Τεχνολογίες ομικής single-cell

Η αλληλούχηση σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου (single-cell sequencing) είναι μια τεχνολογία που επιτρέπει την ανάλυση του γονιδιώματος ή του μεταγραφώματος ξεχωριστών κυττάρων παρέχοντας υψηλής ανάλυσης δεδομένα για τη μοριακή τους κατάσταση. Σε αντίθεση με τη μαζική αλληλούχηση (bulk sequencing), στην οποία εξετάζεται το μέσο σήμα από έναν πληθυσμό κυττάρων, η single-cell προσέγγιση αναδεικνύει την ετερογένεια που εμφανίζεται μεταξύ διαφορετικών κυττάρων του ίδιου ιστού ενός οργανισμού. Η τεχνική αυτή προσδίδει την ικανότητα αναγνώρισης σπάνιων κυτταρικών τύπων, τη μελέτη μεταβατικών φάσεων κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων, αλλά και την κατανόηση μηχανισμών σε πολύπλοκα βιολογικά συστήματα.
Εικόνα 1. Επισκόπηση των διαδικασιών της single-cell RNA sequencing.

Οι πρώτες επιτυχημένες εφαρμογές single-cell transcriptomics εμφανίστηκαν το 2010 με το εργο των Tang et al. να θεωρείται ορόσημο για την πλήρη αλληλούχηση μεταγραφώματος από μεμονωμένα κύτταρα. Αρχικά, οι μέθοδοι ήταν περιορισμένες σε αριθμό κυττάρων και ο βαθμός ευαισθησίας ήταν αρκετά χαμηλός· με την πρόοδο των τεχνολογιών αλληλούχησης νέας γενιάς, NGS έγινε δυνατή η ανάλυση πολυάριθμων κυττάρων ταυτόχρονα.

Γενικά, η single-cell αλληλούχηση έχει επηρεάσει ολοσχερώς  την κατανόηση των βιολογικών συστημάτων αποκαλύπτοντας ετερογένεια σε κυτταρικό επίπεδο που μέχρι τώρα δεν ήταν ορατή. Οι μελλοντικές προκλήσεις περιλαμβάνουν πρωταρχικά τη μείωση του κόστους, αλλά και τη βελτίωση της ακρίβειας των εφαρμογών για την ανάπτυξη αποδοτικότερων εργαλείων.

 Βασικές εφαρμογές 
Οι εφαρμογές της επεκτείνονται σε πολλούς τομείς: στην αναπτυξιακή βιολογία για την παρακολούθηση της διαφοροποίησης των βλαστοκυττάρων· στη νευροβιολογία για τη χαρτογράφηση των διαφορετικών νευρωνικών πληθυσμών και στην ανοσολογία για τη μελέτη της ποικιλίας της πλαστικότητας των ανοσοκυττάρων. 
Εικόνα 2. Εφαρμογές των τεχνολογιών της αλληλούχησης single-cell.(A) Εμβρυική ανάπτυξη. (B) Ανάπτυξη ιστών και οργάνων. (Γ) Ογκολογία. (Δ) Ανοσολογία. (E) TCM έρευνες.

Επιπλέον, εφαρμόζεται και στη βιολογία των φυτών ολοένα και περισσότερο, στην οποία χρησιμοποιείται για τη χαρτογράφηση κυτταρικών τύπων σε ρίζες, φύλλα και άλλα όργανα συμβάλλοντας στην κατανόηση της ανάπτυξης, της φυσιολογίας και των μηχανισμών απόκρισης σε περιβαλλοντικούς στρεσογόνους παράγοντες, όπως ξηρασία ή παθογόνα. Έτσι, η τεχνολογία αυτή αποτελεί ένα εργαλείο-κλειδί για την ευρύτερη βιολογική έρευνα και τη γεωργία ακριβείας.

Η single-cell αλληλούχηση βασίζεται σε 3 βασικά στάδια:

 Απομόνωση των μεμονωμένων κυττάρων,
 Ενίσχυση του γενετικού υλικού 
 Συλλογή δεδομένων μέσω της αλληλούχησης

Ανάλογα με την προσέγγιση, μπορούν να παραχθούν δεδομένα τα οποία εντάσσονται σε διαφορετικά επίπεδα “omics” παρέχοντας τελικά μια πολυδιάστατη εικόνα της κυτταρικής λειτουργίας.

 Μηχανήματα αλληλούχησης 
Η πιο διαδεδομένη πλατφόρμα για ανάλυση single-cell δεδομένων είναι η Illumina η οποία προσφέρει υψηλή ακρίβεια, αλλά υπάρχει περιορισμός στο μήκος των αναγνώσεων. Έπειτα, η εφαρμογή Genomics Chromium έχει καθιερωθεί για αναλύσεις scRNA-seq, καθώς επιτρέπει την αποδοτική απομόνωση, αλλά και δημιουργία barcode για χιλιάδες κύτταρα ταυτόχρονα. Τέλος, οι εφαρμογές PacBio και Oxford Nanopore προσφέρουν long-read sequencing που επιτρέπουν την ανάλυση πλήρων μεταγραφικών ισομορφών, αν και με υψηλότερο ποσοστό σφαλμάτων από την Illumina.

