هدف‌گیری ژنی

هدف‌گیری ژنی (به انگلیسی Gene targeting) یک تکنیک ژنتیکی است که با استفاده از نوترکیبی همولوگ، یک ژن درون زا (endogenous gene) را تغییر می‌دهند. این روش می‌تواند برای حذف یک ژن، حذف اگزون‌ها، اضافه کردن یک ژن و ایجاد جهش‌های نقطه‌ای مورد استفاده قرار گیرد. هدف‌گیری ژن می‌تواند دائمی یا شرطی باشد. منظور از «شرطی»، زمان یا دوره خاصی از زندگی ارگانیسم یا بافت خاص است. هدف‌گیری ژنی نیاز به ایجاد یک حامل (وکتور) خاص برای هر ژن مورد نظر دارد. با این حال، می‌تواند برای هر ژنی، بدون در نظر گرفتن فعالیت رونویسی یا اندازه ژن مورد استفاده قرار گیرد.1. Egener, T. ; Granado, J. ; Guitton, M. C. ; Hohe, A. ; Holtorf, H. ; Lucht, J. M. ; Rensing, S. A. ; Schlink, K. ; Schulte, J. ; Schween, G. ; Zimmermann, S. ; Duwenig, E. ; Rak, B. ; Reski, R. (2002). "High frequency of phenotypic deviations in Physcomitrella patens plants transformed with a gene-disruption library". BMC Plant Biology. 2: 6. doi:10.1186/1471-2229-2-6. PMC 117800. PMID 12123528.

 روش‌ها 
روش‌های هدف‌گیری ژن برای چندین موجود مدل ایجاد شده‌است و ممکن است بسته به نوع گونهٔ مورد استفاده، متفاوت باشد. به‌طور کلی، یک سازه هدف‌گیری که از DNA ساخته شده‌است در باکتری تولید می‌شود. این سازه به‌طور معمول شامل بخشی از ژن که مورد هدف قرار می‌گیرد، یک ژن گزارشگر و یک نشانگر انتخابی (غالب) است.

به منظور هدف‌گیری ژن در موش، این سازه سپس به سلول‌های بنیادی جنینی موش در محیط کشت تزریق می‌شود. پس از آن که سلول‌های با تزریق صحیح انتخاب شدند، می‌توان آن‌ها را برای مشارکت در بافت یک موش از طریق تزریق به جنین مورد استفاده قرار داد. در نهایت، موش کایمری که در آن سلول‌های تغییر یافته اندام‌های تناسلی را ساخته‌اند، برای تولید مثل انتخاب می‌شوند. پس از این مرحله تمام بدن موش بر پایه سلول‌های بنیادی جنینی که قبلاً انتخاب شده‌است می‌باشد.

به منظور هدف‌گیری ژن در خزه، این ساختار به همراه پروتوپلاست‌های تازه جدا شده و با پلی اتیلن گلیکول انکوبه می‌شود. از آنجایی که خزه‌ها موجوداتی هاپلوئید هستند،2. Ralf Reski (1998): Development, genetics and molecular biology of mosses. Botanica Acta 111, 1-15. به منظور هدف‌گیری ژن، رشته‌های خزه (protonema) که قابلیت باززایی دارند را می‌توان از طریق تیمار با آنتی‌بیوتیک یا با استفاده از روش PCR، غربالگری کرد. از آن جایی که خزه‌ها در میان گیاهان منحصر به فرد هستند، این روش برای استفاده در ژنتیک معکوس به کارآمدی استفاده در مخمر می‌باشد.3. Ralf Reski(1998): Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics. Trends Plant in Science 3, 209-210. با استفاده از روش‌های تغییر یافته، هدف‌گیری ژن نیز با موفقیت در گاو، گوسفند، خوک و بسیاری از قارچ‌ها انجام شده‌است.

