Kaspaasid

Kaspaasid (ingl k caspases, lühend sõnadest cysteine-dependent aspartate-directed proteases) on ensüümide perekond, mis osaleb rakusurma ja põletikuliste protsesside reguleerimises.

Tegemist on tsüsteiinproteaasidega, mis kasutavad Cys-jäägi nukleofiilset tioolrühma katalüüsifunktsiooni täitmiseks ning hüdrolüüsivad sihtvalkudes peptiidsidet alati substraatvalkude koostisse kuuluva Asp-jäägi C-terminaalselt poolt.
vasakul|pisi|CARD-domeenide vaheliste vastastikmõjude toimel tekkiv sõrmusekujuline ruumiline struktuur, mis aitab kaasa kaspaaside oligomeriseerumisele. Eri molekulide koosseisu kuuluvad domeenid on tähistatud eri värvidega.

 Ehitus ja aktivatsioon 
Kaspaasid sünteesitakse rakkudes mitteaktiivsete eelvormidena ehk zümogeenidena (prokaspaasidena), mille molekulmass jääb vahemikku 32–57 kDa. Tüüpiline zümogeen koosneb kolmest eri funktsionaalsusega osast:

 N-terminaalne prodomeen – ei esine kõigis kaspaasides, kuid võimaldab vajadusel kaspaasi iseaktiveerumist ning sisaldab lisaks teisi funktsionaalseid üksusi, mis on vajalikud vastastikmõjude moodustamiseks teiste valkudega (näiteks nn CARD-domeen, ingliskeelsest caspase activation and recruitment domain või DED-domeeni, ingliskeelsest death effector domain);
 suur katalüütiline alaühik (ligi 17–20 kDa; molekulmassi põhjal tähistatakse seda alaühikut näiteks p20, kus p tuleneb sõnast proteiin), mis sisaldab katalüüsi jaoks vajalikke Cys- ja His-jääki;
 väike alaühik (ligi 10–12 kDa; molekulmassist tulenevalt tähistatakse seda alaühikut näiteks p10).

Suurt ja väikest alaühikut ühendab lühike aminohappeline järjestus (nn linker), mida saab omakorda proteolüütiliselt lagundada. Zümogeenid on mitteaktiivsed, kuna nende aktiivtsentri konformatsioon ei ole piisavalt stabiilne. Aktivatsioon toimub kahe või enama zümogeenimolekuli vastavalt di- või oligomeerumise ja järgneva proteolüütilise lõikamise teel; seejuures võivad oligomeere omavahel moodustada ka erinevad kaspaasid.

 Evolutsiooniline konserveeritus 
pisi|Programmeeritud rakusurma ehk apoptoosi käigus tekib prokaspaasist-9 (või selle struktuursetest homoloogidest nagu äädikakärbse Dronc) ja teistest valkudest kvaternaarne struktuur, mida nimetatakse apoptosoomiks. Inimese apoptosoomi ruumiline struktuur on seni prognoositud vaid lihtsamate mudelite tasemel, kuid on olemas kristallstruktuur ja ka krüoelektronmikroskoopia (krüo-EM) abiga saadud ruumiline struktuur äädikakärbse apoptosoomist (Dark). Krüo-EM struktuuri koordinaadid: PDB 3J9K.
Kaspaasid on evolutsiooniliselt väga säilunud ning sarnase struktuuri ja toimemehhanismiga proteaasid esinevad praktiliselt kõigis hulkraksetes loomades. Näiteks on varbussi CED-3 ja äädikakärbse Dronc ning DrICE funktsionaalselt sarnased imetajate kaspaasidega. Kõigis neis ensüümides on säilinud tsüsteiin-aspartaatne aktiivtsenter ning kahest alaühikust (p20/p10) koosnev struktuur.

