CRISPR gene-edizio

CRISPR gene-edizioa (CRISPR, ingelesetik "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats", erregularki taldekatutako eta interespaziatutako sekuentzia palindromiko errepikakor laburrak) biologia molekularrean erabiltzen den ingeniaritza genetikoko teknika bat da, zeinaren bidez izaki bizidunen genomak alda daitezkeen. Bakterioen CRISPR-Cas9 oinarritzen da defentsa-sistema antibiralaren bertsio sinplifikatuan. Cas9 nukleasa RNA gidari (gRNA) sintetiko batekin elkartzean sortutako konplexua zelula batean barneratzean, zelularen genoma moztu egin daiteke desiratutako lekuan, eta horrela posible egin dagoeneko existitzen diren geneak in vivo kentzea edota gene berriak txertatzea. 

Guraize genetiko gisa lan eginez, Cas9 nukleasak DNAren itu-sekuentziaren bi harizpiak irekitzen ditu aldaketa sartzeko. Knock-in mutazioak egitea da, homologian oinarritutako konponketaren bidez (HDR), edizio genomikoan erabilitako bide tradizionala. Horri esker, DNAn kalte espezifikoak sartzen dira eta konponketa egiten da. Beraz, CRISPR-Cas9-ren ingeniaritza genomikoak zorizko geneen mozketa selektiboak egiteko gaitasuna ematen die ikertzaileei.

Laurogeiko hamarkadatik genoma-edizioa posiblea izan bada ere zelula eukariotoetan hainbat metodo erabilita, erabilitako metodoek erakutsi zuten ez zirela eraginkorrak ezta praktikoak eskala handian ezartzeko. CRISPRaren eta, zehazki, Cas9 nukleasa-molekularen aurkikuntzarekin, posiblea bihurtu zen edizio eraginkorra eta oso selektiboa egitea. Streptococcus pyogenes bakterio-espezietik eratorritako Cas9-ak erraztu du zelula eukariotoetan zuzendutako aldaketa genomikoa, ahalbidetzen baitu crRNA eta tracrRNA gida-kateek izendatutako kokapen espezifiko batean haustura espezifiko bat sortzeko metodo fidagarri bat. Cas9 nukleasaren aldaera berriak garatu dira, off-target (ituz kanpoko) jarduera nabarmen murrizten dutenak.

CRISPR teknika oso garrantzitsua da bioteknologian eta medikuntzan, genomak in vivo modu oso zehatz, merke eta errazean editatzeko ematen baitu aukera. Erabil daiteke sendagai, nekazaritza-produktu eta genetikoki eraldatutako organismo berriak sortzeko, edo patogenoak eta izurriteak kontrolatzeko baliabide gisa. Gaixotasun genetiko hereditarioen tratamenduan ere erabili izan da, baita mutazio somatikoetatik eratorritako gaixotasunetan ere, minbizia kasu. Hala ere, kezka bioetiko asko azaldu dira CRISPR teknika lerro germinalen ediziorako erabiltzeko aukeraren inguruan, bereziki giza enbrioietan. Teknikaren garapenari esker, Jennifer Doudnak eta  Emmanuelle Charpentierrek Kimikako Nobel saria jaso zuten 2020an.

 Ingeniaritza genomikoa 

 Cas proteinen sailkapena 
Gaur egun, CRISPR sistemak 6 mota dituzten bi klase handitan banatzen dira: 1. Klasea (I, III eta IV motak) eta 2. Klasea (II, V eta VI motak). I. motako sistema da bakterioetan gehien hedatuta dagoena, eta crRNAri lotuz konplexu multiproteiko bat eratuta bereizten dena, “babes antibiraleko CRISPRari lotutako konplexu” edo “Cascade” izenez ezaguna. Konplexu horrek DNA sekuentzia inbaditzaileak ezagutzen ditu eta Cas3 nukleasa bat erreklutatzen du dagokion mozketa egiteko. III. motako sistemak interferentziarako multi-Cas-proteina konplexuak (Csm) erabiltzen ditu. II. motako sisteman, Cas9 nukleasak tracrRNAren beharra du crRNArekin osatzeko eta, heltzean, itu-DNAren hiru nukleotidoren PAM sekuentzia ezagutzen du. V sisteman, Cas12 da proteina efektore bereizgarria. II. motako sistemetan bezala, V sistemen azpimota batzuek tracrRNA behar dute crRNAren heltzerako eta interferentziarako. Azkenik, VI. motako sistemak Cas13 proteina erabiltzen du, itu-RNArekin lotzean aktibatzen den RNAsa bat, itu-RNA zein alboko RNA degradatzen dituena. PAM gune bat ezagutzen duten beste Cas proteinek ez bezala, Cas13-k RNA inbaditzailean protobanatzailearen (PFS) alboko gune bat ezagutzen du.

