Restriktaasid

Restriktaasid (sait-spetsiifilised endonukleaasid) on ensüümid, mis lõikavad DNA-ahelat kindlate nukleotiidsete järjestuste juurest. Selliseid spetsiifilisi järjestusi nimetatakse restriktsioonisaitideks. Restriktaase on leitud bakteritest ja arhedest, kus need kaitsevad rakku sissetungivate viiruste eest. Prokarüootides lõikavad restriktaasid vaid võõrast DNA-d, raku enda DNA-d kaitseb restriktaasi eest metülaas, metüleerides A ja C nukleotiidid. Sellist kaitsemehhanismi nimetatakse restriktsiooni-modifikatsiooni süsteemiks.

Praeguseks on põhjalikult uuritud üle 3000 restriktaasi ja neist ligikaudu 600 on kasutusel laborite igapäevatöös, et DNA-d modifitseerida ja manipuleerida.

Ajalugu
Esimene bakteritest isoleeritud restriktaas oli HindII. See eraldati 1970. aastal bakterist Haemophilus influenzae. Selle ja veel mitme restriktaasi avastamise eest anti 1978. aastal Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhind kolmele teadlasele: Daniel Nathans, Werner Arber ja Hamilton O. Smith. Nende avastus pani aluse rekombinantse DNA tehnoloogia arengule, millel on väga palju kasutusalasid, näiteks saab selle tehnoloogia abil kasutada E. coli baktereid kiireks ja suuremahuliseks insuliini tootmiseks.

 Restriktsioonisait 
pisi|Palindroomse ala järjestus on mõlemal ahelal sama, kui lugeda nukleotiide mõlemal ahelal samasuunaliselt (5’ otsast 3’ otsa).
Restriktaasid tunnevad ära teatud nukleotiidse järjestuse ja lõikavad läbi DNA kaksikheeliksi mõlemad ahelad. Restriktsioonisaidis on enamasti 4–8 nukleotiidi ja tihti on see palindroomne, mis tähendab, et nukleotiidide järjestus on mõlemat pidi lugedes sama. DNA-l on kaks palindroomse järjestuse võimalust. Peegelpalindroom (ingl mirror-like palindrome) on sarnane palindroomidega, mis esinevad keeles, näiteks "udu". DNA-järjestuses on peegelpalindroom näiteks GTAATG. Pöördkorduv palindroom (ingl inverted repeat palindrome) on samuti mõlemat pidi samasugune, kuid palindroom esineb komplementaarsetes DNA-ahelates, näiteks järjestuse GTATAC puhul, millele komplementaarne järjestus on CATATG. Pöördkorduvad palindroomid esinevad sagedamini ja omavad suuremat tähtsust kui peegelpalindroomid. Palindroomid võivad ahelates tekitada "volte", kus osa ahelast jääb U-kujuliselt üheahelaliseks.

EcoRI restriktaas jätab lõigates kleepuvad otsad:

90px

SmaI restriktaas jätab lõigates tömbid otsad:

90px

Äratundmisjärjestus on restriktaasidel erinev, mistõttu tekivad lõigates eri pikkusega kleepuvad otsad. Need võivad asuda nii peaahelal kui ka komplementaarsel ahelal.

Restriktaase, mis tunnevad ära sama järjestuse, kuid lõikavad erinevatest kohtadest, nimetatakse neoskisomeerideks. Ensüüme, mis tunnevad ära sama järjestuse ja ka lõikavad samade nukleotiidide vahelt, nimetatakse isoskisomeerideks.

 Tüübid 
Restriktaasid jagatakse nelja gruppi (I, II, III ja IV tüüpi) nende struktuuri, vajaliku kofaktori, äratundmisjärjestuse ja restriktsioonisaidi järgi. Kõik restriktaasid tunnevad ära kindla järjestuse ja teevad endonukleolüütilise lõike sellisel viisil, et tekiksid kindla järjestusega 5’ ja 3’ otsad. Nende eristamistunnused on järgnevad:

 I tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.3) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestusest eemal. Need vajavad talitlemiseks nii ATP-d kui ka S-adenosüülmetioniini. On multifunktsionaalsed valgud, millel on nii restriktsiooni kui ka metülaasi (EC 2.1.1.72) ülesanded.
 II tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.4) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestuse sees või selle lähedal. Enamik neist vajavad magneesiumi. Need on vaid restriktsioonifunktsiooniga metülaasist sõltumatud valgud.
 III tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.5) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestuse lähedal. Need vajavad ATP-d (kuid ei hüdrolüüsi seda). S-adenosüülmetioniin stimuleerib reaktsiooni, kuid ei ole vajalik selle toimumiseks. Esineb osana suuremast valgust koos modifitseeriva metülaasiga (EC 2.1.1.72).
 IV tüüpi ensüümid seonduvad modifitseeritud (näiteks metüleeritud, hüdroksümetüleeritud või glükosüül-hüdroksümetüleeritud) DNA-ga. Need on bakteri viimase järgu kaitseensüümid.

