Silmusvahendatud isotermiline amplifikatsioon

Silmusvahendatud isotermiline amplifikatsioon (LAMP – loop-mediated isothermal amplification) on ühe toruga meetod DNA amplifitseerimiseks ja odav alternatiiv teatavate haiguste avastamiseks. Pöördtranskriptsiooniga silmusvahendatud isotermiline amplifikatsioon (RT-LAMP) ühendab LAMPi ja pöördtranskriptsiooni, et võimaldada RNA avastamist.

LAMP on isotermiline nukleiinhappe amplifikatsioonimeetod. Erinevalt polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) tehnoloogiast, mille puhul reaktsioon viiakse läbi mitme vahelduvate temperatuurietapi või -tsükli abil, toimub isotermiline amplifikatsioon konstantsel temperatuuril ja selleks ei ole vaja termotsüklerit.

 Tehnika 

LAMPi puhul amplifitseeritakse sihtjärjestust konstantsel temperatuuril 60–65 °C (140–149 °F), kasutades kas kahte või kolme praimerikomplekti ja polümeraasi, millel on lisaks replikatsiooniaktiivsusele ka kõrge ahelate nihutamise aktiivsus. Tavaliselt kasutatakse 4 erinevat praimerit, et amplifitseerida 6 erinevat piirkonda sihtgeenil, mis suurendab spetsiifilisust. Täiendav paar loop primereid võib reaktsiooni veelgi kiirendada. LAMP-meetodil toodetud DNA kogus on tunduvalt suurem kui PCR-põhisel amplifikatsioonil.


Amplifikatsiooniprodukti saab tuvastada fotomeetria abil, mõõtes hägusust, mida põhjustab magneesiumpürofosfaadi sadestumine lahuses amplifikatsiooni kõrvalproduktina. See võimaldab lihtsat visualiseerimist palja silmaga või lihtsate fotomeetriliste avastamismeetodite abil väikeste mahtude puhul. Reaktsiooni saab jälgida reaalajas kas hägususe mõõtmise või fluorestsentsi abil, kasutades interkalatsioonivärve, näiteks SYTO 9. Värvaineid, nagu SYBR green, saab kasutada nähtava värvimuutuse tekitamiseks, mida saab näha palja silmaga ilma kallite seadmeteta, või reaktsiooni jaoks, mida saab mõõta täpsemalt mõõteriistadega. Värvainemolekulid interkaleerivad või märgistavad otseselt DNA-d ja neid saab omakorda korreleerida algselt esinevate koopiate arvuga. Seega võib LAMP olla ka kvantitatiivne.

LAMP-DNA amplifikatsiooni tuvastamine on võimalik toru sees, kasutades mangaaniga laetud kaltseini, mis hakkab fluorestseeruma mangaani kompleksistumisel pürofosfaadiga in vitro DNA-sünteesi ajal.

Teine meetod LAMP-amplikoonide visuaalseks avastamiseks palja silmaga põhineb nende võimel hübridiseeruda komplementaarse kuldse seotud ss-DNAga ja seega vältida tavalist punase värvi muutumist lillakas-siniseks, mis muidu toimuks kuldosakeste soolast tingitud agregatsiooni ajal. Seega võib LAMP-meetodil koos amplikoonide avastamisega AuNP abil olla eeliseid teiste meetodite ees, kuna see vähendab analüüsi aega, kinnitab amplikooni hübriidistamise teel ja kasutab lihtsamaid seadmeid (st ei ole vaja termotsüklerit, elektroforeesiseadmeid ega UV-transvalgustit).

 Kasutamine ja eelised 

LAMP on suhteliselt uus DNA amplifikatsioonitehnika, mis oma lihtsuse, vastupidavuse ja madalate kulude tõttu võib pakkuda suuri eeliseid. LAMP-meetodit on võimalik kasutada lihtsa sõeltestina kohapeal või kliinikutes. Kuna LAMP on isotermiline, mis kaotab vajaduse kallite termotsüklerite järele, mida kasutatakse tavapärase PCR-i puhul, võib see olla eriti kasulik meetod nakkushaiguste diagnoosimiseks madala ja keskmise sissetulekuga riikides. LAMPi uuritakse laialdaselt selliste nakkushaiguste avastamiseks nagu filarioos, Zika viirus, tuberkuloos, malaaria, unehaigus ja SARS-CoV-2. Arengupiirkondades ei ole seda veel laialdaselt valideeritud teiste levinud haigustekitajate puhul.