II. motako sistema da organismoen genomak editatzeko tresna molekular gisa gehien erabiltzen dena. Sistema horrek Cas9 nukleasa du, crRNAk gidatuta DNAn kate bikoitzeko ebakiak sortzen dituen entzima.
+MotaEfektoreaNukleasaItuatracrRNA beharra1. KlaseaIMultiproteikoaCas3DNAEzIIICas10DNA/RNAEzIV???2. KlaseaIIProteina hainbat domeinurekinCas9DNABaiVCas12DNAAzpimota batzukVICas13RNAEz

 CRISPR-Cas9 sistema 

 Oinarrizko osagaiak 
CRISPR-Cas9-k II motako CRISPR sistema erabiltzen du, hau da, DNA mozten duen sistema Cas9 nukleasa erabiliz. Sistema hau erribonukleoproteina batez osatuta dago, crRNA, tracrRNA, Cas9 nukleasa eta DNA konpoketa-txantiloi bat dituena.
+crRNADNA ostalariaren segmentu zuzena aurkitzen duen RNA gidaria dauka, tracRNAri lotzen zaion eskualde batekin batera (normalean begizta formakoa), konplexu aktiboa osatzen duena.tracrRNAcRNArekin bat egiten du eta konplexu aktibo bat osatzen du.sgRNA“Single-guide” RNAk crRNA batez, gutxienez, eta tracrRNAz osatutako RNA elkartuak dira.Cas9Entzima honen forma aktiboa DNA eraldatzeko gai da.  Funtzio ezberdinak dituzten aldaera asko daude, entzima bakoitza DNA eskualde jakin bat ezagutzeko gai delako.Konponketa-txantiloiaOstalariaren zelulan txantiloi gisa erabiltzen den DNA molekula da. Horri esker, DNA sekuentzia espezifikoa txerta daiteke Cas9-k apurtutako DNA ostalariaren eskualdean. Osagai hau hautazkoa da.
CRISPR-Cas9 teknikan askotan erabiltzen dira erribonukleoproteinaren osagaiak kodetzen dituzten plasmidoak, osagai hauek itu-zeluletara transfektatu ditzaten; edo erribonukleoproteina muntatu egiten da, nukleofekzio bidez zeluletan sartu aurretik. Plasmido honen osagai nagusiak taulan zerrendatu dira. crRNA aplikazio bakoitzerako modu espezifikoan diseinatzen da, hori baita Cas9-k zelula ostalariaren DNAren sekuentzia espezifikoak identifikatzeko eta horiei batzeko erabiltzen duen sekuentzia. crRNA soilik batu behar da editatu nahi diren sekuentzietan. Konponketa-txantiloia ere aplikazio bakoitzerako espezifikoki diseinatuta dago; izan ere, nolabaiteko osagarritasuna izan behar du ebaketaren alde bakoitzeko DNA sekuentziekin. Gainera, ostalariaren genoman txertatu nahi den edozein sekuentzia eduki behar du bere baitan.

crRNA eta tracrRNA asko paketatu daitezke “single-guide” RNA (sgRNA) bakarra sortzeko. sgRNA hori Cas9 proteina kodetzen duen genearekin batera sar daiteke eta plasmidoan txertatua izan, zeluletan transfektatua izateko. Tresna online asko eskuragarri daude sgRNA sekuentzia eraginkorrak diseinatzen laguntzeko.thumb|CRISPR-Cas9 plasmidoaren eraikuntzaren ikuspegi orokorra
 Egitura 
CRISPR-Cas9-k fideltasun maila handia eta eraikuntza nahiko sinplea eskaintzen ditu. Bi faktoreren menpe dago bere espezifikotasunerako: itu-sekuentzia eta ondoko motibo protobanatzailearen (PAM) sekuentzia. Itu-sekuentziak 20 baseko luzera du CRISPR locus bakoitzaren zati gisa. Cas9 proteinek ostalariaren genoman kokapen egokia aukeratzen dute ostalariaren DNAn base-pareekin elkartzeko sekuentzia erabiliz. Sekuentzia ez da Cas9 proteinaren parte eta, ondorioz, pertsonalizagarria da eta modu independentean sintetizatu daiteke.