Kaspaaside olemasolu kõigis loomades viitab, et apoptoosi mehhanism on loomariigi evolutsioonis kujunenud väga varakult ning jäänud enamasti muutumatuks. Teaduskirjanduses on välja pakutud, et kaspaaside apoptootiline funktsioon on arenenud sünkroonis vajadusega rakkude diferentseerumise järele organismide arengus, kuivõrd kaspaasid mängivad olulist rolli ka diferentseerumises. Hiljem on kaspaasidele lisandunud muud funktsioonid nagu osalemine põletikulistes protsessides (kuna kaspaaside vahendatud proteolüütilise lõikamise tulemusena vabastatakse tsütokiinid IL-1β ja IL-18) ja koespetsiifilised rollid (nt CASP14, mis kaitseb epidermise rakke vedelikupuuduse ja UV-kiirguse eest).

Kaspaasidega mõnevõrra sarnasteks funktsioonide poolest peetakse ka metakaspaase – seda ensüümide rühma leidub seentes, taimedes, protistides ja bakterites (ehk organismides, kus tavalisi kaspaase ei esine). Metakaspaasid on samuti tsüsteiinproteaasid, kuid need lõhustavad peptiidsidemeid hoopis Arg-jäägi või Lys-jäägi (mitte Asp-jäägi) järel. Kuigi hiljuti on näidatud, et metakaspaaside ja kaspaaside rollid eri organismides mõnevõrra kattuvad, on teadusrühmi, kes kritiseerivad metakaspaaside ja kaspaaside kui ensüümirühmade nimetuste sarnasusi. Seejuures juhitakse tähelepanu asjaolule, et apoptoos on omane vaid loomadele ning kaspaaside keskne ülesanne on siiski apoptoosi vahendamine.

Allpool artiklis käsitletakse konkreetsemalt inimese kaspaase.

 Inimese kaspaasid 
Inimese genoomis on kodeeritud kaksteistkümne funktsionaalse kaspaasi (CASP1-CASP10, CASP12 ja CASP14) järjestused. Need ensüümid jagunevad ehituse ja funktsiooni alusel kolme suuremasse rühma:

 Algatajakaspaasid (ingl k initiator caspases): CASP2, CASP8, CASP9, CASP10. Iseloomulikuks struktuurseks tunnuseks on pikk N-terminaalne prodomeen, mis sisaldab CARD-domeeni või DED-domeeni (vt eespool). Need domeenid võimaldavad kaspaasidel seonduda adaptervalkudega ja omandada aktiivsust suuremate signaalikomplekside kontekstis nagu apoptosoom (rakusisese raja kaudu indutseeritud apoptoosi korral) või DISC (rakuvälise raja kaudu indutseeritud apoptoosi korral). Algatajakaspaasid aktiveerivad efektorkaspaase.
 Efektorkaspaasid (ingl k executioner caspases): CASP3, CASP6, CASP7. Eksisteerivad inaktiivsete zümogeenidena (prokaspaasidena), mille aktiveerivad algatajakaspaasid. Seejärel viivad efektorkaspaasid läbi apoptoosi lõppfaase, lõhustades proteolüütiliselt kümneid rakusiseseid substraate (vt allpool).
 Põletikulised kaspaasid (ingl k inflammatory caspases): CASP1, CASP4, CASP5, CASP12. Osalevad põletikuliste tsütokiinide (nt interleukiin-1β ja IL-18) aktiveerimises ja püroptoosis (apoptoosist oluliselt rohkem põletikku vallandav rakusurma viis, mille käigus toimub rakumembraani lõhkemine ja molekulide vabanemine rakkudevahelisse alasse).

Rühmaväliseks liigitatakse CASP14, mis tegutseb peamiselt epidermise keratiniseerumise protsessides ega ole seotud apoptoosiga.