 I tüüp 
I tüüpi restriktaasid olid esimesed, mis avastati ja mille omadusi iseloomustati. Need isoleeriti E. coli bakterist. I tüüpi restriktaaside restriktsioonisait erineb ja on vähemalt 1000 aluspaari kaugusel nende äratundmisjärjestusest. Lõikamine järgneb DNA translokatsioonile, mis tähendab, et need ensüümid on ka molekulaarmootorid. Äratundmisjärjestus on asümmeetriline ja koosneb kahest osast: ühes 3–4 nukleotiidi, teises 4–5 nukleotiidi. Neid eraldab mittespetsiifiline 6–8 nukleotiidi pikkune vaheala. Sellised ensüümid on multifunktsionaalsed ning on sõltuvalt DNA metüleeritusest võimelised nii restriktsiooniks kui ka modifitseerimiseks. Täielikuks aktiivsuseks on neil vaja kofaktoreid S-adenosüülmetioniini, hüdrolüüsitud ATP-d ja magneesiumiioone (Mg2+). I tüüpi restriktaasidel on 3 allüksust: HsdR, HsdM ja HsdS. HsdR on vajalik restriktsiooniks, HsdM on vajalik DNA metüleerimiseks ja HsdS on vajalik mõlemaks: nii eelnevaks ülesandeks kui ka DNA-ga seondumiseks.

 II tüüp 
pisi|"Eco"RI restriktaasi struktuur (roheline ja sinine ala). Ensüüm seondub DNA kaksikheeliksi (pruun ala) külge. Ensüümi lõikamiskohale liitub kaks magneesiumi iooni (üks mõlemale monomeerile), mis tekitavad lünga DNA struktuuris
II tüüpi restriktaasid erinevad I tüüpi restriktaasidest mitmel moel. Need moodustavad homodimeere, mille äratundmisjärjestused on enamasti lahutamata palindroomid, mis on 4–8 nukleotiidi pikad. DNA-d lõikavad need sama koha pealt, kuhu seonduvad, ning ei vaja kofaktorina ATP-d ega S-adenosüülmetioniini, vaid ainult Mg2+ iooni. Selle rühma ensüüme kasutatakse enim ja need on teaduslaborites laialt levinud. 1990. aastatel ja 2000. aastate alguses leiti sellest klassist uusi ensüüme, mis ei vastanud täpselt eelpool mainitud tingimustele. Seetõttu loodi alamklassid, kuhu jaotada ensüüme vastavalt nende erinevustele rühma põhitüübist. Alamklassidele on lisatud järelliide.

IIB tüüpi restriktaasid (nt BcgI ja BplI) on multimeerid, mis tähendab, et need koosnevad rohkem kui ühest allüksusest. IIB tüüpi restriktaasid lõikavad ahela läbi mõlemalt poolt äratundmisjärjestust, lõigates kogu seondumisala ahelast välja. Need vajavad kofaktoritena S-adenosüülmetioniini ja Mg2+-ioone.

IIE tüüpi restriktaasid (nt NaeI) seonduvad oma äratundmisjärjestusega kahes kohas. Üks neist on replikatsioonisait, teist ala kasutab ensüüm allosteerilise aktivaatorina, mis kiirendab DNA lõikamist. 

IIF tüüpi restriktaasid (nt NgoMIV) toimivad sarnaselt IIE tüüpi restriktaasidega, kuid lõikavad DNA järjestuse mõlemast seondumisalast korraga. 

IIG tüüpi restriktaasidel (nt Eco57I) on sarnaselt II tüüpi restriktaasidega üks allüksus, kuid need vajavad kofaktorina S-adenosüülmetioniini.

IIM tüüpi restriktaasid (nt DpnI) tunnevad ära ja lõikavad metüleeritud DNA-d.

IIS tüüpi restriktaasid (nt FokI) lõikavad DNA-d kindla nukleotiidse järjestuse kauguselt oma äratundmisjärjestusest, mis on asümmeetriline ja mittepalindroomne. Need ensüümid võivad talitleda dimeeridena.

IIT tüüpi restriktaasid (nt Bpu10I ja BslI) koosnevad kahest erinevast allüksusest. Mõned selle alamklassi ensüümid seonduvad palindroomse järjestusega, teised asümmeetrilise järjestusega.

 III tüüp 
III tüüpi restriktaasidel (nt EcoP15) on kaks erinevat mittepalindroomset äratundmisjärjestust, mis on vastassuunalised. Ensüüm lõikab DNA-ahela läbi 20–30 aluspaari kauguselt seondumisalast. Nendel ensüümidel on mitu allüksust, need täidavad nii metüleerimise kui ka restriktsiooni ülesannet ning need vajavad S-adenosüülmetioniini ja ATP-d. Selliseid restriktaase kasutavad prokarüoodid selleks, et kaitsta end sissetungiva võõra DNA eest. III tüüpi restriktaasid on hetero-oligomeersed multifunktsionaalsed valgud, mis koosnevad kahest allüksusest (Res ja Mod). Mod-allüksus tunneb ära spetsiifilise DNA järjestuse ja on DNA modifitseerimiseks vajalik metüültransferaas. Res on vajalik restriktsiooniks, kuid iseseisvalt pole see aktiivne. III tüüpi restriktaasidel on 5–6 aluspaari pikkused asümmeetrilised äratundmisjärjestused ning need lõikavad DNA-ahela läbi 25–27 aluspaari kauguselt pärisuunas, jättes vabaks lühikese üheahelalise üleulatuva 5’ otsa. Selleks, et ensüüm lõikaks, on vaja kaht vastupidise suunaga metüleerimata äratundmisjärjestust. III tüüpi ensüümid metüleerivad adenosüüljäägi N-6-positsioonil ühe DNA-ahela, seega on värskelt replitseeritud DNA-l vaid üks metüleeritud ahel, kuid see on piisav, et kaitsta seda uue restriktsiooni eest.

