PepFectid

PepFectid on klass amfipaatseid rakku sisenevaid peptiidide, mis on osutunud efektiivseks erineva nanosuuruses nukleotiidse materjali, nagu plasmiidne DNA, väikese interfereeriva RNA (siRNA), antisense oligonukleotiidid (asON), splassingut korrigeerivate oligonukleotiidide (SKO) ja anti-mikroRNA (AMO) rakku transportijateks in vitro ja in vivo.

PepFectid on kuni 22 aminohapet pikad ja põlvnevad amfipaatse RSP – transportan10 – edasisest modifitseerimisest.

PepFectid assotsieeruvad lahuses kiiresti vastava transporditava nukleotiidse materjaliga mittekovalentsete elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu moodustades stabiilseid nanokomplekse. Võrreldes enamiku teiste RSP-ga, mille lastmolekulid seotakse kovalentselt, lihtsustab mittekovalentne konjugatsioon PepFectide rakendamist transportvektorina, kuna vastavad kompleksid moodustatakse vaid ainete segamise ja inkubeerimise teel. Samuti puudub vajadus optimeerida individuaalseid sünteesiskeeme. Lisaks vähendab mittekovalentne interaktsioon võimalust transportijal interakteeruda lastmolekuli bioaktiivsusega.

 PepFecti perekond 
PepFecti strateegia baseerub transportan 10 (Tabel 1) N-terminaalsel stearüülimisel, kuna rasvhapete lisamine suurendab RSP-de, eriti amfipaatsete, bioaktiivsust . Stearüüljäägiga peptiid on hüdrofoobsem ja tänu sellele siseneb rakku efektiivsemalt. Võrreldes modifitseeritud arginiinirikaste eelkäijate transportani ja transportan 10-ga, on stearüül-transportan 10 ehk PepFect3 (Tabel 1) üles näidanud suuremat efektiivsust plasmiidse DNA transportimisel erinevatesse rakuliinidesse, olles efektiivsuselt võrreldav laialdaselt kasutatava kommertsiaalse analoogiga Lipofectamine™ 2000. Kuid stearüülimisega parendatud endosomolüütilised omadused polnud piisavalt efektiivselt ja panid aluse edasistele modifikatsioonidele.

Tabel 1. PepFecti perekond
 RSP  Järjestus  Transportan (TP) GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 Transportan 10 (TP10)  AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 PepFect3 (PF3)  Stearüül-AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2 PepFect6 (PF6)  Stearüül-AGYLLGK(QN)INLKALAALAKKIL-NH2 PepFect14 (PF14)  Stearüül-AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL-NH2 PepFect15 (PF15)  Stearüül-AGYLLGK(QNs)LLOOLAAAALOOLL-NH2
*QN – trifluorometüülkinoliini jääk; O – ornitiin.

 PepFect6 
PepFect6 (Tabel 1) on loodud eelkõige siRNA kohaletoimetamiseks ja lähtub seetõttu komplekside vabastamisest endosoomist tsütoplasmasse. Lüsosomotoopilise agendi, klorokiini, lisamine modifitseerimata TP10 komplekside transfektsioonilahusesse on tõhustanud rakusisese tarne efektiivsust. Klorokiini asendamine aktiivsema analoogi trifluorometüülkinoliiniga on endosomolüütilist aktiivsust veelgi parandanud. Erinevalt klorokiinist pole trifluorometüülkinoliini kasutamisel täheldatud märkimisväärset tsütotoksilisust, mistõttu on see rakendatav in vivo lähenemistes. 
PepFect6 on konstrueeritud PepFect3 põhjal, kus viimase 7. lüsiinile suktsinüülitud lüsiiniharule on kovalentselt liidetud neli trifluorometüülkinoliini jääki (QN), mis põhjustab endosoomi tursumise ning sisemise ülerõhu ja lüüsi. QN-jääkide võime siduda prootoneid puhverdab endosomaalset pH-d, inhibeerides happestumise, ning takistab hilise endosoomi küpsemist lüsosoomiks. Muutunud osmootne rõhk aga samal ajal lõhub endosoomi membraani vabastades kompleksid tsütoplasmasse.

PepFect6 on näidanud suurt võimekust siRNA kohaletoimetamisel jäädes seejuures väga efektiivseks ka seerumiga tingimustes. Erinevalt lipofektsioonist esineb PepFect6 vahendatud siRNA vaigistus kogu rakupopulatsiooni ulatuses, seejuures ka raskesti transfekteeritavate rakutüüpide (suspensioonrakud, embrüonaalsed tüvirakud jt) puhul. Lisaks pole PepFect6 kasutamine ilmutanud märkimisväärset toksilisust rakkudele. Kuigi PepFect6 loomise prioriteediks on siRNA vahendamine rakkudesse, on PepFect6 osutunud efektiivseks transportijaks ka SKO ja plasmiidse DNA puhul. Kuid võrreldes lipofektsiooniga, toimub PepFect6 vahendatud DNA sisenemine rakutuuma viivitusega.