 Ensümaatiline aktiivsus ja substraadid 
pisi|Peptiidsideme hüdrolüüs kestaks ilma ensümaatilise katalüüsita hinnanguliselt mitusada aastat.
Kaspaasid on tsüsteiiniproteaasid, mille aktiivtsentris paikneb tsüsteiini- ja histidiinijäägist koosnev katalüütiline tandem (näiteks kaspaas-1 puhul on tegemist aminohappejääkidega His237 ja Cys285 – seda nummerdust kasutatakse allpool ka katalüüsimehhanismi kirjeldamisel). Kaspaasid hüdrolüüsivad subtraatvalgu polüpeptiidahelat alati pärast aspartaadijääki. Kaspaasi sidumistasku asetab lõigatava peptiidsideme (ingl k scissile bond) katalüütiliste aminohappejääkide lähedusse. Gly238 ja Cys285 peptiidahela amiidid annavad vesiniksidemeid lõigatava peptiidsideme karbonüülrühma hapnikuga. Selle tulemusel muutub karbonüülrühma süsinik elektrofiilseks ja vastuvõtlikuks nukleofiilse rünnaku suhtes, mida sooritab läheduses paiknev katalüütilise Cys285 tioolrühm. Enne nukleofiilset rünnakut või selle käigus annab Cys285 tioolrühm oma prootoni His237 külgahela imidasoolile, mille protoneeritud vorm toimib katalüüsi lõppetapis happena, protoneerides lõigatavale peptiidsidemele järgneva aminohappe α-amino­rühma.

Kui lagundatava peptiidsideme suhtes N-terminaali pool paiknevad olevad aminohappejäägid tähistada P1, P2 jms (kus number suureneb lagundatavast peptiidsidemest kaugenedes), siis määravad substraadi äratundmist kaspaaside poolt substraadis aminohappejäägid asendites P4-P1 (ning P1 on alati Asp). Efektorkaspaasid (eriti kaspaas-3 ja kaspaas-7) eelistavad substraatide koosseisus tetrapeptiidi Asp-Glu-Val-Asp (ühetäheliste lühenditena DEVD), mille puhul toimub lõikus pärast viimast aspartaati. DEVD järjestuse põhjal on disainitud ka mitmed teaduslikes uuringutes kasutatavad fluorestseeruvad kaspaasi-sensorid, mis konkureerivad rakkudes substraatidega ja käituvad seega inhibiitoritena. Seejuures võivad sensorid olla sünteetilised, sisaldades väikese molekulmassiga fluorofoore (selliste ühendite seas on ka pöördumatuid inhibiitoreid), või geneetiliselt kodeeritud, sisaldades fluorestseeruvaid valke.

Kuigi DEVD on enim uuritud motiiv kaspaaside substraatides, teostavad kaspaasid organismis sadade erinevate valkude proteolüüsi, mille hulka kuuluvad struktuursed valgud (nt tuumaümbrise lamiinid, tsütoskeleti aktiinid), DNA parandusega seotud valgud ja mitokondriaalsed valgud. Selle substraadikogumi kooskõlastatud lagundamine annab apoptootilisele rakule iseloomuliku morfoloogia.

 Kaspaaside roll apoptoosis ja teistes rakusurma vormides 
pisi|Kaspaas-3 aktiivse vormi immuunvärvingu kaudu saab fluorestsentsmikroskoopia abiga tuvastada apoptootilisi rakke koelõigu või muu süsteemi kontekstis. Joonisel on näidatud kuseteede arenguga seotud apoptootilised piirkonnad (pildid E-H, kaspaasi-3 immuunvärving näidatud punasega) ja intensiivse rakujagunemisega piirkonnad (pildid A-D, fosforüülitud histooni H3 immuunvärving näidatud punasega) hiire embrüo neerudes. Roheline värv näitab tsütokeratiinirikkaid rakke ja sinine värv kõigi rakkude rakutuumi (DAPI värving).
Kaspaasid on keskse tähtsusega programmeeritud rakusurma (apoptoosi) läbiviimisel, kuid neil on roll ka põletikulises rakusurmas (püroptoosis) ja mitmetes teistes rakusurma vormides:

