DNA reparatsioon

DNA reparatsioon ehk DNA parandamine on protsess, mille käigus elimineeritakse DNA-s erinevatel põhjustel tekkinud kahjustusi. DNA-s tekib pidevalt kahjustusi, mis kinnistuvad järgmise replikatsioonitsükli jooksul mutatsioonidena. Mutatsioonid on muutused organismi genoomse DNA nukleotiidses järjestuses, mis fikseeruvad ja millega võivad kaasneda fenotüübilised muutused. Looduses on mikroorganismide kasv limiteeritud, kuna keskkonnatingimused on enamasti ebasoodsad.  

Põhilised kasvu limiteerivad tegurid on ebasoodne temperatuur, pH ja osmolaarsus. Samuti on piiratud toitainete kättesaadavus. Seega ei saa bakterid looduses pidevalt paljuneda ja on puhkavas seisundis ehk statsionaarses faasis. Sellises olukorras on eelistatud bakterid, kes suudavad piisavalt kiiresti kohaneda olemasolevate keskkonnatingimustega. Niisiis toimub looduses bakterite suhteliselt kiire evolutsioneerumine, kus ülekaalu saavutavad kiiremini kohanevad mutandid. Mutatsioonide tekkesageduse tõusu põhjustavad näiteks erinevad kemikaalid, kiirgus, oksüdatiivsed- ja alküülkahjustused. Et toime tulla erinevate DNA kahjustustega, on mikroorganismidel välja kujunenud mitmeid reparatsioonisüsteeme, et tekkinud vead parandada. Samuti on neil olemas vigaderohked DNA polümeraasid, mis on võimelised sünteesima üle DNA kahjustuste ja seetõttu replikatsioon ei peatu. 

DNA kahjustused
Kuna bakterid oma elukeskkonnas on pidevalt statsionaarses faasis, siis kuhjuvad neis DNA kahjustused, mis parandamata jäädes võivad põhjustada mutatsioone. DNA kahjustused tekivad endogeenselt organismi normaalse elutegevuse käigus ja eksogeenselt väliste keskkonnategurite mõjul. Endogeenseid DNA kahjustusi põhjustavad põhiliselt reaktiivsed hapniku- ja alküülivad ühendid ning vähemal määral ka spontaanne lämmastikaluste eemaldamine ja deamineerimine. Eksogeenseid DNA kahjustusi põhjustavad näiteks ultraviolettkiirgus, ioniseeriv kiirgus ja keskkonnas leiduvad kemikaalid.
Endogeensed DNA kahjustused tekivad suurema sagedusega kui eksogeensed. Kahjustused, mis tekivad raku normaalse elutegevuse käigus, on identsed või väga sarnased nendega, mida põhjustavad mõned keskkonnas esinevad DNA-d kahjustavad ained. Muutustele DNA-s viivad näiteks radiatsioon, hüdrolüüs, tundlikkus reaktiivsetele hapniku ja lämmastiku ühenditele ja teistele reaktiivsetele ühenditele nagu alküülivad ained ja lipiidperoksüdatsiooni saadused. 
Sellised DNA lämmastikalused nagu adeniin, guaniin, tsütosiin ja 5-metüültsütosiin, on altid spontaanse hüdrolüütilise deaminatsiooni käigus vastavalt muutuma hüpoksantiiniks, ksantiiniks, uratsiiliks ja tümiiniks. Deaminatsiooni esineb sagedamini üksikahealalises kui kaheahelalises DNA-s, kuna kaheahelaline DNA on kaitstud hüdrogeensete sidemete poolt.
Et nende ohtudega tegeleda ning ühtlasi kindlustada DNA stabiilsus ja genoomi kaitse potentsiaalsete ja mutageensete muutuste eest, on organismidel välja kujunenud mitmeid kahjustuste vältimise ja parandamise süsteeme. Erinevate kaitsemehhanismide koostoimel tagatakse geneetilise informatsiooni täpne ülekanne tütarrakkudesse.

DNA metülatsioon ja alküülivad ained
Metülatsioon reguleerib väga paljusid rakulisi protsesse. Näiteks võimaldab DNA metülatsioon kaitsta genoomi restriktsiooniliste endonukleaaside eest. Samuti reguleerib metülatsioon DNA replikatsiooni ja transkriptsiooni. Lisaks eelnevale on DNA metülatsioon vajalik DNA paardumisvigade reparatsioonil (mismatch repair, MMR) äsja sünteesitud DNA ahela eristamiseks vanast DNA ahelast.

