ATAC-seq

ATAC-seq (ingl Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) on molekulaarbioloogia meetod, mis tuvastab kromatiini ülegenoomset ligipääsetavust. Meetodit kirjeldati esmakordselt aastal 2013. Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ (2013). “Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position”. Nature Methods. 10 (12): 1213–8. doi:10.1038/nmeth.2688 

Eesmärk
Kromatiin on DNA ja sellega seonduvate valkude kompleks. DNA pakkimine kromatiiniks on vajalik, et see rakutuuma ära mahuks. Kromatiin võib olla avatud (eukromatiin) või suletud (heterokromatiin) seisus. Heterokromatiinis on DNA tihedalt pakitud, mistõttu on see inaktiivne. Eukromatiinis on aga DNA lõdvemalt pakitud - see on ligipääsetav erinevatele transkriptsioonifaktorile (TF), mis saavad läbi viia transkriptsiooni.

ATAC-seqi meetod on mõeldud transkriptsiooniliselt aktiivse ehk avatud kromatiini tuvastamiseks. Selleks kasutatakse muteeritud Tn5 transposaasi, mis üheaegselt nii fragmenteerib kui ka märgistab vastavad piirkonnad adapteritega. Tavalistel transposaasidel on loomult madal aktiivsus, ATAC-seqis kasutatakse muteeritud hüperaktiivset Tn5 varianti. Reznikoff WS (2008). “Transposon Tn5”. Annu Rev Genet. 42:269-86. doi:10.1146/annurev.genet.42.110807.091656  ATAC-seqi puhul ei ole vaja sonikeerimise ega ka fenool-kloroformi eraldamise etappi (nagu Faire-seqis) Simon JM, Giresi PG, Davis IJ, Lieb JD (2012). “Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA”. Nature Protocols. 7 (2): 256–67. doi:10.1038/nprot.2011.444 , kasutada antikehasid (nagu ChIP-seqis) Savic D, Partridge EC, Newberry KM, Smith SB, Meadows SK, Roberts BS, et al. (2015). “CETCh-seq: CRISPR epitope tagging ChIP-seq of DNA-binding proteins”. Genome Research. 25 (10): 1581–9. doi:10.1101/gr.193540.115  või viia läbi sensitiivset ensümaatilist seedimist (nagu Mnase-seqis ja Dnase-seqis). Hoeijmakers WA, Bártfai R (2018). “Characterization of the Nucleosome Landscape by Micrococcal Nuclease-Sequencing (MNase-seq)”. Chromatin Immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. Vol. 1689. pp. 83–101. doi:10.1007/978-1-4939-7380-4_8  Samuti piisab ATAC-seqi katse jaoks ainult 50 000 rakust (ChIP-seqi puhul on vaja vähemalt 1 miljon rakku). Kokkuvõttes saab ATAC-seqi ettevalmistused valmis vähem kui kolme tunniga Buenrostro JD, Wu B, Litzenburger UM, Ruff D, Gonzales ML, Snyder MP, et al. (2015). “Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation”. Nature. 523 (7561): 486–90. Bibcode:2015Natur.523..486B. doi:10.1038/nature14590 , mis teeb antud meetodist kiirema ja odavama alternatiivi, võrreldes varasematega.

Meetodi kirjeldus
ATAC-seqi katsele eelnevalt on vaja huvipakkuvad rakud eraldada ja loendada. Rakkude loendamine on kriitilise tähtsusega samm, sest sellest oleneb muuhulgas transpositsiooni efektiivsus. Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. (2015). “ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide”. Curr Protoc Mol Biol. 109:21.29.1-21.29.9. doi:10.1002/0471142727.mb2129s109  Kuigi ATAC-seqi saab teha minimaalselt 500 rakuga, siis kõige optimaalsem rakkude arv on 50 000. Grandi FC, Modi H, Kampman L jt (2022). “Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq”. Nat Protoc 17, 1518–1552. doi:10.1038/s41596-022-00692-9  Seejärel rakud lüüsitakse ning eraldatakse tuumad. Puhastatud kromatiin fragmenteeritakse ja märgistatakse adapteritega, kasutades Tn5 transposaasi. Järgneb puhastusetapp, pärast mida kromatiini fragmendid amplifitseeritakse polümeraasi ahelreaktsiooni (ingl PCR - polymerase chain reaction) abil ning kasutades triipkoodidega praimereid. Saadud raamatukogu analüüsitakse reaalaja PCRi (qPCR) või järgmise põlvkonna sekveneerimise meetoditega (ingl NGS - next generation sequencing).