 Apoptoos on rangelt kontrollitud rakusurma vorm, mida iseloomustavad raku kokkutõmbumine, kromatiini kondenseerumine, membraani väljasopistumine (ingl k blebbing) ja apoptootiliste kehade teke. Apoptoos käivitatakse põhiliselt kahe raja kaudu. Rakuväline ehk retseptorvahendatud rada käivitub valguliste signaalimolekulide (näiteks kasvaja nekroosifaktor TNF-alfa) seondumisel surmaretseptoritele (nt kasvaja nekroosifaktori retseptorite perekond TNFR). Info rakuvälise sündmuse kohta kandub retseptorite konformatsiooni muutumise kaudu rakku ning toimub DISC-kompleksi teke, mille tulemusena aktiveeruvad kaspaas-8 ja kaspaas-10 ning seejärel efektorkaspaasid. Rakusisese ehk mitokondriaalse raja käivitajateks on DNA kahjustus või oksüdatiivne stress, mis vallandavad tsütokroomi c vabanemist mitokondritest. Vabanenud tsütokroom c moodustab koos teiste valkudega apoptosoomi, mis aktiveerib kaspaasi-9 ning seejärel efektorkaspaasid.
 Püroptoos on põletikuline, lüütiline rakusurm, mida vahendavad peamiselt kaspaas-1, kaspaas-4 ja kaspaas-5. Enamasti käivitub püroptoos vastusena patogeenidele (nt viirustele).
 PANoptoos on hübriidne rakusurma vorm, kus aktiveeruvad samaaegselt apoptootilised, nekroptootilised ja püroptoossed mehhanismid.

 Kaspaaside seos haigustega 
Kaspaaside aktivatsioon on rangelt reguleeritud, et vältida juhuslikku rakusurma. Olulisemad regulatsioonitasandid on:

 Geeniekspressioon – prokaspaaside transkriptsiooni kontroll (näiteks epigeneetilisel tasandil, DNA metüülimise või histoonide metüülimise kaudu).
 Aktiveerivad signaalirajad – Bcl-2 perekonna valgud (kontrollivad mitokondrite membraani läbilaskvust), pseudokaspaas FLIP ja surmaretseptorid.
 Looduslikud inhibiitorid – inhibeerimine IAP-valkude (ingliskeelsest inhibitor of apoptosis proteins) poolt.
 Translatsioonijärgsed modifikatsioonid – fosforüülimine ja ubikvitinüülimine võivad muuta kaspaaside aktiivsust.

pisi|Apoptoosi retseptorvahendatud raja (joonise vasak osa, ingl k extrinsic pathway) ja mitokondriaalse raja (joonise parem osa, ingl k intrinsic pathway) molekulaarsed mehhanismid. Pildi ülemine osa illustreerib tsütotoksilises T-rakus (ingl k cytotoxic T-cell) toimuvat ning pildi alumine osa viirusega nakatunud koerakus (ingl k virus-infected cell) toimuvat.
Siiski esineb patoloogiate kontekstis häireid kaspaaside taseme või aktiivsusega, kusjuures kaspaaside roll haiguslike protsesside vahendamisel oleneb ka konkreetsest kaspaasist, vaadeldavast koest või kaspaasidega vastastikmõjusid loovate muude valkude eskpressioonitasemest rakus.

 Kaspaasid ja vähk 
Apoptoosi vältimine on vähi üks peamisi tunnuseid. Paljud kasvajarakud ekspresseerivad vähenenud tasemel kaspaase või nende aktivatsioonikomponente (nt APAF1, ingliskeelsest apoptotic protease activating factor 1). See muudab vähirakud resistentseks signaalidele, mis kutsuvad tervetes rakkudes esile rakusurma; seega käsitletakse kaspaase sageli pigem kasvaja supressorgeenidena. Samas on hiljutised uuringud näidanud, et teatud kaspaaside aktivatsioon võib olla seotud pigem rakkude kuju muutumise ja liikuvuse tagamisega (nt epiteel-mesenhüüm-ülemineku käigus), mis pigem aitavad kaasa vähirakkude levimisele.