Kuigi DNA metülatsioon on vajalik, võib lämmastikaluste teatud positsioonidesse metüül- või etüülrühma lisamine (alküülimine) olla mutatsioonide teket soodustav. Metüleerivad ained suudavad reageerida DNA-ga 12 erinevas kohas DNA alustes, kaasa arvatud eksotsüklilise hapniku ja enamiku tsüklis olevate lämmastikega. Samuti suudavad nad metüleerida hapniku aatomeid suhkurfosfaat selgroos ning tekitavad metüülfosfotriestreid . Olenevalt ainete iseloomust on alküülivad ained jagatud kahte rühma: SN1 ja SN2 tüüpi ained. SN1 tüüpi ained alküülivad nukleiinhapetes nii hapnikku kui ka lämmastikku, ent SN2 tüüpi ained alküülivad põhiliselt lämmastikku . Peamised laborites kasutatavatest alküülivatest ainetest reageerivad SN2 mehhanismi järgi (nt metüülmetaansulfonaat (MMS), dimetüülsulfonaat (DMS) ja metüüljodiid (MeI)). Need kemikaalid metüleerivad DNA lämmastikaluste puriini ja pürimidiini tsüklites põhiliselt lämmastikku . Veel üks levinud SN2 tüüpi ühend on S-adenosüülmetioniin (SAM), mis on metüülgruppide doonor ja tekitab ka 7-metüülguaniini ja 3-metüüladeniini . SN1 tüüpi ained (nt N-metüül-N '-nitro-N-nitrosoguanidiin (MNNG) ja N-metüülnitrosouurea (MNU)) alküülivad nii lämmastikku kui ka hapnikku DNA alustes ja samuti hapnikku suhkurfosfaat selgroos . 

DNA alküülkahjustused
Põhilised alküülivaid aineid tekitavad 7-metüülguaniini ja 3-metüüladeniini. Kõige sagedamini tekib 7-metüülguaniin. MMS ja looduses leiduvate metüülhaliidide toimel tekib 1-metüüladeniini ja 3-metüültsütosiini. Need kahjustused tekivad sagedamini üksikahelalises DNA-s ja RNA-s . Põhilised kahjustused, mis tekivad alküülivate ainete toimel kaheahelalises DNA-s, on 7-metüülguaniin, 3-metüüladeniin ja O6-metüülguaniin. Kaheahelalises DNA-s ei saa tekkida 1-metüüladeniini ja 3-metüültsütosiini, sest tema reaktiivsaidid on seotud aluste paardumisega ja seega muutuste eest rohkem kaitstud. Mitmed DNA aluste modifikatsioonid blokeerivad DNA replikatsiooni ning on seetõttu tsütotoksilised. Nende hulka kuuluvad ka 3-metüüladeniin, 3-metüülguaniin, 3-metüültsütosiin ja 1-metüüladeniin . 7-metüülguaniin on suhteliselt kahjutu modifikatsioon . MNU ja MNNG reageerivad hapnikuga ja tekitavad O6-metüülguaniini ja O4-metüültümiini, mis ei blokeeri DNA replikatsiooni ja ei ole seega tsütotoksilised. Samas on teada, et nad annavad DNA replikatsioonil valepaardumisi, mille tulemusena GC asendub AT-ga ja seega on need alküülkahjustused väga mutageensed . 

DNA mismatch reparatsioon
DNA paardumisvigade reparatsioonisüsteem (mismatch repair, MMR) eemaldab DNA ahelast replikatsiooni käigus tekkinud valepaardumisi, hoides ära asendusmutatsioonide, insertsioonide ja deletsioonide teket. Lisaks takistab MMR homoloogilist rekombinatsiooni, vältides seetõttu võõr-DNA lülitamist bakteri genoomi. Reparatsioonirada algab MutS valgu seondumisega DNA kahjustusele. Seejärel seondub veel MutL valk, mis aktiveerib DNA ühte ahelasse lõike tegeva ensüümi MutH. See, kumba ahelasse lõige tehakse, otsustatakse DNA metülatsiooni järgi (värskelt sünteesitud DNA ahel on veel metüleerimata). Seejärel keerab DNA helikaas II valepaardumist sisaldava ahela lahti ning ahela degradeerib mõni eksonukleaasidest. Tekkinud üksikahelalise regiooni sünteesib täis DNA polümeraas III ja DNA ahelate otsad ühendab DNA ligaas.