 PepFect14 
pisi|CHO rakku tuuma on viidud plasmiidset DNA-d (pGL3; 4,7 kDa) kasutades selleks PepFect14 rakku sisenevaid peptiide. Vasakul äärel on näha rakutuum, paremal mitokondrid. Mõõtlõik on antud pikkusega 500 nm. Transmissioonelektronmikroskoopia. Tartu Ülikooli molekulaar- ja rakubioloogia instituut
PepFect14 (Tabel 1) arendus baseerub varasematel ornitiini-põhistel transfektsioonidel, mis on näidanud ornitiini suuremat efektiivsust võrreldes lüsiiniga, kuna ornitiin on DNA suhtes afiinsem. PepFect14 aluseks on samuti PepFect3, kuid lüsiinid on asendatud ornitiinide ja leutsiinid isoleutsiinidega. Vahetus ornitiinide vastu suurendab peptiidi positiivsete laengute arvu võimaldades tõhusama komplekside formeerumise nukleotiidse materjaliga. Lisaks suurendab see vastupanu degradatsioonile, kuna ornitiin on mitteproteiogeenne aminohape ja seetõttu vähem äratuntav seerumi proteaasidele.

PepFect14 on näidanud tähelepanuväärset efektiivsust mittetoksilise vektorina SKO rakku transportimisel nii seerumita kui seerumiga keskkonnas. PepFect14 transporditud SKO-d on indutseeritud splaissingu korrektsioon tunduvalt kõrgemal tasemel, kui kommertsiaalselt saada olevatel enimkasutatud transfektsiooni vahendid Lipofectamine 2000 ja RNAiMAX. Võrreldes oma eellase PepFect3-ga püsivad PepFect14 kompleksid rohkem aktiivsetena seerumi olemasolul tänu orntiinide vähendatud hüdrolüüsile ning on seeläbi stabiilsemad väiksemate laengusuhete juures. 

Tahked ravipreparaadid, nagu kapslid, pulbrid, tabletid, on laialdases kasutuses, kuna neid on kerge manustada ja need on stabiilsed säilitamisel ja transportimisel. Uurimaks PepFect strateegia kohandumist tahketele ravimikandjatele, on testitud PepFect14 ja SKO tahkeid formatsioone. Vastavate aktiivsete ja stabiilsete formatsioonide moodustumise tulemused on näidanud efektiivset splaissingu korrektsiooni, mis on peaaegu võrdväärne nanokomplekside võimekusega vedeliku vormis. Samas on tahkete formatsioonide efektiivsus sõltuv abiaine tüübist ja selle kontsentratsioonist. Lisaks SKO-de transportimisele on PepFect14 osutunud erinevates rakuliinides ka tõhusaks siRNA transportvektoriks üsna võrdväärselt PepFect6-ga. Seejuures on PepFect14 ja siRNA tahked formatsioonid säilitanud aktiivsuse simuleeritud gastraalsetel tingimustel.

 PepFect15 
PepFect15 disainimisel on lähtutud tulemustest PepFect6 ja PepFect14 katsetel. PepFect14 järgnevusele liideti PepFect6 omased trifluorometüülkinoliini jäägid ning saadud hübriidses vormis on ühendatud nii PepFect6 endosomolüütiline eelis kui ka PepFect14 täiustatud komplektsioon ja vastupanu degradatsioonile. Kõrvutamine oma eelkäijatega, on näidanud PepFect15 ülekaalu SKO-de ja AMO-de transportimisel rakku suurematel molaarsuhetel. Samas võrdsetel molaarsuhetel on kõigi kolme peptiidi võimekus enam-vähem võrdne.

PepFect strateegia efektiivsus ja mittetoksilisus on pannud aluse mitmetele edasistele uurimistele laiendades PepFectide kasutamisvõimalusi. Hiljutised arendused on perekonda täiendanud värskete peptiidiseeriatega, kus PepFect strateegia on kombineeritud kas amfipaatse mudelpeptiidi (MAP) järjestusega, uurimaks rakusisese transpordi strukturaalseid nõudmisi, või angiopep-2 vektoriga, võimaldamaks transporti läbi hematoentsefaalse barjääri. Ning eksisteerivatele PeFectidele lisaks on PepFect3 põhjal aretatud ka PepFectide sugulusperekond – NickFectid –, mis on samuti osutunud efektiivseteks ja mittetoksilisteks SKO, siRNA ja plasmiidse DNA vahendajateks paljudes rakuliinides.

 Rakkudesse sisenemise mehhanism 
Transportan 10 ja sellel põhinevad PepFectid on transportimisel näidanud selget amfipaatilist karakterit. Positiivselt laetud transportpeptiidi ja negatiivselt laetud oligonukleotiidi konjugatsioon võimaldab kompleksi vahendamist rakku endotsütoosi teel. PepFectide sisenemismehhanisme pole veel täielikult uuritud ning seetõttu ei ole need piisavalt selged. Arvatavalt sisenevad PepFecti kompleksid rakku valdavalt klatriini vahendatud endotsütoosi teel. Uuemad uuringud näitavad, et PepFect14 ja PepFect15 vahendamisel osalevad ka A klassi puhastusretseptorid, mis teadaolevalt seovad negatiivselt laetud ligande. Vastupidi prevaleerivale arvamusele, kus RSP sisenemine rakku sõltub positiivsetest laengutest interakteerudes rakumembraani negatiivsete laengutega, on PepFect14/15 ja SKO kompleksid leitud olevat negatiivse laenguga, kuid sellegipoolest efektiivselt sisenenud HeLa rakuliini. Edasised käimasolevad uuringud võivad laiendada puhastusretseptorite või paljastada uute retseptorite osakaalu PepFecti perekonna rakku vahendamisel.

Viited

Kategooria:Rakubioloogia