 Kaspaasid ja neurodegeneratiivsed haigused 
Kaspaaside ülemäärane aktivatsioon, eriti kaspaas-6 ja kaspaas-3 puhul, on seotud Alzheimeri, Parkinsoni ja Huntingtoni tõve patogeneesiga. Näiteks on kaspaasid võimelised osaliselt lagundama beeta-amüloidi eelvalku ABPP, tau-valku või huntingtiini, soodustades toksiliste laguproduktide kuhjumist. Rakusurma-välises kontekstis võib aga kaspaaside kontrollitud aktivatsioon mängida rolli närvisüsteemi plastilisuses (neuronite diferentseerumisel ja sünapside ümberkujundamisel).

 Kaspaasid ja maksahaigused 
Maksal on suur regeneratiivne võime, kuid krooniline või ulatuslik maksarakkude apoptoos võib viia põletiku, fibroosi ja lõpuks tsirroosi või elundipuudulikkuseni. Maksa peamiste funktsionaalsete rakkude ehk hepatotsüütide apoptoosi vahendavad suuresti kaspaas-8 (surmaretseptori rada) ja kaspaas-9 (mitokondriaalne rada), mis koonduvad efektorkaspaasidele, eeskätt kaspaasile-3 ja kaspaasile-7.
pisi|Inhibiitori emricasani struktuur
Viirusliku B-hepatiidi puhul toimub nekroosifaktori TNFα tootmise suurenemine. Hepatotsüüdid, mis puutuvad kokku TNFα-ga, läbivad seega surmaretseptori vahendatud apoptoosi. Alkohol ja mõningad ravimid (nt paratsetamool) muudavad hepatotsüüdid nendele surmasignaalidele tundlikumaks. Mittealkohoolse steatohepatiidi ja rasvmaksa kontekstis põhjustab vabade rasvhapete kuhjumisest tingitud lipotoksiline stress mitokondrite funktsioonide häirumist ja rakusisestest radadest käivitatud apoptoosi. Samuti tekib rakusisestest radadest käivitatud apoptoos isheemia-reperfusioonikahjustuse korral (nt siirdamise või kirurgilise sekkumise järel), kuna reperfusioon põhjustab pärast ajutist isheemiat oksüdatiivset stressi ja mitokondriaalset kahjustust. Kui maksas paiknevad Kupfferi rakud ja stellaatrakud fagotsüteerivad surevatest hepatotsüütidest pärinevaid apoptootilisi kehi, aktiveeruvad fibrogeneetilised signaalirajad (nt TGF-β). Seega ei ole apoptoos pelgalt haiguse tagajärg, vaid ka maksafibroosi progresseerumise põhjuslik tegur, mis võimendab kahjustusi näiteks tsirroosi korral.

Kaspaaside aktiivsuse pärssimine nendes olukordades vähendab hepatotsüütide kadu ja parandab näiteks ka siiratud maksa ellujäämist loomkatsetes. Seepärast arendatakse kaspaasi inhibiitoreid, mis blokeeriksid kaspaaside vahendatud apoptoosi. Siiski kaasnevad selle strateegiaga teatud riskid:

 Apoptoos võib olla ka kaitsev mehhanism, mis eemaldab kahjustatud või viirusega nakatunud rakke, mistõttu selle krooniline pärssimine võib soodustada kasvaja teket või viirusnakkuse püsimist.
 Pikaajaline süsteemne kaspaaside blokeerimine võib nõrgendada immuunvastust või häirida normaalset raku uuenemist.
 Lisaks on osa maksas toimivatest apoptoosi radadest seotud nekroptoosiga – seetõttu võib kaspaaside pärssimine nihutada rakusurma tasakaalu nekrootiliste (põletikuliste) mehhanismide suunas.
pisi|Inhibiitori belnacasani struktuur

