50S

50S alaühik on prokarüootse ribosoomi suurim alaühik. Koos väikese 30S alaühikuga moodustavad prokarüootse 70S ribosoomi. Tema molekulmass on 1,5x106 Da. Suurim alaühik loob peptiidsidemeid  ja tagab tee uue peptiidi progressiooniks. Lisaks sellele seonduvad suurema alaühikuga GTP-d siduvad regulaatorvalgud, mis soodustavad niisuguseid translatsiooni protsesse nagu initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. 50S alaühik koosneb kahest rRNA molekulist (5S ja 23S) ja 33 valgust ning on märklauaks mitmetele antibiootikumidele.

pisi|H. marismortui 50S alaühiku struktuur. Valgud on märgistatud siniselt ja 2 rRNA fragmenti on näidatud kollase (5S) ja oranžina (23S).

50S alaühiku struktuur
Sarnaselt väikese alaühikuga põhineb 50S partikli struktuur ribosomaalsel RNA-l, mida stabiliseerivad ribosomaalsed valgud. 50S alaühik sarnaneb 60S ribosomaalse alaühikuga eukarüootides. Ribosomaalne RNA on väga kõrgelt struktureeritud ning mängib võtmerolli valgusünteesi katalüütilistes funktsioonides.

Ribosoomi suure alaühiku kompaktsest poolkerakujulisest tertsiaalstruktuurist eristuvad kolm väljaulatavat jätket – L1 haru, tsentraalne kühm ja L11 haru. 50S alaühiku ribosomaalseid valke nimetatakse vastavalt nende paiknemisele ribosoomi suuremas partiklis L1–35 (L ehk inglise keeles large, eesti keeles "suur"). Enamik ribosomaalseid valke on suures alaühikus esindatud ühes korduses, välja arvatud tetrameerne (L7/L12)4. 50S alaühiku tertsiaalstruktuuril paiknevad ribosomaalsed valgud suures osas hajutatult partikli solvendipoolsel küljel ja enamus neist interakteerub mitme rRNA domeeniga.

Füüsikaliste parameetrite järgi on kindlaks tehtud, et suur alaühik on ligikaudu kaks korda suurem kui väiksem 30S alaühik.
Ribosomaalne RNA
23S rRNA koosneb 2904 nukleotiidist, mis jaotatakse sekundaarstruktuuri alusel kuude domeeni. 23S rRNA sekundaarstruktuuri domeenide individuaalne ruumiline konformatsioon on väga ebaregulaarne, kuid omavahel põimudes moodustavad nad kompaktse poolkerakujulise 50S tertsiaalstruktuuri. Ribosoomi peptidüültransferaasne tsenter asub 23S V domeenis  ja on paljude antibiootikumide märklauaks.
pisi|50S alaühiku molekulaarstruktuur, pööratuna väiksema 30S alaühiku poole
5S rRNA moodustab iseseisva RNA struktuuri ning uue nomenklatuuri alusel kutsutakse teda suurema alaühiku seitsmendaks domeeniks. Suure alaühiku 5S rRNA koosneb 120-st nukleotiidist ning interakteerub 23S rRNA-ga valkude L5 ja L25 vahendusel.

50S alaühiku funktsioon
50S alaühik vahendab valkude biosünteesi ajal translokatsioonifaktorite ja aminoatsüül-tRNA-de seondumist ribosoomile ning katalüüsib peptiidsideme sünteesi. Lisaks osaleb ribosoomi suurem alaühik translokatsiooni protsessis. Peptiidsideme süntees leiab aset 50S alaühiku V domeeni peptidüültransferaasses tsentris.
Peptidüültransferaas tsenter (PTC)
PTC katalüüsib estersideme aminolüüsi. Selles reaktsioonis A-piirkonnas paikneva tRNA nukleofiilne α-aminorühm ründab P-piirkonnas paiknevat tRNA estersideme süsinikku, mis hoiab peptiidahelat tRNA kõrval. H. marismortui 50S alaühiku suure resolutsiooniga kristallstruktuurid näitasid, et PTC koosneb RNA-st ning 15 Å raadiuses PTC-st valgud puudusid. Enne kui toimub peptidüültransferaasi reaktsioon, peavad tRNA substraadid paiknema õiges positsioonis. 23S rRNA jäägid PTC kõrval hoivad omal kohal ja asetavad mõlema tRNA konserveerunud 3´ CCA otsi. P-piirkonnas paiknevad tRNA jäägid C74 ja C75 paarduvad 23S rRNA P-lingu G2251 ja G2252 jääkidega. 23S rRNA A-lingu jääk G2553 hoiab omal kohal tRNA, mis paikneb A-piirkonnas, jäägi C75 kaudu. A- ja P-piirkondades oleva tRNA 3´-terminaalne nukleotiid A76 interakteerub vastavalt nukleotiididega G2583 ja A2450.