PAM sekuentzia ostalariaren genoman Cas9-ren bidez ezagutzen da. Cas9 ezin da erraz aldatu PAM sekuentzia desberdin bat ezagutzeko. Dena den, hori azken finean ez da mugatzaileegia, normalean genoman zehar leku askotan gertatzen den sekuentzia oso laburra eta inespezifikoa izaten baita.

Sekuentzia horiek plasmido batean muntatu eta zeluletan transfektatu ondoren, Cas9 proteinak, crRNAren laguntzaz, sekuentzia zuzena aurkitzen du zelula-ostalariaren DNAn eta, Cas9 aldaeraren arabera, harizpi bakarreko edo bikoitzeko haustura bat sortzen du DNAren kokapen egokian.

DNA ostalarian behar bezala tartekatutako haustura monokatenarioek homologiak zuzendutako konponketa eragin dezakete, haustura bikatenario baten ondoren gertatzen den mutur ez-homologoen elkarketak baino akats gutxiago egiteko joera duena. DNA konpontzeko txantiloi bat emateak DNA sekuentzia espezifiko bat genomaren barruko kokapen zehatz batean txertatzea ahalbidetzen du. Konponketa-moldeak 40 eta 90 base-pare artean izan behar ditu, Cas9-k eragindako DNA hausturatik harago. Helburua da zelularen jatorrizko HDR prozesuak emandako konponketa-txantiloia erabiltzea eta, horrela, sekuentzia berria genoman txertatzea. Behin gehituta, sekuentzia berri hori zelularen material genetikoaren zati bat izango da , eta zelula-alabetara pasatzen da.

 Metodoak 

 Knock-out baten eraketa 
Gene edo eskualde genomiko baten funtzioaren ezabapena mutazioak sortzean edo sekuentzia interesgarriak mugitzean lortzen da, Cas9 edo Cas12 nukleasa eta sgRNA bat erabiliz, azken honek nukleasa ebaketa-gune zehatz baterantz gidatu duela. Ebaketaren konponketa organismoaren gaitasunaren araberakoa izango da; hala ere, konponketa-prozesuan mutazioak edo delezioak sar daitezke eta, ondorioz, funtzioa galdu eta knockout (Ko) bat sortu. Mutazio-mota horren bidez, funtzioren bat duten eskualde kodifikatzaileen eta eskualde ez-kodifikatzaileen funtzioa identifika daiteke.

 Genomak editatzea multiplex integrazioaren bidez 
Banakako ikuspegiak muga garrantzitsuak dakartza CRISPR sistemen eraginkortasunari eta aplikazio bioteknologikoei dagokienez; izan ere, askotan, eskualde genomiko ugari editatu behar dira zenbait gene aldatzeko eta sartzeko. Banakako edizio-prozesua hainbat aldiz errepikatzea ez dirudi egokiena denik; zorionez, CRISPR/Cas9 edizio genetikoaren sistemak badu abantaila bat: genomaren eskualde anitz editatzen ditu eraldaketa bakar batean, edizio genetikoko beste sistema batzuek ez bezala, Cas9 proteinarekin batera hainbat gRNA ezberdin ezarriz. Multiplex teknologia aplikatzen duten lan gehienak oinarritzen dira mutazio puntualak sortzea edo espezifikoki gene anitz desaktibatzea bilatzen duten adierazpen-bektoreen prestaketan. Hala ere, helburu batzuetarako komenigarria da multiplex konstruktua lan egin nahi den organismoaren genoman integratzea. Integrazio genomiko hori egiteko hainbat estrategia metodologiko daude, baina zientzialariek CRISPR/Cas sisteman oinarritutako edizio-sistema erabiltzea erabaki dute, ikuspegi sinpleagoa, merkeagoa, moldakorragoa eta arrakasta-tasa handiagokoa ematen duelako.

