Β-galaktosidaas

β-galaktosidaas ehk beetagalaktosidaas on hüdrolaasne ensüüm, mis katalüüsib glükosiidse sideme hüdrolüütilisi lagunemisreaktsioone. β-galaktosidaasil on elusorganismides kaks olulist funktsiooni: ta katalüüsib laktoosi lõhustumist monosahhariidideks (glükoos ja galaktoos) ning tekitab positiivse tagasisideahela, mille kaudu reguleeritakse selle ensüümi tootmist rakus.

 Ajalugu 
β-galaktosidaasi mainis esimest korda kirjanduses hollandi botaanik Martinus Willem Beijerinick aastal 1889.

Soolekepikesest (Escherichia coli) võetud β-galaktosidaasi aminohapete järjestus määrati kindlaks aastal 1970 ning selle struktuur määrati esimest korda aastal 1994.

β-galaktosidaas on läbi aegade olnud väga tähtsal kohal molekulaarbioloogias. Ta oli tähtsal kohal Jacobi ja Monodi operoni mudeli loomisel 1961. aastal. Operoni mudel selgitab, kuidas toimub soolekepikese rakkudes laktoosi kasutamist määravate geenide regulatsioon.

 Omadused 
Rakus on β-galaktosidaasi ülesandeks katalüüsida laktoosi hüdrolüüsi, mida kasutatakse energia saamiseks.
β-galaktosidaasil on kolm ensümaatilist aktiivset tsentrit.

Esimeses aktiivtsenteris toimub laktoosi molekulis galaktoosi ja glükoosi ühendava kovalentse β-glükosiidsideme hüdrolüüs.
pisi|center|503px|Laktoosi hüdrolüüs β-galaktosidaasi katalüüsil

Teises aktiivtsentris tekib allolaktoos. Selle reaktsiooni käigus laktoosi β 1–4 side lõhutakse ning glükoosi C6 hüdroksüülrühm reageerib galaktoosi esimese süsinikuga, moodustades allolaktoosi.

Kolmandas tsentris lõhustub allolaktoos monosahhariidideks. 
Just allolaktoos on see molekul, mis ühildub lacZ repressoriga ja tekitab tagasisideahela, mille abil reguleeritakse β-galatosidaasi hulka rakus. LacZ on rakus asuv struktuurgeen, mis kodeerib β-galaktosidaasi sünteesi.

β-galaktosidaasi maksimaalse katalüütilise aktiivsuse saavutamiseks on oluline Na+ või K+ ja Mg2+ ioonide juuresolek lahuses. Mono- ja divalentsete katioonide juuresolek on tähtis nii substraadi efektiivse sidumise kui ensüümi maksimaalse reaktsioonivõime jaoks. Nimelt katalüüsib β-galaktosidaas disahhariidi hüdrolüüsi läbi nii pindmise sidumise (inglise shallow binding) kui ka sügava sidumise (inglise deep binding), ning ilma katioonideta ei oleks beetagalaktosidaas piisavalt stimuleeritud, et need protsessid saaksid toimuda.

On täheldatud, et Rb+, Pb2+ ja Hg2+ korral on tegemist inhibeerivate ioonidega. On ka ioone, mis mitte kuidagi ei mõjuta beetagalatosidaasi aktiivsust. Üheks selliseks on Ca2+ katioon.

Katsed on näidanud, et β-galaktosidaasi aktiivsuse sõltuvus temperatuurist ehk reaktsiooni kiiruse sõltuvus temperatuurist vastab Arrheniuse võrrandile temperatuurivahemikus 0–30 ˚C. Temperatuuridel üle 30 ˚C hakkab see sõltuvus Arrheniuse võrrandist kõrvale kalduma.

 Stabiilsus 
Kõige püsivam on β-galaktosidaas pH väärtusel mis jääb 6–8 vahele. Kui pH väärtus langeb alla 6, langeb β-galaktosidaasi stabiilsus väga järsult. Kui aga pH tõuseb üle 8, langeb ta stabiilsus järk-järgult.

Teatud tingimustes on lahustunud β-galaktosidaasi võimalik säilitada mitu kuud, ilma et ensüümi aktiivsus väheneks. Üheks võimaluseks on hoiustamine külmkapis.

Samuti lüofilitseeritud ehk kuivatatud ja sügavkülmutatud meetodil on võimalik antud ensüümi säilitada.

 Kasutusalad 
Molekulaarbioloogias on väga laialt levinud β-galaktosidaasi kasutamine markerensüümina, et jälgida geeni avaldumist. Nimelt on β-galaktosidaasi kerge määrata X-gali ehk 5-bromo-4-kloro-3-indolüül- β-D-galaktopüranosiidi abil. X-gali puhul on tegemist värvitu lahustuva vedelikuga, milles on sarnaselt laktoosiga β-glükosiidne side. β-galaktosidaas on β-glükosiidsideme suhtes väga selektiivne ja mitteselektiivne ülejäänud molekuliosaga. Seega β-galaktosidaas hüdrolüüsib X-gal´i, vabastades asendatud indooli (1), mis iseeneslikult dimeriseerub, andes lahustumatu sinise lõppsaaduse (2).
pisi|center|500px|X-gali hüdrolüüs beetagalaktosidaasi katalüüsil

β-galaktosidaasi kasutatakse küllaltki palju ka toiduainetööstuses. Selle abil eemaldatakse piimatoodetest laktoosi, sest see on suure osa inimeste jaoks mitteseeditav (laktoositalumatus). Keskmiselt on värskelt lüpstud lehmapiimas laktoosi kontsentratsioon ligikaudu 5%.

