CRISPR

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; hääldatakse "crisper") ehk klasterdatud regulaarsete vahedega lühikesed palindroomsed kordused on prokarüootide DNA-s esinevad lühikesed kordusjärjestused, mis vahelduvad sissetungivatelt viirustelt või plasmiididelt omandatud ja genoomi sisestatud mittekodeerivate DNA lõikudega.

CRISPR järjestustes asuvate viirustelt või plasmiididelt omandatud lõikude pealt transkribeeritakse sissetungiva võõr-DNA-ga komplementaarsed RNA lõigud, mille vahendusel prokarüoodi immuunsüsteem tunneb ära võõr-DNA ning lagundab selle.

CRISPR järjestused mängivad olulist rolli bakterite kaitsesüsteemis ning annab aluse genoomi editeerimise tehnoloogiale CRISPR-Cas9 süsteem, mida kasutades on võimalik erinevatesse organismidesse sisse viia püsivaid geenimodifikatsioone.

CRISPR/Cas on prokarüootide immuunsüsteemi osa, mis annab resistentsuse mitteomaste geneetiliste elementide, näiteks plasmiidide või faagide suhtes  .RNA lisab vahejärjestusi, mis aitavad Cas valkudel ära tunda ning seejärel lõigata eksogeense päritoluga DNA-d. Võõr-RNA-d suunavad lõikama Cas valgud. 

CRISPR järjestused esinevad ligikaudu 40% sekveneeritud bakterigenoomides ning 90% sekveneeritud arhede genoomides.

 Mehhanism 
CRISPR/Cas-i abil omandatud immuunsus on iseloomulik bakteritele ja arhedele. CRIPSR/Cas ennetab bakteriofaagide infektsiooni, konjugatsiooni ning transformatsiooni rakku siseneva võõr-DNA lagundamise kaudu. 

 Kordusjärjestuste omandamine 
Mikroobidesse tungivate viiruste sissetungil on prokarüoodi esmaseks immuunvastuseks võõr-DNA tabamine ja sisestamine CRISPR lookusesse speisser-järjestusena. 

Cas1 ja Cas2 valgud on levinud kõikides CRISPR/Cas immuunsüsteemides, mis näitab, et antud valgud on seotud speisserite omandamisega. Mutatsioonidel põhinevad uuringud näitavad, et Cas1 või Cas2 valgu eemaldamisel peatub speisserite omandamine ilma, et häiruks CRISPR-i immuunvastus.  

Iseloomustatud on mitmeid Cas1 valke, samuti on kokku pandud ka nende struktuur. Cas1 valkudel on mitmekesine aminohappeline järjestus, kuid kristallstruktuurilt on erinevad valgud sarnased. Kõik eraldatud Cas1 valgud on metalli-ioonist sõltuvad nukleaasid, mis seonduvad DNA-ga sõltumata selle järjestusest.   

Cas2 valgud omavad kas üksikahelalist ssRNA või kaheahelalist dsDNA endoribonukleaasset aktiivsust. 

Soolekepikese (E. coli) I-E süsteemis moodustavad Cas1 ja Cas2 valgud kompleksi, kus Cas2 valgu dimeer moodustab silla kahe Cas1 dimeeriga. Antud kompleksis täidab Cas2 mitte-ensümaatilise pakkimise rolli, seondudes kaheahelalisele võõr-DNA fragmendile. Samal ajal seondub Cas1 DNA üheahelalisele osale ning katalüüsib selle integratsiooni CRISPR kompleksi järjestusse.  

Uusi speissereid lisatakse alati CRISPR järjestuse algusse (põhijärjestuse kõvale), mille tulemusena moodustub kronoloogiline loend viirusinfektsioonidest. Integratsiooni täpsuse eest vastutab E. colis histooni sarnane valk, mida nimetatakse integreeritud peremeesfaktoriks ehk IHF (integration host factor). 

 Protospeisseri külgnevad motiivid 
Bioinformaatilised analüüsid on näidanud, et protospeisserite külgnevaid järjestusi ei valita juhuslikult, vaid sobituvad lühikeste (3–5-aluspaariliste) DNA lõikudega, mida nimetatakse protospeisseriga külgnevateks motiivideks ehk PAM-ideks. CRISPR/Cas süsteemide analüüsid näitavad, et PAM-id on olulised I ja II tüüpi, kuid mitte III tüüpi omandamissüsteemidele. I ja II tüüpi süsteemide puhul jäetakse protospeisserid välja positsioonis, kus PAM on järjestuse kõrval ning teisel pool speisserit tehakse lõige joonlauamehhanismi abil. Selle tulemusena säilitatakse konstantne speisser-järjestuse suurus CRISPR-is. PAM järjestuse konserveeritus erineb CRISPR/Cas süsteemide vahel, mis annab põhjuse oletada, et see on evolutsiooniliselt seotud Cas1 valgu ning CRISPR-i põhijärjestusega. 