 Interferentziazko edo aktibaziozko CRISPR bidezko transkripzioaren erregulazioa 
Gaur egun, gene baten adierazpena modulatu daiteke Cas9 inaktibo bat eta sgRNA egoki bat erabiliz. Horiek, oro har, modu espezifikoan eragina dute transkripzio-elongazioko prozesuetan, RNA polimerasen loturan edo transkripzio-faktoreetan. Cas9-k nukleasa gisa funtzionatzeko duen ezintasun hori (dCas9 edo Dead Cas9) sortzen da RuvC eta HNH domeinuetan, zeintzuek DNAren kate bikoitzean mozketaren eragileak diren, gertatzen diren bi mutazio puntualen ondorioz. Horrek Cas9-k DNAn mozketak egitea galarazten du, genoman leku espezifiko batera zuzentzeko gaitasuna galdu gabe. dCas9 gene baten sustatzailera zuzentzeak RNA polimerasaren makineria fisikoki blokea dezakeela ikusi da eta, ondorioz, transkripzioa oztopatu eta ezabatu. Tresna horri CRISPR interference (CRISPRi) deritzo. Aldiz, CRISPR activation (CRISPRa) tresnak dCas9-rekin fusionatutako transkripzio aktibatzaile bat erabiltzen du, itu-genearen adierazpena handitzen duena.

 Edizio genetikoa CRISPR Nickaseren bidez 
Cas9 nukleasak nukleasa-jarduera duten bi domeinu aktibo ditu (HNH eta RuvC). HNH domeinuak itu-sekuentzia duen DNAren harizpia mozten du, hau da, sgRNArekiko osagarria izango den katea, eta RuvC domeinuak, berriz, DNAren beste harizpia. Bi domeinuetako batean mutazioak egiten direnean, Cas9-k ebakiak egiten ditu DNAren kate bakar batean; aldaera horri Cas9 nickasa (nCas9) deitzen zaio. Beraz, bi domeinuek aktibo egon behar dute DNAn kate bikoitzeko ebakiak eragiteko.

 Aplikazioak biomedikuntzan 

 Biomedikuntza 
CRISPR-Cas teknologia giza gaixotasun askotarako tratamendu gisa proposatu da, batez ere kausa genetiko bat duten gaixotasunetarako. DNA-sekuentzia espezifikoak aldatzeko duen gaitasunak bihurtzen du gaixotasuna eragiten duten mutazioak zuzentzeko ahalmena duen tresna. Animalia-ereduetan egindako aurretiazko ikerketak iradokitzen du CRISPR teknologian oinarritutako terapiek gaixotasun mota ugari tratatzeko ahalmena dutela, barne direla minbizia, progeria, beta-talasemia, anemia faltziformea, hemofilia, fibrosi kistikoa, Duchenneren distrofia muskularra, Huntingtonen gaixotasuna, amiloidosi transtinikoa eta bihotzeko gaixotasuna. Eltxoetan malaria sendatzeko ere erabili izan da CRISPR, eta horrek bektorea eta gaixotasuna desagerraraz litzake gizakiengan. CRISPRek ehun-ingeniaritzan eta birsortze-medikuntzan ere izan ditzake aplikazioak; adibidez, II. motako MHC proteinen adierazpenik ez duten giza odol-hodiak sortzeko, askotan uko egiten baitiote transplanteari.

Gainera, CRISPR-Cas9 teknologia erabiliz giza pazienteetan beta-talasemia eta anemia faltziformea sendatzeko egin diren saiakuntza klinikoek etorkizun handiko emaitzak erakutsi dituzte. 

Hala ere, oraindik ere muga batzuk daude terapia genikoan teknologiaren erabileran: efektuaren maiztasun erlatiboki altua helburutik kanpo, PAM sekuentzia baten eskakizuna itu-gunetik gertu, CRISPRek eragindako kate bikoitzeko hausturengatik p53 bitarteko apoptosia eta birusek eragindako ohiko askapen sistemaren ondoriozko toxikotasun immunogenikoa.

 Minbizia 
CRISPRek aplikazio asko aurkitu ditu zeluletan oinarritutako immunoterapien garapenean ere. CRISPR bidezko lehen entsegu klinikoa 2016an hasi zen. Hartan biriketako minbizia zuten pertsonen immunitate-zelulak hartu ziren, CRISPR erabiliz adierazitako PD-1 genea editatzeko, eta, ondoren, alteratutako zelulak berriro pertsona berari emateko. Beste 20 entsegu bidean edo ia prest zeuden, batez ere Txinan, 2017tik aurrera.

2020ko azaroan, animalia-eredu gisa sagua erabiliz, CRISPR modu eraginkorrean erabili zen glioblastoma (hazkunde azkarreko garuneko tumorea) eta obulutegi metastasikoko minbizia tratatzeko; izan ere, bi minbizi horiek kasuen pronostiko okerrenetakoak dituzte, eta normalean ondorengo etapetan diagnostikatzen dira. Tratamendu horien bidez, tumorearen hazkundea inhibitu egin da, obulutegi metastasikoko minbiziaren eta tumore-zelulen apoptosiaren biziraupena % 80an handitu da, tumorearen hazkundea % 50ean inhibitu da eta glioblastomaren biziraupena % 30ean hobetu da.