 Tehislikud restriktaasid 
Tehislikke restriktaase valmistatakse, liites looduslikke või tehislikke DNA seondumisdomeene nukleaasdomeenidega (selleks on sageli IIS tüüpi restriktaasi FokI-i restriktsioonidomeen). Sünteetilised restriktaasid suudavad ära tunda suuri saite (kuni 36 aluspaari) ja neid võib panna seonduma mis tahes DNA-järjestusega. Tsinksõrmnukleaasid on geenitehnoloogias enim kasutatavad tehislikud restriktaasid.

 Näited 

Näiteid restriktaasidest:

 Ensüüm  Allikas  Spetsiifiline järjestus  LõigeEcoRIEscherichia coli 5'GAATTC
 3'CTTAAG 5'---G     AATTC---3'
 3'---CTTAA     G---5'EcoRIIEscherichia coli 5'CCWGG
 3'GGWCC 5'---     CCWGG---3'
 3'---GGWCC     ---5'BamHIBacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC
 3'CCTAGG 5'---G     GATCC---3'
 3'---CCTAG     G---5'HindIIIHaemophilus influenzae 5'AAGCTT
 3'TTCGAA 5'---A     AGCTT---3'
 3'---TTCGA     A---5'TaqIThermus aquaticus 5'TCGA
 3'AGCT 5'---T   CGA---3'
 3'---AGC   T---5'NotINocardia otitidis 5'GCGGCCGC
 3'CGCCGGCG 5'---GC   GGCCGC---3'
 3'---CGCCGG   CG---5'HinfIHaemophilus influenzae 5'GANTCA
 3'CTNAGT 5'---G   ANTC---3'
 3'---CTNA   G---5'Sau3AStaphylococcus aureus 5'GATC
 3'CTAG 5'---     GATC---3'
 3'---CTAG     ---5'PvuII*Proteus vulgaris 5'CAGCTG
 3'GTCGAC 5'---CAG  CTG---3'
 3'---GTC  GAC---5'SmaI*Serratia marcescens 5'CCCGGG
 3'GGGCCC 5'---CCC  GGG---3'
 3'---GGG  CCC---5'HaeIII*Haemophilus aegyptius 5'GGCC
 3'CCGG 5'---GG  CC---3'
 3'---CC  GG---5'HgaIHaemophilus gallinarum 5'GACGC
 3'CTGCG 5'---NN  NN---3'
 3'---NN  NN---5'AluI*Arthrobacter luteus 5'AGCT
 3'TCGA 5'---AG  CT---3'
 3'---TC  GA---5'EcoRV*Escherichia coli 5'GATATC
 3'CTATAG 5'---GAT  ATC---3'
 3'---CTA  TAG---5'EcoP15IEscherichia coli 5'CAGCAGN25NN
 3'GTCGTCN25NN 5'---CAGCAGN25NN   ---3'
 3'---GTCGTCN25   NN---5'KpnIKlebsiella pneumoniae 5'GGTACC
 3'CCATGG 5'---GGTAC  C---3'
 3'---C  CATGG---5'PstIProvidencia stuartii 5'CTGCAG
 3'GACGTC 5'---CTGCA  G---3'
 3'---G  ACGTC---5'SacIStreptomyces achromogenes 5'GAGCTC
 3'CTCGAG 5'---GAGCT  C---3'
 3'---C  TCGAG---5'SalIStreptomyces albus 5'GTCGAC
 3'CAGCTG 5'---G  TCGAC---3'
 3'---CAGCT  G---5'ScaIStreptomyces caespitosus 5'AGTACT
 3'TCATGA 5'---AGT  ACT---3'
 3'---TCA  TGA---5'SpeISphaerotilus natans 5'ACTAGT
 3'TGATCA 5'---A  CTAGT---3'
 3'---TGATC  A---5'SphIStreptomyces phaeochromogenes 5'GCATGC
 3'CGTACG 5'---GCATG  C---3'
 3'---C  GTACG---5'StuIStreptomyces tubercidicus 5'AGGCCT
 3'TCCGGA 5'---AGG  CCT---3'
 3'---TCC  GGA---5'XbaIXanthomonas badrii 5'TCTAGA
 3'AGATCT 5'---T  CTAGA---3'
 3'---AGATC  T---5'
Tähistused:

* = tömp otsN = C või G või T või AW = A või T

Vaata ka
 DNA replikatsioon
 DNA sekveneerimine
 ATP

Viited

Kategooria:Ensüümid
Kategooria:Biotehnoloogia