On täheldatud, et LAMP on keerukates proovides, näiteks veres, vähem tundlik (resistentsem) kui PCR inhibiitorite suhtes, mis on tõenäoliselt tingitud teistsuguse DNA-polümeraasi kasutamisest (tavaliselt Bst – Bacillus stearothermophilus – DNA-polümeraas, mitte Taq-polümeraas nagu PCR-is). Mitmed aruanded kirjeldavad patogeenide edukat avastamist minimaalselt töödeldud proovidest, näiteks kuumtöödeldud verest, või kliiniliste proovimaatriksite olemasolul. See LAMPi omadus võib olla kasulik vähese ressursiga või välitingimustes, kus tavapärane DNA või RNA ekstraheerimine enne diagnostilist testimist võib olla ebapraktiline.

 Piirangud 

LAMP on vähem mitmekülgne kui PCR, mis on tuntuim nukleiinhappe amplifikatsioonimeetod. LAMP on kasulik eelkõige diagnostika- või avastamismeetodina, kuid ei ole kasulik kloonimiseks ega paljude muude molekulaarbioloogiliste rakenduste jaoks, mida võimaldab PCR. Kuna LAMP kasutab 4 (või 6) praimerit, mis on suunatud 6 (või 8) piirkonnale üsna väikeses genoomi segmendis, ja kuna praimerite disainimisel on mitmeid piiranguid, on raske LAMPi jaoks praimerite komplekte "silmaga" disainida. LAMP-primerite kavandamisel kasutatakse üldiselt tasuta, avatud lähtekoodiga või kaubanduslikke tarkvarapakette, kuigi primerite kavandamise piirangud tähendavad, et sihtkoha valikul on vähem vabadust kui PCR-i puhul.

Diagnoosirakenduses tuleb seda tasakaalustada vajadusega valida sobiv sihtmärk (nt konserveeritud koht väga muutlikus viiruse genoomis või sihtmärk, mis on spetsiifiline konkreetsele patogeeni tüvele). Sama liigi erinevate tüvevariantide katmiseks võib olla vaja mitut degenereeritud järjestust. Sellise praimerite kokteili kasutamise tagajärjeks võib olla mittespetsiifiline amplifikatsioon hilisamplikatsioonil.

LAMPi puhul on multipleksimise meetodid vähem arenenud kui PCR-i puhul. Suurem praimerite arv ühe sihtmärgi kohta LAMP-i puhul suurendab praimerite ja praimerite koostoimete tõenäosust multipleksitud sihtmärgikomplektide puhul. LAMPi toode on sihtpiirkonna kontsentreeride seeria, mis tekitab geelil iseloomuliku "redeli" või riba mustri, mitte ühe riba nagu PCR-i puhul. Kuigi see ei ole probleemiks, kui LAMPiga tuvastatakse üksikuid sihtmärke, ei ole LAMPi puhul võimalik kasutada "traditsioonilisi" (lõpp-punkti) mitmekordseid PCR-rakendusi, mille puhul sihtmärgi identiteeti kinnitatakse geeli ribade suuruse järgi. LAMPi multipleksimine on saavutatud, valides sihtpiirkonna koos restriktsioonikohaga ja tehes enne geelil töötamist digestiivi, nii et iga toode annab erineva suurusega fragmendi, kuigi see lähenemisviis muudab katse ülesehituse ja protokolli keerulisemaks.

LAMPis kasutatakse ahelat asendavat DNA-polümeraasi, mis välistab ka hüdrolüüsisondide, nt TaqMan-sondide kasutamise, mis tuginevad Taq-polümeraasi 5'-3'-eksonukleaasi aktiivsusele. On teatatud alternatiivsest reaalajas multipleksimise lähenemisviisist, mis põhineb fluorestsentskvaatoritel.

LAMPi reaalajas vaatlemiseks võib lisada SYBR-rohelist värvainet. Siiski võib hilises amplifikatsioonis praimer-dimeeride amplifikatsioon aidata kaasa valepositiivse signaali tekkimisele. Anorgaanilise pürofosfataasi kasutamine SYBR-reaktsioonisegus võimaldab kasutada sulatamisanalüüsi, et eristada õiget amplifikatsiooni 

Ehkki selle meetodil põhinevate analüüside valepositiivsete tulemuste puhul on välja pakutud erinevaid leevendusstrateegiaid, on mitmest tegurist, sealhulgas temperatuuri väravamehhanismide puudumisest tingitud mittespetsiifiline amplifikatsioon üks peamisi silmusvahendatud isotermilise amplifikatsiooni piiranguid.

Vaata ka
desoksüribonukleiinhape
DNA-viirused
laboratoorne diagnostika
mitokondriaalne DNA
rakutuum
reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon
RNA
RNA-viirused
tsütoplasma
tuumake
tuumapoor
vähkkasvajad
northern blotting
southern blotting
western blotting

Viited

Kategooria:Geneetika