23S rRNA konserveerunud jäägid A2451, U2506, U2585, C2452 ja A2602 asuvad A- ja P-piirkonna A76 nulkleotiidi läheduses.

Substraatide kõrvuti paiknemine ribosoomis ei taga iseenesest peptiidsideme sünteesi. Seetõttu püstitati hüpotees, et teised rRNA elemendid võiksid mõjutada PTC keemilist keskkonda. 50S alaühiku röntgenkristallograafia analüüsil oletati, et polümerisatsiooni reaktsioonis osaleb 23S rRNA konserveerunud adeniin A2451. Selle mudeli järgi on A2451 kolmas lämmastiku jääk (N3) põhiline alus-happe katalüüsis osalev rRNA positsioon, mis aitab kaasa aa-tRNA (aminoatsüleeritud-tRNA) esialgset rünnakut peptidüül-tRNA-le.

Lisaks sellele N3 stabiliseerib üleminekulist tetraeedrilist seisundit. See soosib omakorda peptiidsideme moodustamist, kuna suure energiaga intermediaadi stabiliseerimine alandab üldist aktivatsioonienergiat ensüümkatalüütilises reaktsioonis.

Antibiootikumid ja 50S alaühik
Vaatamata ribosoomi suurusele, on ribosoomil vähe antibiootikumide seondumiskohti. 50S puhul asub suurim osa antibiootikumide sidumiskohti peptidüültransferaasi tsentri läheduses. Eranditeks on ortosomütsiinid (evernimütsiin ja avilamütsiin), mis interakteeruvad 23S rRNA heeliksitega H89 ja H91 ning mõjutavad IF2 (initsiatsiooni faktor 2 – seob IF1 ning juhib fMet-tRNAifMet P piirkonda ) seondumist. Tiostreptooniga sarnased tiopeptiidid interakteeruvad 23S rRNA heeliksitega H43 ja H44 ning mõjutavad EF-G, EF-Tu ja IF2 seondumist. PTC-d sihtivad antibiootikumid inhibeerivad peptiidsidemete moodustamist, häirides aminoatsüleeritud tRNA-de otste õiget asetust PTC-s. Peptidüültransferaasi keskusele toimivate antibiootikumide seondumispiirkonnad kattuvad A-piirkonnaga, kuhu seostub ka tRNA (näiteks klooramfenikool, linkoosamiidid (klindamütsiin), puromütsiin ja sparsomütsiin) või P-piirkonnaga (blastitsidiin-S) või mõlema A- ja P- piirkonnaga (pleuromutiliinid ja streptogramiin A (SA) klassid). Makroliidide ja streptogramiin B (SB) sidumispiirkonnad asuvad PTC kõrval paiknevas 100 Å pikkuses kanalis, mille kaudu väljub kasvav peptiidahel. Suurim osa makroliididest ja SB ei inhibeeri peptiidsidemete moodustamist otseselt, vaid pigem tõkestavad need uue sünteesitava peptiidahela väljumist kanali kaudu. See põhjustab omakorda peptidüül-tRNA eemaldumist ribosoomist ja translatsiooni katkestamist.
PTC kui sihtmärk
Esimesed tõendid, kuidas peptidüültransferaasi keskust inhibeeritakse, tulid antibiootikumide ning bakteri D. radiodurans ja arhea H. marismortui 50S ribosoomi kompleksidest erinevate antibiootikumidega.