DNA polümeraasi 3' – 5' eksonukleaasne aktiivsus
Bakterite DNA polümeraas III teeb keskmiselt ühe vea 10 000 nukelotiidi kohta. Üks süsteem, mis replikatsioonil tekkinud valepaardumisi eemaldab on DNA polümeraasi 3' – 5' eksonukleaasne aktiivsus. Bakteritel viib DNA replikatsiooni läbi DNA polümeraas III holoensüüm, mis sisaldab ξ (epsilon) subühikut. ξ subühiku ülesandeks on eemaldada valepaardumisi, skaneerides pidevalt sünteesitud DNA ahelat ning leides valepaardumise, eemaldab selle tänu 3' – 5' eksonukleaassele aktiivsusele. Pärast vea eemaldamist replikatsioon jätkub. DNA polümeraasi 3' – 5' eksonukleaasset aktiivsust nimetatakse ka proofreading aktiivsuseks.

Aluse väljalõike reparatsioon
Aluse väljalõike reparatsioon (base excision repair, BER) on peamine reparatsioonisüsteem, mis vastutab modifitseeritud aluste eemaldamise eest. BER on konserveerunud bakteritest inimeseni. BER abil eemaldatakse nii alküülivate ühendite kui ka reaktiivsete hapniku- ja lämmastikuühendite tekitatud kahjustusi. BER-il on kaks alternatiivset rada: lühikese ulatusega BER (short-patch BER, SP-BER), mis asendab ühe nukleotiidi ja pika ulatusega BER (long-patch BER, LP-BER), mille käigus asendatakse mitu nukleotiidi (vähemalt 2, tihti 6–13 nukleotiidi asendust). BER-i ensüüm DNA N-glükosülaas tunneb ära ja eemaldab muudetud või mittesobiva aluse. Seejärel katalüüsib DNA N-glükosülaas N-glükosiidsideme hüdrolüüsi kahjustatud lämmastikaluse ja desoksüriboosi vahele. Tekib AP-sait, mida töötlevad AP endo-või eksonukleaasid. Selle tulemusel tekib tühimik, mille sünteesib täis DNA polümeraas I ja otsad ühendab DNA ligaas I.

Nukleotiidi väljalõike reparatsioon

Nukleotiidi väljalõike reparatsioon (nucleotide excision repair, NER) eemaldab põhiliselt eksogeenseid DNA konformatsiooni muutvaid kahjustusi nagu UV kiirgusest tekitatud pürimidiini dimeerid ja alküülivate ühendite põhjustatud kahjustusi. NER raja algatamiseks on vajalik kahjustuse äratundmine UvrA ja UvrB valkude dimeeride kompleksiga. Pärast seda UvrA valk eemaldub ning tema asemele seondub UvrC endonukleaas, mis katalüüsib DNA katkete tegemise kahjustusest 3'–5' suunas. Seejärel eemaldatakse kahjustust sisaldav 12–13 nukleotiidi pikkune fragment. Tekkinud tühimiku sünteesib täis DNA polümeraas I ning ahelate otsad ühendab DNA ligaas.

UV kahjustuste parandamine valgussõltuva DNA reparatsiooni abil
On reparatsiooni mehhanism, mille tulemusena ei lõigata UV poolt põhjustatud kahjustusi välja, vaid lahutatakse ensümaatiliselt. Prokarüootides on selleks fotoülaasid, mis kujutavad endast flavoproteiine. Sõltuvalt valgust siduva kofaktori tüübist jagatakse need valgud kahte rühma: folaat fotoülaasid ja deasaflaviin fotoülaasid.

DNA kahjustuste ületamine
Lisaks replikatsiivsetele DNA polümeraasidele I ja III on bakterites veel mitmeid polümeraase, mis on vajalikud replikatsiooni läbiviimiseks tingimustes, kus replikatiivsed polümeraasid selleks võimelised ei ole. Näiteks DNA polümeraas V ja IV. Nad erinevad replikatiivsetest polümeraasidest selle poolest, et neil puudub 3' – 5' eksonukleaasne aktiivsus. Seepärast on nende polümeraaside poolt läbiviidav DNA replikatsioon vigaderohke. Nende aktiivtsenter on sellise struktuuriga, mis võimaldab mahutada sinna DNA kahjustuste tulemusena tekkinud modifitseeritud nukleotiide. Need omadused võimaldavad DNA kahjustustelt üle hüpata ja replikatsioon et peatu ning bakter jääb ellu.

Viited

Kategooria:Bioloogia