Lisaks kasutatakse beeta-gali piimatoodete magustamise ning lahustuvuse ja maitse parandamisel, kuna hüdrolüüsitav laktoos on vähem magus ning lahustub vesilahustes oluliselt halvemini kui tekkivad glükoos ja galaktoos.

 Struktuur 
Algselt arvati, et β-galaktosidaasi puhul on tegemist monokliinse kristalliga, kus asümmeetrilises punktis on neli iseseisvat tetrameeri. Hiljem leiti, et β-galaktosidaasi ehitust iseloomustab hoopis ortorombiline ehk risttahukakujuline kristallstruktuur, mille asümmeetrilises punktis on üks tetrameer. 
pisi|Neli identset polüpeptiidahelat
Selle tetrameeri koostisse kuulub neli identset polüpeptiidahelat, kusjuures iga ahel sisaldab 1023 aminohapet. Neil kõigil on oma aktiivne tsenter, mis võivad nii koos kui iseseisvalt reaktsioonidest osa võtta. Iga ahela mass on ligikaudu 116 000 daltonit, mis teeb summaarselt β-galaktosidaasi massiks 446 000 daltonit. Kokku on antud ensüümil substraatide jaoks ligipääsetavat pinda umbes 135 000 Å² ja sisemist pinda ~18 000 Å².

Peale aminohapete sisaldab β-galaktosidaas veel mõningaid Mg2+ ja Na+ ioone ning 4424 vee molekuli.

β-galaktosidaasi struktuur sisaldab viit hästi määratletud domeeni (osa ensüümvalgu struktuurist, mis on võimeline sõltumata ülejäänud ensüümist arenema ja talitlema).
Tähtsaim neist on kolmas domeen: kokkupakitud valk, mis koosneb kaheksast α-heeliksist ja kaheksast paralleelsest β-harust. See domeen paikneb aminohapete vahemikus 334–627 ning moodustab enamuse ensüümi aktiivtsentrist.

 Reaktsioonid 
β-galaktosidaasi osalusel toimuvaks reaktsiooniks on disahhariidi laktoosi hüdrolüüs glükoosiks ja galaktoosiks. 
Et β-galaktosidaad saaks toimida katalüsaatorina, peab substraat jõudma ensüümi aktiivtsentrisse. See toimub difusiooni teel, mille kiirus sõltub substraadi ja ensüümi kontsentratsioonist ning molekulide kokkupõrgete sagedusest.
β-galaktosidaasi katalüütilise toime mehhanism toimub kahes etapis.
Esimene etapp hõlmab β-glükosiidsideme lõhustumist ja vahesaaduse galaktosüüli tekkimist. Galaktosüüli puhul on tegemist galaktoosiga, kus esimese süsiniku juures on radikaal. Teise etapina reageerib vesi kui aktseptormolekul radikaaliga. Tekib galaktoos.

Järgmistes võrrandites tähistab "-" kovalentset sidet, "*" mittekovalentset sidet, "Lak" laktoosi, "Gal" galaktoosi, "Glü" glükoosi, "Allo" allolaktoosi ja "E" ensüümi (β-galaktosidaas):

Arvesse tuleb võtta ka seda, et mitte kogu laktoos ei hüdrolüüsu kohe monosahhariidideks, vaid paralleelselt tekib ka allolaktoosi. Reaktsioonide toimumise tõenäosus on võrdne. Kuna aga allolaktoos on üks β-galaktosidaasi substraat, siis reaktsiooni lõppsaadusteks on kokkuvõttes ikkagi glükoos ja galaktoos.

β-galaktosidaasi aktiivsuse määramine tema naturaalse substraadi laktoosi abil on keeruline. Seetõttu kasutatakse aktiivsuse määramiseks laktoosi analoogi ONPG (o-nitrofenüül- β-D-galaktopüranosiid), mille hüdrolüüsi saadust on kerge spektrofotomeetriliselt detekteerida. 
β-galaktosidaas on selektiivne mõlema, nii laktoosi kui ONPG suhtes. Seega lõhustab ta ka viimase hapniku sideme, mille saaduseks on galaktoos ja o-nitrofenool (ONP).

ONPG puhul on tegemist värvitu substraadiga, ONP kui saadus on aga kollane. Seega saab kasutada UV/Vis-spektroskoopiat, et määrata ONP hulka: mida intentsiivsem kollane, seda rohkem on ONP-d, järelikult on seda rohkem ONPG-d lagunenud ehk seda suurem on β-galaktosidaasi aktiivsus.
pisi|center|500px|ONPG hüdrolüüs ONP + galaktoos

 Viited 

Kategooria:Ensüümid