Klooramfenikool seondub PTC-ga niisuguses positsioonis, mis kattub A-piirkonnas paikneva tRNA aminoatsüül funktsionaalrühmaga (Cam1). See blokeerib aa-tRNA seondumist A-piirkonda. Erinedes eelmisest, on näiteks arhedele omase klooramfenikooli seostumispiirkond (Cam2) ribosoomi alaühiku H. marismortui 50S väljumistunnelis sügavamal ning kattub erütromütsiini seondumispiirkonnaga. Kuna klooramfenikooli seondumispiirkond arhedel asub sügavamal kui Cam1, on vaja suuremat antibiootikumi kogust, et kasvu inhibeerida. Nii klooramfenikool kui ka erütromütsiin mõjutavad otseselt 50S biogeneesi. Kuigi viimaste katseandmete järgi võib oletada, et tegemist on kaudse mõjuga. Biogeneesi inhibeerimine võib olla tingitud ribosoomivalkude mittestöhhiomeetrilisest sünteesist. A-piirkonna tasku (aa-tRNA sidumispiirkond) on ka sidumispiirkonnaks klindamütsiini , sparsomütsiini  ja linesoliidi  jaoks. Positsioonid, kuhu seostub klindamütsiin, näitavad suure ülekattumise taset A-piirkonnas oleva tRNA-ga. Sparsomütsiini seondumispiirkond  asub samuti A-piirkonnas ning see takistab peptiidsidemete sünteesi, kuid samal ajal sparsomütsiin stabiliseerib tRNA seondumist P-piirkonda. See omakorda stimuleerib tRNA likumist A-piirkonnast P-piirkonda ehk translokatsiooni.

Blastitsidiin-S stabiliseerib tRNA-d P-piirkonnas, samas selle reaktsiooni molekulaarne mehhanism erineb sparsomütsiini omast. Blastitsidiin-S seondumispiirkond kattub tRNA kanoonilise CCA järjestusega P-piirkonnas, mis stabiliseerib tRNA moondatud kujul, kus tRNA C75 on keeratud A-piirkonna poole. Deformeeritud tRNA on halb substraat peptiidsideme moodustamiseks ning eriti peptiidi vabastamisel.

Linesoliid seondub 50S A-piirkonnaga samal moel nii D. radiodurans, E. coli ja H. marismortui ribosoomidega. Vaatamata oma seondumisele A-piirkonnas, mõjutavad linesoliidid translatsiooni algatamist sellisel viisil, et häirivad initsiaator-tRNA paigutamist P-piirkonda. Kuna linesoliidi ja sparsomütsiini seondumiskohad asuvad lähestikku, sünteesiti linesoliid-sparsomütsiini ühend. Niisugune ühend mõjub efektiivsemalt kui linesoliid üksinda ja toimib linesoliidi-resistentsete tüvede vastu. Linesoliid ei stimuleeri translokatsiooni, kuid linesoliid-sparsomütsiini ühend võib seda teha.

Kanal kui sihtmärk
Makroliidide seondumiskoht asub peptiidahela väljumistunnelis, mis paikneb PTC kõrval. Makroliidid koosnevad erineva suurusega makrolaktoonsest rõngast, mille külge kinnituvad erinevad suhkrud ja/või teised kõrvalahelad. Näiteks erütromütsiin koosneb 14-lülilisest laktoonrõngast, mille C3 kõrvalahelas on kladinoos ja C5 kõrvalahelas desosamiin. Makroliididele resistentsuse levikuga tekkis vajadus töötada välja uued antibiootikumid – ketoliidid. Telitromütsiinil on C3-ketorühm kladinoosi asemel ja asendis C11–12 tsükliline karbamaat, millel on alküül-arüül kõrvalahel.

Makroliidid C3-kladinoos suhkruga võimaldavad ribosoomil sünteesida lühikesi 6–8 aminohappelisi polüpeptiide. Ketoliidid lubavad sünteesida 9–10 aminohappelisi polüpeptiide enne kui toimub peptidüül-tRNA eemaldamine ning translatsioon peatub. Mõnede oligopeptiidide translatsioon põhjustab makroliidide dissotsieerumist ribosoomist, tagades sellega resistentsuse antibiootikumi suhtes.

Ribosoomi väljumistunnel on samuti mõjutatud streptogramiini poolt. Streptogramiinid koosnevad kahest klassist – SA ja SB, mis mõjutavad ribosoomi sünergeetiliselt ning sellega alandavad minimaalset inhibeerivat kontsentratsiooni mõlema komponendi vastu. Streptogramiinide kristallstruktuurid 50S alaühikutes näitavad, et nende sidumispiirkonnad asuvad kõrvuti ja väljumistunneli lähedal. SB seovad makroliidide taolist piirkonda, kuid SA seob PTC A- ja B-piirkondades. SB sidumiseks on alguses vaja 23S rRNA A2062 nukleotiidi konformatsioonilist muutust, mida viib läbi SA.

Viited

Kategooria:Ribosoom