2022ko abenduan, Great Ormond Street Ospitaleko medikuek 13 urteko neskato britainiar bat sendatu zuten, T zelulen leuzemia linfoblastiko akutua diagnostikatu ziotenean. Gene terapeutikoak editatzeko lehen erabilera dokumentatua izan zen, eta sei hilabetez tratamendu esperimental bat egin ondoren, porrot egin zuten beste tratamendu batzuen aurreko saiakerek. Prozedura izan zen T zelula osasuntsu bat birprogramatzea, minbizidun T zelulak suntsitzeko, lehenengo leuzemiatik libratzeko, eta, ondoren, bere sistema immunologikoa zerotik berreraikitzeko zelula immune osasuntsuak erabiliz. Taldeak BASE edizioa erabili zuen, eta aurretik leuzemia linfoblastiko akutuko kasu bat tratatu zuen 2015ean, TALENak erabiliz.

 Diabetesa 
1. motako diabetesa nahasmendu endokrinoa da, eta intsulina sortzeko beta zelula pankreatikorik ez izatearen ondorio da. Intsulina ezinbesteko konposatua da odolean dagoen azukrea zeluletara garraiatzean energia sortzeko. Beta zelula osasuntsuak transplantatzeko ahaleginetan aritu dira ikertzaileak. Zelulak editatzeko erabiltzen da CRISPR, pazientearen gorputzak transplantea errefusatzeko aukera murrizteko.

2021eko azaroaren 17an, CRISPR terapeutikak eta Cyte agentziak iragarri zuten Kanadako agentzia medikoak VCTX210-erako saiakuntza kliniko bat egiteko eskaera onartu zuela. Zelula amen terapia bat da VCTX210, CRISPR erakundeak editatua eta 1.motako diabetesa tratatzeko diseinatua. Esanguratsua izan zen hori, kliniketara heldu zen gene-edizioan oinarritutako diabetesarentzako lehen terapia izan zelako. Konpainia horiek 1. motako diabetesa tratatzeko tratamendu berri bat ere garatu zuten, intsulina ekoiztea lortu zuena CRIPSR teknikaren bitartez genetikoki editatutako zelula ametatik eratorritako milioika zelula pankreatiko erabiltzen dituen inplante mediko txiki baten bidez.

2022ko otsailean, 1. faseko saiakuntza bat egin zen, eta paziente boluntario batek tratamendua jaso zuen.

 IHESa 
Giza immunoeskasiaren birusa edo GIBa gorputzeko immunitate-sistemari erasotzen dion birusa da. Badira tratamendu eraginkorrak pazienteei bizitza osasuntsua izatea ahalbidetu diezaieketenak, baina GIBa atzeraeraginezkoa da, eta horrek esan nahi du bere buruaren bertsio ez-aktibo bat txertatzen duela giza genoman. CRISPR erabil daiteke birusa genomatik selektiboki ezabatzeko, GIBaren atzeraeraginezko genomari zuzendutako RNA gidaren diseinuaren bidez. Ikuspegi horrek duen arazoetako bat da GIBaren genoma ia zelula guztietatik kendu behar dela, eta hori lortzea zaila izan daiteke modu errealistan.

GIBaren tratamenduan eta sendaketan hasierako emaitzak nahiko arrakastatsuak izan dira. 2021ean, antirretrobiralen eta CRISPR/Cas-9-aren konbinazioarekin tratatutako 23 sagu humanizatuetatik 9 sagutan birusa detektaezina bihurtzea lortu zuten, baita ohiko errebote-aldiaren ondoren ere. Bi tratamenduetako batek ere ez zuen ondorio hori izan isolaturik. 2022an hasi ziren gizakietan CRISPR-Cas9 terapian oinarritutako EBT-101 entsegu klinikoak. 2023ko urrian, ETB-101-eko 3 pertsonatan egindako hasierako faseko ikerketa batek iragarri zuen tratamenduak segurua zirudiela eta ez zuela albo-ondorio garrantzitsurik, baina ez zen haren eraginkortasunari buruzko daturik eman.

 Erreferentziak 

 Kanpo estekak 

Kategoria:Bioteknologia
Kategoria:Ingeniaritza genetikoa