PAM järjestus on oluline speisseri insertsioonil I-E süsteemides. Antud järjestus sisaldab tugevalt konserveerunud lõpp-nukleotiidi, mis on protospeisseri esimese nukleotiidi kõrval. Viimasest nukleotiidiist saab lõpliku järjestuse esimeseks otseseks korduseks. Antud nähtus viitab sellele, et speisseri omandamise süsteem toodab üheahelalisi DNA üleulatuvaid otsi kordusmotiivis. PAM-is tekivad üleulatuvad otsad teisest kuni viimase positsioonini speisseri insertsiooni tulemusena. Siiski ei ole seesugune mehhanism levinud kõikides CRISPR/Cas süsteemides, kuna PAM-id ei ole teistes organismides viimases positsioonis samaväärsel tasemel konserveerunud. Tõenäoliselt genereeritakse teistes süsteemides kordusjärjestuse lõppu ja protospeisseri omandamise käigus tömp ots.

 Insertsiooni tüübid 
Sulfolobus solfataricus'e CRISPR järjestuse analüüsi tulemusel on selgunud, et kanoonilised speisseri insertsioonid on oluliselt komplekssemad – üks kuuest CRISPR lookusest inserteerib uued speisserid juhuslikult üle kogu CRISPR järjestuse. 

Paljud CRISPR järjestused sisaldavad mitmeid speissereid, mis pärinevad ühest ja samast faagist. Mehhanism, mis on selle fenomeni taga, avastati I-E tüüpi E. coli süsteemis. Märgatavat suurenemist speisserite omandamisel täheldati kohtades, kus speisserid omasid juba eelneva sihtmärgina faagi, olenemata protospeisseri mittekattuvusest. Taoline seondumine nõuab Cas valkude olemasolu nii omandamise kui ka omavahelise suhtluse protsessides. Uued speisserid omandatakse alati sellele ahelale, kus on ühilduv speisser-järjestus. Kirjeldatud nähtus tõestatas hüpoteesi, et speisserite omastamise kompleks liigub pärast seondumist võõr-DNA-l, et leida uus protospeisseri järjestus.

 Biogenees 
CRISPR-RNA (crRNA), mis juhatab võõr-DNAga kokkupuute ajal Cas nukleaasi sihtmärgini, peab olema sünteesitud CRISPR järjestuse alusel. crRNA transkribeeritakse algselt ühe osana suurest transkriptist, mis sisaldab mitmesuguseid CRISPR-järjestusi. Cas valgud lõikavad algset transkripti ning moodustuvad crRNA-d. crRNA-de tootmise mehhanism varieerub erinevates CRISPR/Cas süsteemides.  

I-E ja I-F tüüpi süsteemides tunnevad Cas6e ja Cas6f valgud ära DNA lingud, mis on moodustunud indetsete korduste seondumise tulemusena ning mis moodustavad crRNA. Antud Cas valgud lagundavad algse transkripti paardunud regiooni otstest, mille tulemusena jääb alles üks crRNA ning väikesed lõigud paardunud kordusjärjestuste regioonist.  

III tüüpi süsteemid kasutavad ka Cas6 valku, kuigi kordusjärjestused ei tooda DNA linge. Algne transkript keeratakse ümber Cas6 valgu, millega lubatakse DNA lõikamist kordusjärjestusest ainult ülesvoolu.   

