi a escala xenómica depende da tecnoloxía do cribado ou rastreo de alto rendemento (HTS, High-throughput Screening). A tecnoloxía HTS de interferencia de ARN permite un exame de perdas de función de xenes en todo o xenoma e úsase moito na identificación de xenes asociados con fenotipos biolóxicos específicos. Esta tecnoloxía foi celebrada como a segunda onda da xenómica, despois da que foi a primeira, o microarray para a expresión xénica e o polimorfismo dun único nucleótido. Unha das maiores vantaxes do exame (ou cribado) de RNAi a escala xenómica é a súa capacidade para examinar simultaneamente miles de xenes. Coa súa capacidade de xerar unha gran cantidade de datos en cada experimento, o exame de RNAi a escala xenómica levou a unha explosión na cantidade de datos xerada. En consecuencia, un dos retos principais nas investigacións de RNAi a escala xenómica é extraer significancia biolóxica da análise dunha morea de datos, o cal require a adopción de métodos estatísticos/bioinformáticos axeitados como os presentados nun libro de recente publicación sobre o cribado de RNAi. O proceso básico dos exames de RNAi baseados en células comprende: (1º) a elección dunha libraría de RNAi, (2º) a selección dun tipo de células estable e resistente, (3º) a transfección de células seleccionadas con axentes de RNAi da libraría de RNAi elixida, (4º) a incubación ou tratamento necesario, (5º) a detección de sinais, (6º) a análise estatística e bioinformática, e (7º) a determinación de xenes importantes ou dianas terapéuticas.

 Historia e descubrimento 
miniatura|350px|dereita|Flores de petunia nas que os xenes para a pigmentación foron silenciados por RNAi. A planta da esquerda é o tipo salvaxe; a planta da dereita contén transxenes que inducen a supresión tanto de transxenes coma a de xenes endóxenos, dando lugar a áreas brancas non pigmentadas na flor.
O descubrimento da interferencia de ARN foi precedido por observacións de inhibición transcricional por ARN antisentido expresado en plantas transxénicas, e máis directamente por informes de resultados inesperados en investigacións realizadas por científicos que experimentaban con plantas en Estados Unidos e Países Baixos a inicios da década de 1990. Para intentar alterar as cores das flores das petunias, os investigadores introduciron copias adicionais dunha chalcona sintase xeneticamente codificada, un encima chave para a pigmentación da flor nas petunias dunha cor normalmente rosa ou violeta. Esperábase que o xene sobreexpresado orixinase flores máis escuras, pero o que obtiveron foron flores menos pigmentadas, parcial ou totalmente brancas, o que indicaba que a actividade da chalcona sintase fora substancialmente diminuída; de feito, nas flores brancas estaba reducida a expresión tanto dos xenes endóxenos coma dos transxenes introducidos. Pouco despois, foi detectado no fungo Neurospora crassa un efecto relacionado chamado "sufocamento" (quelling), aínda que naquel momento esta relación non foi inmediatamente recoñecida. Posteriores investigacións do fenómeno en plantas indicaron que a regulación á baixa da expresión do xene era debida a inhibición postranscricional da expresión xenética por medio do incremento das taxas de degradación do ARNm. Este fenómeno foi denominado co-supresión da expresión xénica, pero os mecanismos moleculares seguían sen coñecerse.

Non moito despois, os virologos de plantas traballando na mellora da resistencia das plantas ás doenzas virais observaron un fenómeno inesperado similar. Aínda que se sabía que as plantas que expresaban proteínas específicas de virus mostraban un incremento da tolerancia ou resistencia á infección viral, non se agardaba que as plantas que levasen só rexións non codificantes curtas de secuencias de ARN viral mostrasen niveis similares de protección. Os investigadores crían que o ARN viral producido por transxenes podía tamén inhibir a replicación viral. O experimento inverso, no cal eran introducidos dentro dos virus secuencias curtas de xenes de plantas, mostraban que o xene diana era suprimido nas plantas infectadas por eses virus. Este fenómeno foi denominado "silenciamento de xenes inducido por virus" (VIGS), e o conxunto de todos estes fenómenos foi chamado silenciamento de xenes postranscricional.

Despois destas observacións iniciais en plantas, moitos laboratorios de todo o mundo investigaron a presenza destes fenómenos noutros organismos. En 1998 Craig C. Mello e Andrew Fire publicaron en Nature un traballo no que se informaba dun potente efecto de silenciamento de xenes despois da inxección de ARN de dobre cadea en C. elegans. Ao investigaren a regulación da produción de proteína muscular, observaron que nin as inxeccións de ARNm nin de ARN antisentido tiñan efecto na produción de proteínas, pero que o ARN de dobre cadea (dsRNA) silenciaba o xene diana con éxito. Como resultado deste traballo, estes investigadores acuñaron o termo RNAi (interferencia de ARN). Os descubrimentos de Fire e Mello foron particularmente notables porque representaban a primeira identificación do axente causante do fenómeno. Fire e Mello recibiron o Premio Nobel de Medicina e Fisioloxía en 2006 por estes traballos.

 Notas 

 Véxase tamén 
 Outros artigos 
 ARN interferente
 Morfolino

 Ligazóns externas 
 Overview of the RNAi process, de Cambridge University's The Naked Scientists
 Animación do proceso de RNAi, de Nature
 NOVA scienceNOW explica a RNAi – Un vídeo de 15 minutos da serie Nova, emitida inicialmente en 2005.
 Silencing Genomes  Experimentos de RNAi e bioinformatica en C. elegans educativos. Do Dolan DNA Learning Center do Cold Spring Harbor Laboratory.
 Cribado de RNAi en C. elegans en formato líquido de 96 pozos e a súa aplicación para a identificación sistemática de interaccións xenéticas (un protocolo)
 Dous "homes dos vermes" americanos gañan o Premio Nobel polos seus traballos sobre o ARN, do NY Times'' 
 Molecular Therapy web focus: "The development of RNAi as a therapeutic strategy" , colección de artigos libres sobre a RNAi como estratexia terapéutica.
 DesiRM: Deseño de siRNA complementario e non complementario para o silenciamento de xenes

Categoría:ARN
Categoría:Xenética molecular
Categoría:Interferencia de ARN