Isotermiline tiitrimis-kalorimeetria

Isotermiline tiitrimis-kalorimeetria (isothermal titration calorimetry, ITC) on meetod molekulaarsete komplekside tekkimise ja lagunemise käigus neelduva või eralduva soojuse mõõtmiseks. Uuritavad valdkonnad on näiteks valk-valk interaktsioonid, valk-membraan interaktsioonid, ensüümikineetika ja molekulaardünaamiliste simulatsioonide tulemuste eksperimentaalne kinnitamine.

Termodünaamika

Molekulidevahelist termodünaamikat iseloomustavad parameetrid on stöhhiomeetria (), assotsiatsioonikonstant (), vabaenergia (), entalpia () ja entroopia (). Need parameetrid on omavahel seotud:
. ITC abil on võimalik neid parameetreid mõõta.

Rakendusalad

Ravimikandidaatide hindamine
Isotermilise tiitrimis-kalorimeetria mõõtmistulemusi saab kasutada ravimikandidaatide võrdlemiseks. Väärtus  iseloomustab küll ravimi- ja valguvahelist afiinsust, ent erineb sarnaste ravimikandidaatide seast parima leidmiseks sageli liiga vähe. Seetõttu on molekulide võrdlemisel oluline arvesse võtta nii vabaenergia entalpilist kui ka entroopilist komponenti.

Valguga seonduva ravimikandidaadi entroopilise komponendi optimeerimiseks piisab sageli arendatavale ühendile hüdrofoobse osa lisamisest või põhistruktuuri jäigemaks muutmisest. Selle meetodi kasutamist piirab aga ühendi vesilahustuvuse vähenemine. Valk-ligand seondumisel sõltub parameeter  molekulide vahel tekkivate ja katkevate mittekovalentsete sidemete arvust. Seega, kui mõõdetakse soodne (negatiivsem) , viitab see tugevamale valk-ligand seosele.

Eelnevast lähtuvalt on ravim-valk interaktsiooni  komponendi mõju tõstmine keerulisem kui  mõju suurendamine. Seetõttu hinnatakse soodsama entalpiaga ühendeid paremaks. Seega saab ITC-d kasutada soodsama entalpiaga ravimikandidaadi väljaselgitamiseks.

Ensüümikineetika iseloomustamine

Traditsioonilised ensüümikineetika iseloomustamise meetodid põhinevad kromogeense, fluorogeense või raadioisotoobiga märgistatud ligandi kasutamisel. ITC selliseid piiranguid substraadile ei sea. Erinevalt kolorimeetrilistest meetoditest saab ITC-ga ensümaatilisi muundumisi jälgida ka hägustes või mitmefaasilistes reaktsioonides.

Makromolekulaarsete komplekside uurimine

Isotermilist tiitrimis-kalorimeetriat on kasutatud translatsiooni lõpetamise mehhanismi uurimiseks.

Seade
pisi|Isotermilise tiitrimis-kalorimeetria seade

ITC seade koosneb kahest ühesugusest anumast, mis on ümbritsetud isoleeriva materjaliga. Mõlemal anumal on andurid, mis reguleerivad küttekehade sisse- ja väljalülitamist nii, et temperatuur anumates oleks võrdne. Katse läbiviimiseks täidetakse proovianum uuritava aine (makromolekuli) lahusega ning võrdlusanum vee või puhverlahusega. Enne titrandi lisamist soojendatakse võrdlusanumat. See aktiveerib proovianuma tagasiside-küttekeha. Nii saadakse energiakogus ajaühiku kohta, mis kulub anumate ja lahuste temperatuuri hoidmiseks.

Molekulaarse seondumise mõõtmiseks lisatakse proovilahusele kindlate koguste (alikvootide) kaupa titranti. Selle mõjul soojus kas vabaneb või neeldub ja proovi temperatuur muutub. Eksotermilise reaktsiooni puhul vähendatakse tagasiside-küttekeha kulutatavat energiat, aga endotermilise puhul energiat suurendatakse. See soojushulk ajaühiku kohta (μcal/s) ongi ITC seadme mõõtmistulemus.

Soojuse muut proovis on võrdeline seotud titrandi osakaaluga.

Katse käik
Proovi ettevalmistamine

Ka mõõtmiseks on oluline, et uuritavate proovide kontsentratsioonid oleks väga täpselt määratud. Ka on tähtis, et proovi-lahuse kontsentratsioon valitaks nii, et proov seonduks titrandiga järk-järgult, mitte ei küllastuks uuritav aine titrandi esimese lisamisega.

