RluD

RluD (nimi inglise keelest: Ribosomal large subunit pseudouridine synthase D, endine nimi Yfil) on pseudouridiini (Ψ ehk psii) süntaas. Tegu on ribosoomi suure subühiku ensüümiga, mis sünteesib uridiinist pseudouridiini ehk C5-glükosiid isomeeri 23S rRNA positsioonides 1911, 1915 ja 1917. RluD märklaud asub 23S rRNA domeeni IV väikeses „juuksenõelas“, mis on väga konserveerunud piirkond. See piirkond seostub 16S rRNAga ja on vajalik kodeerimises. RluD märklauad on raku normaalseks kasvuks vajalikud RNA modifikatsioonid. RluD geeni katkestamine viib kasvu aeglustumiseni. Pseudouridiini süntaaside perekondasid on 5 (RsuA, RluA, TruB, TruA, TruD). RluD kuulub perekonda RluA. 

Tähtsus
Pseudouridiinid on enim levinud RNA posttranskriptsioonilised modifikatsioonid looduses. Pseudouridiinid sünteesitakse isomerisatsiooni reaktsiooniga uridiinist, samas kasutamata selleks lisaenergiat ega -faktoreid. Isomerisatsioonireaktsiooni viivad läbi pseudouridiini süntaasid, mis muudavad oluliselt substraadiks oleva nukleotiidi omadusi, lisamata sellele ühtegi keemilist rühma. Pseudouridiinid positsioonides 1911, 1915 ja 1917 on tähtsad 50S subühiku assambleerimisel ja selle seondumisel 30S subühikuga. Asuvad 23S rRNA heeliks 69-l (H69), mis moodustab heeliks 44'ga silla B2a, mis omakorda mängib tähtsat rolli kahe ribosomaalse subühiku ühendamisel ja ribosoomi stabiliseerimisel. 
RluD on vajalik ribosoomi normaalsekstalitluseks ja assambleerimiseks ning on ühtlasi ka ainus pseudouridiini süntaas, mis on vajalik Escherichia coli normaalseks kasvuks. Bakterirakkudes vastutab ensüüm nii isomerisatsioonireaktsiooni katalüüsimise kui ka õige uridiini valmimise eest. Escherichia coli RluD kuulub konserveerunud pseudouridiini süntaaside perekonda nimega RluA. 

Struktuur
RluD on monomeerne ensüüm ja koosneb N-terminaalsest S4-sarnasest domeenist, mis ühendub painduva linkeriga katalüütilise C-domeeni külge. RluD katalüütiline domeen on 2Å suurune, koosneb 250 aminohappe jäägist ja 261 veemolekulist. S4-sarnane domeen on RNAd siduv. Ilma S4-sarnase domeenita on RluD in vitro võimeline modifitseerima ka positsiooni U2457, mis tavaliselt modifitseeritakse RluE poolt. Katalüütiline aspartaadijääk (Asp 139) asub domeeni tekitatud lõhes RluD tsentris. Molekul koosneb üheksast beetaahelast ja viiest alfaheeliksist. Üheksa beetaahelat koostavad keerdunud beetalehe, mis kulgeb läbi molekuli ning koosneb kahest antiparalleelsest lehest (β1-β2-β3 ja β11-β10-β4-β9-β8-β5). β8 ühendub β9-ga vesiniksideme kaudu ja moodustab aktiivsaidi (lõhe) tagumise seina. Ensüümi molekulaarne kaal on 36,023 kD. 

Seondumine
RluD seondumine rRNA-ga on kaheetapiline. S4-sarnane osa määrab ära selle piirkonna, kus asuvad modifitseeritavad nukleotiidid, ja katalüütiline osa määrab lõplikult spetsiifilisuse. Nukleotiid 1916 on vajalik RluD katalüütilise domeeni lõplikuks seostumiseks. RluD S4-sarnase domeeni seostumissait muutub ensüümi jaoks kättesaadavaks pärast ribosoomi 50S subühiku täielikku assambleerumist. See seletab, miks RluD sünteesitud pseudouridiinid tekivad ribosoomi valmimise hilises etapis (in vivo) ning miks pikendatud inkubatsioon ja ensüümi üleliig vähendab RluD spetsiifilisust 23S rRNA-l. Kõik RluD pseudouridiinid tehakse rRNA-sse üheaegselt ja ilma kindla järjekorrata. RluD on väga spetsiifiline positsioonidele 1911, 1915, 1917 in vivo, aga kaotab osa oma spetsiifilisusest in vitro. In vitro madalal Mg2+ kontsentratsioonil isomeriseerib rohkem uridiine. Siiski pole pärast in vitro töötlemist RluD tekitatud pseudouridiine tRNAs, mis viitab sellele, et spetsiifilisus ei kao täielikult. 