 Kaspaaside inhibiitorid ja nende kasutusalad 
Kaspaaside inhibiitorid on olulised nii eksperimentaalsete töövahenditena rakusurma fundamentaalteaduslikes uuringutes kui ka ravimikandidaatidena haigustes, millega kaasneb liigne apoptoos või põletik.
pisi|Kaspaasi-3 kompleks sünteetilise inhibiitoriga, milles on püütud vähendada peptiidset osa ning suurendada molekuli hüdrofoobsust, jäikust ja selektiivsust. Kristallstruktuuri koordinaadid: Protein Databank 1RHJ.
Kaspaaside aktiivtsentriga seonduvad peptiidipõhised inhibiitorid on siiani kõige laialdasemalt kasutatavad kaspaaside inhibiitorid laboratoorsetes alusuuringutes. Need jäljendavad kaspaaside looduslikke substraate: aminohapete tunnusjärjestusele (nt aspartaati sisaldavad tetrapeptiidid DEVD, LEHD, VEID) järgneb sageli elektrofiilne reaktiivne rühm, mis kovalentselt modifitseerib aktiivtsentri tsüsteiini (seega on tegemist pöördumatute inhibiitoritega). Levinumad elektrofiilsed rühmad on fluorometüülketoon (tähistatakse sageli FMK), klorometüülketoon (CMK) ja atsüüloksümetüülketoon (AOMK); viimane rühm on näidanud suurimat selektiivsust just kaspaaside tsüsteiini suhtes (kuna tsüsteiinproteaase on teisigi). Peptiidipõhiste inhibiitorite N-terminaal on sageli modifitseeritud (nt bensüüloksükarbonüüli või kinoliini fragmendiga), mis lisatava fragmendi hüdrofoobsuse tõttu võib parandada ühendite võimet läbida rakkude plasmamembraani. Seda tüüpi inhibiitorid ei erista samas erinevaid kaspaase ning inhibeerivad kõiki perekonnaliikmeid – seetõttu nimetatakse neid ka pan-inhibiitoriteks. Näiteks Q-VD-OPh on pöördumatu peptiidipõhine kaspaaside pan-inhibiitor, mida on kasutatud madalate mikromolaarsete kontsentratsioonide juures loommudelites.

Ületamaks peptiidipõhiste inhibiitorite problemaatilist võimet läbida rakumembraani, vähest selektiivsust kõrgetel kontsentratsioonidel ja madalat bioloogilist stabiilsust, on kaspaaside inhibiitorite kliinilisteks rakendusteks püütud lühendada molekulides aminohappelisi järjestusi ning asendada aminohapped analoogsete struktuuridega, mis on füsioloogilises keskkonnas püsivamad. Näiteks laia toimespektriga kaspaasiinhibiitor emricasan on läbinud II faasi kliinilise uuringu maksahaiguste (mittealkohoolne steatohepatiit, C-hepatiit, maksafibroos) raviks. Belnacasan on aga eelravim, mille metaboliseeritud vorm on selektiivne kaspaasi-1 ja kaspaasi-4 inhibiitor; ühend on läbinud II faasi kliinilised uuringud epilepsia, psoriaasi ja teiste põletikuliste haiguste raviks.

Kaspaaside inhibiitoritena on testitud ka mittepeptiidseid aineid, millest mõningad seonduvad ensüümide aktiivtsentriga ja mõningad hoopis aladesse, mida kaspaas võiks kasutada vastastikmõjude moodustamiseks teiste kaspaasidega (nn allosteerilised inhibiitorid). Siiski ei ole 2025. aasta novembri seisuga ükski kaspaasiinhibiitor saanud ravimina heakskiitu.

 Vaata ka 
 Apoptoosi indutseeriv faktor

 Viited 

Kategooria:Ensüümid