Tseesiumkloriidi tasakaaluline tihedusgradient-tsentrifuugimine

Tseesiumkloriidi tasakaaluline tihedusgradient-tsentrifuugimine on molekulaarbioloogias laialdaselt levinud meetod, mille abil eraldatakse nukleiinhappeid olenevalt nende liikumiskiirusest tseesiumkloriidi (edaspidi CsCl) gradiendis. 

Nukleiinhapped liiguvad gradiendis vastava punktini, kust nende ujuvtihedus on võrdne gradiendi vastava punkti tihedusega ja jäävad sellele tasemele, moodustades ühtse tsooni. Meetodi võtsid 1957. aastal kasutusele Matthew Meselson ja Franklin Stahl. Meselson, M., Stahl, F. F., & Vinograd, J. (1957). EQUILIBRIUM SEDIMENTATION OF MACROMOLECULES IN DENSITY GRADIENTS. Proc Natl Acad Sci, 43, 581–588.

 Ultratsentrifuugimine 
Esimesed kiiresti pöörlevad tsentrifuugid võeti kasutusele juba 19. sajandi lõpus. Sel ajal jäi tsentrifuugide pöörete kiirus (ingl rounds per minute, lühend rpm) siiski suhteliselt madalaks, sest probleeme valmistas rootori ja rootorivarre sünkroonis liikumine.Koehler, C. S. (2003). Developing the centrifuge. Today's chemist at work, 63–66. Kui sünkroonsus hakkas kaduma, siis muutus rootori liikumine rootorivarrel ebastabiilseks, mis tõi kaasa rootori värisemise. Sellise ebastabiilsuse tõttu ei saadud teha tööd suurtel kiirustel, sest liigne rootori värisemine teeks tsentrifuugi katki. Seetõttu ei saadud uurida makromolekule, kuna polnud piisavalt head tehnikat. Probleemi lahendas Theodor H. E. Svedberg, kes lõi esimese tõelise ultratsentrifuugi. Svedbergi tsentrifuugil oli paindumatu rootorivars, mis suutis madalal rõhul pöörelda kuni 42 000 pööret minutis. See kiirus oli juba piisavalt suur, et saaks uurida makromolekule ja nende sadestumist. Svedberg avastas ka esimesena ribosoomide subühikud. Jessie Beam arendas välja ilma rootorivarreta ultratsentrifuugi, mille rootoreid ajas ringi õhk. Sellise rootori ainus takistus oligi rootori enda võimsus. Tsentrifuugi hoiab ülekuumenemise ja rootori välja lendamise eest vaakum, mis tekitab madala rõhu (< 20 mikronit).

 CsCl gradiendiga makromolekulide sadestamine 
pisi|Lahuse tsentrifuugimisel DNA koondumine tasakaalulisse punkti
Ultratsentrifuugimise abil sai 1920. aastatel eristada erineva suuruse ja kaaluga osakesi. Meetodi suur puudus oli see, et paljud makromolekulid on sarnase suuruse ja kaaluga, kuid erineva tihedusega. Selliste makromolekulide (valgud, nukleiinhapped) eraldamiseks polnud ainult sukroosilahuses tsentrifuugimine piisavalt tundlik. 1951. aastal avaldas Myron K. Brakke meetodi, millega eraldada valke.Brakke, M. K. (1951). Density Gradient Centrifugation: A New Separation Technique. Journal of the American Chemical Society, 73, 1847–1848.

1957. aastal tulid M. Meselson ja Franklin W. Stahl välja meetodiga, mis suutis nukleiinhappeid eristada nende tiheduse järgi. CsCl lahuse kasutamise eelis oli suur tundlikkus. Meetodiga oli võimalik eristada ka DNA-sid, mille tiheduse erinevus on väiksem kui 0,001 g/cm³. Stahli meetodi erisus seisnes selles, et CsCl soolalahus on suhteliselt raske, sest tseesium on raske metall, samas ei interakteeru CaCl DNA-ga ega muuda ka selle keemilisi või füüsikalisi omadusi. Ultratsentrifuugis lükatakse tseesiumi osakesi rootori südamikust kaugemale, nii muutub osakeste tihedus rootori südamikust kaugemale minnes suuremaks ja lahuse tihedus kasvab , seejuures ei teki tuubi seinale tseesiumi sadet, sest tseesium lahustub alati tagasi lahusesse. Nukleiinhapped on suured molekulid ja lükatakse tsentrifugaaljõudude mõjul lahuses rootori südamikust eemale. Kui tsentrifugaaljõud tasakaalustuvad lahuse tihedusgradiendi poolt tekitatud vastupidiste jõududega, jäävad nukleiinhapped tasakaalustunud punkti. Sellise tasakaalupunkti saavutamine nõuab tsentrifuugimist suurtel pööretel ja mitukümmend tundi. Kui lahuses on mitu erinevat DNA-d, moodustavad need kõik erinevad tasandid, mis on nähtavad pikalainelises ultraviolettkiirguses, mille lainepikkus on 385 nanomeetrit. Suletud viaalist võetakse proovid välja kas viaali põhja tehtud augu kaudu või tõmmatakse soovitud kohast välja süstlaga. Tihti lisatakse ka spetsiifilisi ultraviolettvalguses helendavaid DNA-ahelasse interkaleeruvaid värve, näiteks etiidiumbromiidi.