II tüüpi süsteemides puudub Cas6 valku kodeeriv geen, mistõttu kasutatakse DNA lõikamiseks RNaasIII. Funktsionaalsed tüüp II süsteemid kodeerivad eriti väikseid RNA-si ehk transaktiveerivaid crRNA-si (tracrRNA), mis on komplementaarsed kordusjärjestusele. TracrRNA transkriptsioon ja primaarne CRISPR transkript toovad endaga kaasa aluspaaride paardumise ning dsRNA moodustumise, mis on RNAasIII sihtmärgiks ning mille käigus toodetakse crRNA-si.pisi|540x540px|CRISPR immuunsuse kolm tüüpi. Cas1 ja Cas2 valgud tunnevad protospeisseite abil ära rakku tunginud võõr-DNA (1). Protospeisser ligeeritakse kordusjärjestusele, mis asuvad põhijärjestuse kõrval (2). Üheahelaline pikendamine parandab CRISPR järjestuse ja duplitseerib kordusjärjestust. crRNA protsessimise ning interferentsi staadiumites esinevad erinevused, mis jagab CRISPR süsteemid kolmeks (3). Cas geenid lõikavad esmast CRISPR transkripti, mille tulemusena saadakse crRNA-d (4). I tüüpi süsteemis lõikavad Cas6e/Cas6f valgud ssRNA ja dsRNA molekule, mis moodustavad juuksenõela struktuure. II tüüpi süsteemis kasutatakse dsRNA moodustamiseks tracrRNA-d; lõikamine toimub Cas9 ja RNaasIII abil. Tüüp III süsteemis kasutatakse Cas6 homoloogi, mis ei vaja lõikamiseks juuksenõela struktuuri olemasolu (5). II ja III tüüpi süsteemides lõigatakse molekule lisaks veel kas 5´ või 3´ otsest, mille tulemusena saadakse küps crRNA (6). Saadud crRNA-d seonduvad Cas valguga, moodustuvad interferentsi kompleksid (7). Tüüp I ja II süsteemides on valgu ja PAM järjestuse interaktsioon kriitilise tähtsusega võõr-DNA lagundamiseks. Tüüp III süsteemis pole seesugune interaktsioon vajalik (8).

Erinevalt teistest süsteemidest ei sisalda crRNA täispikkuses speisserit, vaid lühendatud otsaga speisserjärjestust. crRNA-d moodustab Cas valkudega seostudes ribonukleotiidide kompleksid, mis suudavad ära tunda võõr-DNA-d. crRNA-d ei eelista kodeerivat ega ka mittekodeerivat järjestust, mis viitab RNA-suunatud sihtmärk-DNA süsteemile. I-E tüüpi kompleksid vajavad ühe crRNA-ga seondumiseks viit Cas valku.

 Interferents 
Interferentsi staadiumis tunnevad I tüüpi süsteemides PAM järjestuse ära crRNA-ga komplementaarsed järjestused, mis on vajalikud ka crRNA-ga kokkusulamisel. I tüüpi süsteemides toimub aluspaaride seondumine crRNA-ga ja protospeisseri signaaline konformatsioonilised muutusted. Käivitatud kaskaad toob endaga kaasa Cas3 valgu ja DNA degradatsiooni.

II tüüpi süsteemides tuginetakse interferentsil vaid ühele multifunktsionaalsele Cas9 valgule. Cas9 vajab nii crRNA-d ja tracrRNA-d. DNA lõikamiseks kasutatakse kahekordseid HNH ja Ruvc/RNaasH-sarnaseid endonukleaasseid domeene. Vajalik on ka PAM-i ja faagi genoomi nukleotiidide vaheline seondumine. Antud süsteemides tuntakse PAM järjestusi ära samal ahelal, kus asub ka crRNA (mis on vastupidine ahel tüüp I süsteemides).  

Sarnaselt tüüp I süsteemidega kasutatakse ka III tüüpi süsteemides crRNA-ga seostumiseks kuut või seitset Cas valku . Tüüp III süsteeme analüüsiti bakteritel S. solfataricus ja P. furiosus ning selgus, et sihtmärkmolekuliks on faagi DNA asemel mRNA, mis teeb antud süsteemi ainulaadseks RNA genoomiga faagide tabamiseks.  

Mehhanismid, mis eristavad inteferentsi käigus organismile omast DNA-d võõr-DNA-st, on kodeeritud crRNA-des ning on seetõttu kõigis kolmes tüübis sarnased. Erinevat tüüpi protsesside jooksul sisaldavad kõik crRNA-d speisser-järjestusi ning teatud hulka kordusjärjestusi mõlemast protospeisseri otsast. Osaline kattuvus järjestuste vahel ei luba CRISPR/Cas süsteemil võtta sihtmärgiks kromosoomi nukleotiidide paardumist väljaspool speisser-järjestuse signaale, hoides sellega ära enda DNA lõikamise. 

 Viited 

Kategooria:Molekulaarbioloogia