فراوانی هدف‌گیری ژن می‌تواند به‌طور قابل توجهی از طریق استفاده از اندونوکلئازهای مهندسی شده مانند نوکلئازهای انگشت روی (zinc finger nucleases),4. Bibikova, M. ; Beumer, K. ; Trautman, J. ; Carroll, D. (2003). "Enhancing Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases". Science. 300 (5620): 764. doi:10.1126/science.1079512. PMID 12730594. اندونوکلئازهای خانگی مهندسی شده (homing endonucleases),5. Grizot, S. ; Smith, J. ; Daboussi, F. ; Prieto, J. ; Redondo, P. ; Merino, N. ; Villate, M. ; Thomas, S. ; Lemaire, L. ; Montoya, G. ; Blanco, F. J. ; Pâques, F. ; Duchateau, P. (2009). "Efficient targeting of a SCID gene by an engineered single-chain homing endonuclease". Nucleic Acids Research. 37 (16): 5405–5419. doi:10.1093/nar/gkp548. PMC 2760784. PMID 19584299. و نوکلئازهای بر پایه عوامل مؤثر TAL مهندسی شده (engineered TAL effectors) افزایش یابد.6. Miller, J. C. ; Tan, S. ; Qiao, G. ; Barlow, K. A. ; Wang, J. ; Xia, D. F. ; Meng, X. ; Paschon, D. E. ; Leung, E. ; Hinkley, S. J. ; Dulay, G. P. ; Hua, K. L. ; Ankoudinova, I. ; Cost, G. J. ; Urnov, F. D. ; Zhang, H. S. ; Holmes, M. C. ; Zhang, L. ; Gregory, P. D. ; Rebar, E. J. (2010). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology. 29 (2): 143–148. doi:10.1038/nbt.1755. PMID 21179091. تا به امروز، این روش بر روی تعدادی از گونه‌ها از جمله مگس سرکه(۴)، تنباکو،7. Cai, C. Q. ; Doyon, Y. ; Ainley, W. M. ; Miller, J. C. ; Dekelver, R. C. ; Moehle, E. A. ; Rock, J. M. ; Lee, Y. L. ; Garrison, R. ; Schulenberg, L. ; Blue, R. ; Worden, A. ; Baker, L. ; Faraji, F. ; Zhang, L. ; Holmes, M. C. ; Rebar, E. J. ; Collingwood, T. N. ; Rubin-Wilson, B. ; Gregory, P. D. ; Urnov, F. D. ; Petolino, J. F. (2008). "Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases". Plant Molecular Biology. 69 (6): 699–709. doi:10.1007/s11103-008-9449-7. ISSN 0167-4412. PMID 19112554.8. Townsend, J. A. ; Wright, D. A. ; Winfrey, R. J. ; Fu, F. ; Maeder, M. L. ; Joung, J. K. ; Voytas, D. F. (2009). "High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases". Nature. 459 (7245): 442–445. Bibcode:2009Natur.459..442T. doi:10.1038/nature07845. PMC 2743854. PMID 19404258. ذرت،9. Shukla, V. K. ; Doyon, Y. ; Miller, J. C. ; Dekelver, R. C. ; Moehle, E. A. ; Worden, S. E. ; Mitchell, J. C. ; Arnold, N. L. ; Gopalan, S. ; Meng, X. ; Choi, V. M. ; Rock, J. M. ; Wu, Y. Y. ; Katibah, G. E. ; Zhifang, G. ; McCaskill, D. ; Simpson, M. A. ; Blakeslee, B. ; Greenwalt, S. A. ; Butler, H. J. ; Hinkley, S. J. ; Zhang, L. ; Rebar, E. J. ; Gregory, P. D. ; Urnov, F. D. (2009). "Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases". Nature. 459 (7245): 437–441. Bibcode:2009Natur.459..437S. doi:10.1038/nature07992. PMID 19404259. سلول‌های انسانی،10. Urnov, F. D. ; Miller, J. C. ; Lee, Y. L. ; Beausejour, C. M. ; Rock, J. M. ; Augustus, S. ; Jamieson, A. C. ; Porteus, M. H. ; Gregory, P. D. ; Holmes, M. C. (2005). "Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases". Nature. 435 (7042): 646–651. Bibcode:2005Natur.435..646U. doi:10.1038/nature03556. PMID 15806097. موش و رت11. Cui, X. ; Ji, D. ; Fisher, D. A. ; Wu, Y. ; Briner, D. M. ; Weinstein, E. J. (2010). "Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases". Nature Biotechnology. 29 (1): 64–7. doi:10.1038/nbt.1731. PMID 21151125. اعمال شده‌است.

 مقایسه با روش به دام انداختن ژن 
به دام انداختن ژن بر پایه درج تصادفی یک قطعه نوکلئوتیدی (cassette) می‌باشد در حالی که در هدف‌گیری ژن یک ژن خاص مورد هدف قرار می‌گیرد. کاست‌ها می‌توانند برای بسیاری از موارد مختلف استفاده شوند در حالی که نیاز است که مناطق همسان طرفین ژن در کاست‌های مخصوص هدف‌گیری ژن برای هر ژن طراحی شود. این باعث می‌شود که روش به دام انداختن ژن برای استفاده در پروژه‌های بزرگ آسان‌تر و مناسب تر از روش هدف‌گیری ژنی باشد. از سوی دیگر، روش هدف‌گیری ژن می‌تواند برای ژن‌های با رونوشت کم که در روش دیگر غیرقابل تشخیص هستند استفاده شود. همچنین، احتمال به دام افتادن، با اندازه اینترون افزایش می‌یابد. در هدف‌گیری ژن، این ژن‌های فشرده به راحتی تغییر می‌یابند.

 کاربردها 
هدف‌گیری ژن به‌طور گسترده‌ای برای مطالعهٔ بیماری‌های ژنتیکی انسانی با حذف ("knocking out") یا اضافه کردن ("knocking in ") جهش‌های خاص مورد نظر برای انواع مدل‌ها، مورد استفاده قرار گرفته‌است. در گذشته برای مهندسی، مدل‌های سلولی موشی استفاده می‌گردید و پیشرفت در فناوری‌های هدف‌گیری ژن، ایجاد موج جدیدی از مدل‌های بیماری انسانی isogenic را ممکن کرد. این مدل‌ها دقیق‌ترین مدل‌های آزمایشگاهی (in vitro) در دسترس پژوهشگران تا به امروز هستند، و توسعه داروها و روش‌های جدید تشخیصی منحصر به فرد(personalized) را به خصوص در زمینه سرطان تسهیل می‌نمایند.12. A Panel of Isogenic Human Cancer Cells Suggests a Therapeutic Approach for Cancers with Inactivated p53 Proc Natl Acad Sci U S A Printed online at www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0813333106

 منابع 

رده:تکنیک‌های ژن‌شناسی
رده:جانداران دستکاری‌شده ژنتیکی
رده:زیست‌شناسی مولکولی
رده:مهندسی زیستی
رده:مهندسی ژنتیک
رده:ویکی‌سازی رباتیک