Proovi- ja võrdlusanuma täitmine

Võrdlusanum peaks olema täidetud vee või naatriumasiidi 0,01% lahusega. Kui masinaga töötatakse pidevalt, peaks võrdlusanuma lahust vahetama vähemalt kord nädalas. Proovianuma täitmisel on oluline, et sinna ei satuks õhumulle.

Titrandi lisamise süstla täitmine

Titrandi lahuse kontsentratsiooni peaks valima nii, et viimase alikvoodi lisamise järel on titrandi kontsentratsioon ligikaudu 2x suurem kui uuritava molekuli kontsentratsioon.

Katse parameetrite valik

ITC seadme tarkvara abil saab muuta alikvootide arvu, lisamise kiirust ja mahtu. Reaktsiooni entalpia mõõtmiseks peaks esimeste alikvootide lisamisel kogu ligand seonduma uuritava ainega. Ka peaks alikvoote lisama pärast uuritava aine küllastumist ligandiga. Küllastumisjärgsete proovide lisamisest eraldunud või neeldunud energia näitab lahuse lahjendamise soojusefekti.

Kontrollkatsed lahjendamise soojusefektide väljaselgitamiseks

Esialgse katse tulemused võib kanda graafikule normaliseerituna: kilokalorit mooli lisatud ligandi ning ligandi ja uuritava aine molaarsuhte vahelise seosena. Saadavat isotermi mõjutab ka lahuste lahjendamisega ning lahuse segamisega kaasnev soojusefekt. Seega peab tegema järgmised kontrollkatsed:
 Titrant tiitrida puhverlahusesse ehk lahus ilma uuritava aineta.
 Puhverlahus tiitrida uuritava aine lahusesse.
Nende katsete tulemuste abil saab leida korrektse seondumise isotermi.

Andmeanalüüs
pisi|ITC katse tulemus. Pikiteljel kuluv energia, horisontaalteljel aeg

Esmalt väljendatakse saadud seondumissoojused titrandi kontsentratsiooni funktsioonina. Seejärel piikidealune ala integreeritakse kas piikhaaval ja käsitsi või tarkvara abil. Ligandita makromolekuli kontsentratsioon väheneb iga järjestikuse titrandi lisamisega kuni järjestikused piigid saavad ühekõrguseks. Need piigid (soojushulgad) tekivad lahustumisest ja muudest mehaanilistest efektidest ja sellepärast peab need lahutama kõikidest teistest piikidest. Korrektsete andmete saamiseks on tähtis valida esimeste andmepunktide põhjal õige algtase (baseline).

Pärast algtaseme ja mehaaniliste efektide suhtes korrigeerimist iseloomustab i-nda piigi alust ala ja reaktsioonis neeldunud või eraldunud soojust võrrand

kus  on lisatud lahuse ruumala ja  on markomolekuliga seotud ligandi kontsentratsiooni tõus pärast i-ndat lahuse lisamist. Reaktsiooni entalpia, seondumiskonstandi ja stöhhiomeetria arvutamiseks tuleb võrrand viia funktsionaalsele kujule, mis sõltub uuritavate ainete seondumismehhanismist.

Kõrge seondumisafiinsusega reaktsioonide uurimine

On teada, et ITC-ga reaktsiooni mõõtmiseks peab parameeter  olema väiksem kui 1000. See seab Ka-le piiri 108-109 M−1 juurde. Kõrgemate c väärtuste juures kaotab piikide jaotus iseloomuliku S-kuju.

Kõrgema Ka puhul kasutatakse asendus (displacement) ITC tehnikat, kus uuritav makromolekul on juba enne tiitrimist seotud mõne madalama afiinsusega ligandiga. Selle tehnika puhul on vajalikud kolm erinevat tiitrimist:
 tiitrimine madala afiinsusega ligandiga,
 tiitrimine kõrge afiinsusega ligandiga (seondumisentalpia määramiseks),
 asendustiitrimine.

Protoneerimise roll seondumisenergia mõõtmisel

Paljude seondumisreaktsioonide puhul seondub või vabaneb ligandilt või valgult prootoneid. Sel juhul on reaktsioon pH-sõltuv ja seondumisentalpia sõltub puhvri ionisatsioonientalpiast. Prootonite energeetilise rolli hindamiseks tuleks katsed teha erinevate ionisatsioonientalpiatega (ΔHion) puhvrites. Seondumise mõõdetud entalpia on kahe näitaja summa.

Seondumisenergia  sõltub pH-st, aga mitte puhvrist endast. 
Teine komponent on prootoni ionisatsioonienergia  ja liidetud prootonite arvu  korrutis. Kui , siis on reaktsiooni mõõtmise tulemus prootonite vahetumisest sõltuv.

Viited

Kategooria:Molekulaarbioloogia