Mehhanism
C1’-N1 glükosüülside katkestatakse kataüütilise aspartaadijäägi poolt. Ensüümiga seotud uratsiilalus keeratakse 180º üle C6-N3 telje ning sünteesitakse uus C1’-C5 glükosüülside. Ensüüm eraldub pärast isomerisatsioonireaktsiooni. Bakterirakus pole isomerisatsioonireaktsiooniks energiat ega kofaktoreid vaja.
pisi|Pseudouridiini teke

RluD uuringute tulemused
 RluD isomeriseerib uridiini in vivo ainult positsioonides 1911, 1915, 1917 ja seda olenemata uridiinide olemasolust 23S rRNA heeliks 69 teistes positsioonides. Varem arvati, et RluD tunneb ära vaid H69 struktuuri ja isomeriseerib ebaspetsiifiliselt kõiki seal leiduvaid uridiine.
 Ühe uridiini vahetamine tsütosiiniga ei oma mingit efekti teiste konversioonil (ehk pseudouridiinide tekkimine positsioonides 1911, 1915 ja 1917 on üksteisest täiesti sõltumatud). Kõik RluD poolt sünteesitud pseudouridiinid ilmuvad RNA ahelasse samaaegselt, mis viitab sellele, et erinevate pseudouridiinide süntees on üksteisest sõltumatu. RluD isomeriseerib oma substraadid järjest, ühe seondumise jooksul, või siis isomeriseerib iga seondumisega ühe uridiini. Mõlemal juhul isomeriseerib RluD uridiine suvalises järjekorras.
 Positsioon 1916 on ainus, kus mutatsioonid mõjutavad RluD-spetsiifilist pseudouridiini tekkimist. Mõjutab RluD spetsiifilisust oma substraatide suhtes. 
 RluD on spetsiifiline vaid positsioonide 1911, 1915 ja 1917 suhtes kui rRNA on ribosoomide koosseisus, kuid kaotab olulisel määral oma spetsiifilisusest, kui rRNA ei ole r-valkudega seotud. 

RluD geeni katkestus
rluD geeni katkestus viib fenotüübi muutuseni, mis on põhjustatud defektsest ribosoomi assambleerimisest, biogeneesist ja funktsioonist. Tekib 70S ribosoomide defitsiit, kasvab 50S ja 30S subühikute sisaldus ning tekivad uued 62S ja 39S osakesed. 39S osakesed osutusid ebaküpseteks 50S subühikuteks, 62S osakesed tulenesid ebastabiilsete 70S subühikute lagunemisest. Leiti, et 70S mutandid on valgusünteesis vähem võimekad kui metsiktüüp. Mutantsed kolooniad osutusid mõõtmetelt väiksemaks ning generatsiooniaeg pikenes 28 minutilt 173 minutile. Mutatsioon A1916G on ainus teada olev H69’s, mis põhjustab 50S subühiku defektse assambleerimise. Seevastu muteerunud positsiooni 1916 tekitatud assambleerumise efekt ei ole tekitatud pseudouridiinide vähesusest H69-s, kuna mutatsioon A1916U omab pseudouridiini tekkele tugevamat efekti kui mutatsioon A1916G, aga ei avalda üldse mõju 50S subühiku assambleerimisele. 

Pseudouridiini süntaaside võrdlus
Pseudouridiini süntaasid katalüüsivad kohtspetsiifilise uridiinijäägi isomerisatsiooni ja kasutavad spetsiifilisuse tagamiseks nii järjestust kui ka struktuuri informatsiooni. Tegu on posttranskriptsioonilise modifikatsiooniga. Kristallograafilised analüüsid näitavad, et kõik pseudouridiini süntaasid (perekonnad RsuA, RluA, TruB, TruA, TruD) omavad sarnast aktiivsaidi struktuuri, nende südamik on sarnaselt kokku volditud ning südamik on perifeersete domeenide ja giid-RNAde poolt modifitseeritud. Kõik sisaldavad katalüütilist aspartaadijääki, mis on ainus absoluutselt konserveerunud struktuurielement nendes perekondades. Katalüütilise aspartaadijäägi mutatsioon inaktiveerib sünteesi täielikult. On pakutud kaks alternatiivset katalüütilist isomerisatsioonireaktsiooni. Katalüütiline aspartaat atakeerib sihtmärk uridiini C6 lämmastikalust või C1’ suhkuralust. E. coli rRNA pseudouridiini süntaasid sisaldavad kõik konserveerunud RLD motiivi katalüütilises saidis. RluC ja RluD katalüüsivad kolme pseudouridiini teket, teised perekonnad vaid ühe. Kuigi RluC ja RluD substraadiks on rohkem kui üks uridiin, on ensüümid endiselt spetsiifilised 23S rRNAle. RluA-l on kaks erinevat substraat-RNAd. RluA modifitseerib 23S rRNAs U746 ning tRNAs U32.  

Viited

Kategooria:Ensüümid