Andmeanalüüs
ATAC-seqi andmete analüüsiks on loodud mitmeid erinevaid töövooge, mille ühisteks etappideks on joondamise-eelne kvaliteedikontroll, adapterite eemaldamine, järjestuste joondamine referentsgenoomile, PCR duplikaatide ja mitokondriaalsete järjestuste eemaldamine ning piikide (avatud alade) tuvastamine. Sellele järgnevad spetsiifilisemad analüüsid nagu erinevus kromatiini ligipääsetavuses kudedes/rakutüüpides, TF motiivide rikastusanalüüs või  integreerimine RNA-seqi või ChIP-seqi andmetega. Yan F, Powell DR, Curtis DJ jt (2020). “From reads to insight: a hitchhiker’s guide to ATAC-seq data analysis”. Genome Biol 21, 22. doi:10.1186/s13059-020-1929-3 

Rakendused
ATAC-seqi on kasutatud, et defineerida kromatiini ülegenoomset ligipääsetavust erinevates vähitüüpides. Corces MR, Granja JM, Shams S jt (2018). “The chromatin accessibility landscape of primary human cancers”. Science. 26;362(6413):eaav1898. doi:10.1126/science.aav1898  Samuti on leitud, et kollatähni kärbumise puhul langeb üleüldine kromatiini ligipääsetavus. Wang J, Zibetti C, Shang P jt (2018). “ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatin accessibility in age-related macular degeneration”. Nat Commun. 10;9(1):1364. doi:10.1038/s41467-018-03856-y  ATAC-seq on näidanud, et kromatiini olek on vererakkude diferentseerumise ajal väga dünaamiline Lara-Astiaso D, Weiner A, Lorenzo-Vivas E jt (2014). “Chromatin state dynamics during blood formation”. Science. 345(6199):943-9. doi:10.1126/science.1256271  ning aidanud kaardistada transkriptsioonifaktorite seondumissaite. Li Z, Schulz MH, Look T, Begemann M, Zenke M, Costa IG (2019). “Identification of transcription factor binding sites using ATAC-seq”. Genome Biol. 20(1):45. doi:10.1186/s13059-019-1642-2 

Üksikraku ATAC-seq
Originaalprotokolli mugavdamise teel arendati välja üksikraku ATAC-seq. Üksikute rakutuumade eraldamiseks kasutatakse mikrovedelikundust (ingl microfluidics), mistõttu saab ATAC-seqi reaktsioone läbi viia individuaalselt. Üksikud rakud saadakse, kas mikrovedelik-seadmete või tilga-põhiste meetodite (ingl droplet-based methods) abil. Mezger A, Klemm S, Mann I, Brower K, Mir A, Bostick M jt (2018). “High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution”. Nature Communications. 9 (1): 3647. doi:10.1038/s41467-018-05887-x  Alternatiivselt saab kasutada ka kombinatoorset indekseerimist (ingl combinatorial cellular indexing), mis ei vaja üksikute rakkude eraldamist. Selle meetodi käigus märgistatakse rakud kordumatute triipkoodidega ning igas järgnevas voorus lisatakse uus triipkood, luues sellega iga raku jaoks ainulaadsed triipkoodide kombinatsioonid. Cusanovich DA, Daza R, Adey A jt (2015). “Multiplex single cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing”. Science. 348 (6237): 910–914. doi:10.1126/science.aab1601  Kombinatoorne indekseerimine võimaldab genereerida ühe eksperimendi raames 10 000 kuni 100 000 raku epigeneetilise profiili. Lareau CA, Duarte, FM, Chew JG jt (2019). “Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility”. Nat Biotechnol 37, 916–924. doi:10.1038/s41587-019-0147-6  Eelneva meetodi puuduseks on aga see, et see nõuab suures koguses eritellimusel valmistatud modifitseeritud Tn5 transposaasi. Chen X, Miragaia RJ, Natarajan KN, Teichmann SA (2018). “A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling”. Nature Communications. 9 (1): 5345. doi:10.1038/s41467-018-07771-0  Uuema sci-CAR meetodiga (ingl single-cell combinatorial indexing chromatin accessibility and mRNA) saab samaaegselt analüüsida nii üksikute rakkude transkriptoomi kui ka epigenoomi. Cao J, Cusanovich DA., Ramani V jt (2018). “Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells”. Science. 361 (6409): 1380–1385. doi:10.1126/science.aau0730 

Puudused
Kuigi ATAC-seq annab hea ülevaate epigeneetilisest maastikust, ei ole võimalik sellega kindlaks määrata täpset toimemehhanismi (näiteks millised kromatiini modifikatsioonid või transkriptsioonifaktorid huvipakkuvas regioonis esinevad). Tulemuste täpsemaks tõlgendamiseks saab ATAC-seqi korreleerida teiste meetoditega. Lisaks, originaalne ATAC-seqi protokoll on mõeldud rakkude hulgianalüüsiks, mis näitab kromatiini keskmist ligipääsetavust ühe proovi kohta. See aga eeldab, et ühes proovis olevate rakkude omavaheline varieeruvus on väike. Heterogeensuse tabamiseks saab kasutada näiteks üksikraku ATAC-seqi.

Vaata ka
 RNA-seq
 ChIP-seq
 DNase-seq
 Mnase-seq
 Faire-seq

Viited

Kategooria:Molekulaarbioloogia