 Meetodi kasutus molekulaarbioloogias 
CsCl tihedusgradient-tsentrifuugimise abil tõestasid Meselson ja Stahl, et DNA replitseerub semikonservatiivselt. Nad kasvatasid kolibakterit Escherichia coli söötmel, millel oli radioaktiivne lämmastik N15 (raskem kui tavaline lämmastik N14) ja võtsid proove erinevatel generatsiooniaja punktidel.Meselson, M., & Stahl, F. W. (1958). The replication of DNA in Escherichia coli. PROC. N. A. S., 44, 671–682. Analüüsides tulemusi CsCl gradiendil tsentrifuugimisega, jõudsid nad järeldusele, et DNA pärandub semikonservatiivselt, sest gradiendis tekkis kaks selgelt eristunud kihti, mis oli tingitud ühe ahela suuremast tihedusest.

pisi|Erinevate N-isotoopidega DNA-d on erineva tihedusega. Joonisel näidatud DNA-de koondumine erinevatesse tasakaalulistesse punktidesse
CsCl tihedusgradient-tsentrifuugimist saab kasutada ka mitokondriaalse DNA (edaspidi mtDNA) eraldamiseks totaalsest DNA-st (kromosomaalne DNA koos mitokondriaalse DNA-ga).Welter, C., Meese, E., & Blin, N. (1988). Rapid step-gradient purification of mitochondrial DNA. Molecular Biology Reports, 13, 117–120. 

Meetod on kasutusel ka tänapäeval, kui on vaja eraldada 100% puhas mtDNA. CsCl lahuses moodustub 24–48 tunni järel tsentrifuugimisel kiirusel 40 000 – 50 000 pööret minutis kaks selgelt eristunud kihti, millest ülemine kiht on mtDNA. Meetodiga on võimalik uurida ka pärmide kääbusmutante, sest katse modifitseerimisega ja etiidiumbromiidi lisamisega tekib CsCl lahusesse kolmas kiht, mis on mtDNA all, sest terve hingamisahelaga mtDNA on konkatemeer, kuid kääbusmutantides on DNA rõngakujuline.Babykin, M. M., & Zinchenko, V. V. (1984). Rapid Separation of DNAs by Buoyant Density in Three-Layer CsCl Gradients. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 137, 175–181. See on seotud kääbusmutantide eripäraga, kus rakke mutageeniga modifitseerides moodustub uus mtDNA, kus teatud osa mtDNAst (umbes 1% kogu mtDNA-st) moodustab rekombinatsiooni teel tavapärase konkatemeerse mtDNA asemel rõngakujulise mtDNA.Blanc, H., & Dujon, B. (1980). Replicator regions of the yeast mitochondrial DNA responsible for suppressiveness. Proc. Nati. Acad. Sci., 77, 3942–3946,.

1980. aastatel oli CaCl tihedusgradient-tsentrifuugimine peamine meetod, kuidas eraldati plamiide, mis olid puhtad muust DNA ja RNA saastusest.Ganger, S. J., Griffith, O. M., & Grill, L. K. (1983). RAPID PURIFICATION OF PLASMID DNA BY A SINGLE CENTRIFUGATION IN A TWO-STEP CESIUM CHLORIDE-ETHIDIUM BROMIDE GRADIENT. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 117, 835–842. Selliseid plasmiide kasutati genoomide kaardistamiseks.

Tänapäevani kasutatakse CsCl tihedusgradient-tsentrifuugimist sageli viroloogias, kus terveid viiruse partikleid puhastatakse CsCl gradiendil, et saada 100% puhas viirusekultuur.Bachrach, U., & Friedmann, A. (1971). Practical procedures for the purification of bacterial viruses. Appl Microbiol, 22, 706–715. Viroloogias on seda meetodit arendatud nii kaugele, et suudetakse puhastada viirusi suspensioonist ka tavapärase tsentrifuugimisega, kuigi selle puhul pole saagis nii kõrge.Nasukawa, T., Uchiyama, J., Taharaguchi, S., Ota, S., Ujihara, T., Matsuzaki, S., . . . Sakaguchi, M. (2017). Virus purification by CsCl density gradient using general centrifugation. Arch Virol, 162, 3523–3528.

 Viited 

kategooria:Tsentrifuugimine