 Επισκόπηση πειραματικής πορείας που προηγείται της ανάλυσης δεδομένων single-cell 
Η διαδικασία παραγωγής δεδομένων σε επίπεδο μοναδιαίων κυττάρων (single-cell) από βιολογικά δείγματα ιστών απαιτεί πολλαπλά, διαδοχικά στάδια. Τυπικές ροές εργασίας περιλαμβάνουν τη διάσπαση των ιστών σε μεμονωμένα κύτταρα, την απομόνωση των μοναδιαίων κυττάρων, την κατασκευή βιβλιοθήκης και την αλληλούχηση.

Πρώτο βήμα αποτελεί η δημιουργία εναιωρήματος μεμονωμένων κυττάρων μέσω της διαδικασίας διαχωρισμού μοναδιαίων κυττάρων (single-cell dissociation), κατά την οποία ο στερεός ιστός υφίσταται ενζυμική πέψη. Εναλλακτικά, μπορούν να εφαρμοστούν χημικές ή μηχανικές μέθοδοι διαχωρισμού, ενώ πιο πρόσφατα έχουν αναπτυχθεί και συσκευές μικρορευστονικής για τον ίδιο σκοπό. Οι υγρές βιοψίες (π.χ. περιφερικό αίμα) θεωρούνται δείγματα απλούστερα στη διαχείρισή τους, καθώς προϋποθέτουν μόνο ένα στάδιο συμπύκνωσης του υλικού. Στη συνέχεια, ακολουθεί η απομόνωση των μοναδιαίων κυττάρων (single-cell isolation), η οποία πραγματοποιείται με διαφορετικούς τρόπους, ανάλογα με το επιλεγμένο πρωτόκολλο. Σήμερα, οι προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση μοναδιαίων κυττάρων περιλαμβάνουν την περιοριστική αραίωση (limiting dilution), τη μικροχειριστική απομόνωση (micromanipulation), τη μικροδιάτμηση με λέιζερ (laser capture microdissection, LCM), την κυτταρομετρία ροής ενεργοποιημένης από φθορισμό (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS) και την τεχνολογία μικρορευστονικής (microfluidics). Στις τεχνικές που βασίζονται σε πλάκες (plate-based), κάθε κύτταρο απομονώνεται σε ξεχωριστό φρεάτιο, ενώ στις τεχνικές που βασίζονται σε σταγονίδια (droplet-based) η απομόνωση επιτυγχάνεται μέσω ενθυλάκωσης κάθε κυττάρου σε ξεχωριστό μικρορευστονικό σταγονίδιο. Σε κάθε περίπτωση είναι δυνατόν να προκύψουν σφάλματα, όπως η ταυτόχρονη σύλληψη πολλών κυττάρων στο ίδιο φρεάτιο/σταγονίδιο, η απομόνωση μη βιώσιμων κυττάρων ή η μη απομόνωση κανενός κυττάρου (κενά φρεάτια/σταγονίδια).

Σε κάθε φρεάτιο ή σταγονίδιο βρίσκονται, επίσης, τα απαραίτητα χημικά αντιδραστήρια για τη λύση των κυτταρικών μεμβρανών και την κατασκευή βιβλιοθήκης αλληλούχησης. Στην περίπτωση ενίσχυσης του RNA, τα ενδοκυττάρια μόρια mRNA αιχμαλωτίζονται και μεταγράφονται αντίστροφα σε cDNA. Επειδή τα κύτταρα επεξεργάζονται μεμονωμένα, τα μόρια νουκλεϊκού οξέος από κάθε κύτταρο επισημαίνονται με έναν κυτταρικό γραμμωτό κώδικα (cellular barcode), ειδικό για το φρεάτιο ή το σταγονίδιο. Αρκετά πρωτόκολλα προσθέτουν επιπλέον σε κάθε μόριο mRNA ένα μοναδικό μοριακό αναγνωριστικό κωδικό (unique molecular identifier, UMI). Το cDNA, στην περίπτωση ανάλυσης του μεταγραφώματος, ή το DNA, στην περίπτωση ανάλυσης του γονιδιώματος, ενισχύονται πριν από την αλληλούχηση ώστε να αυξηθεί η πιθανότητα ανίχνευσής τους. Ο πολλαπλασιασμός του DNA γίνεται μέσω ενίσχυσης ολόκληρου του γονιδιώματος (whole-genome amplification, WGA). Η χρήση UMIs εφαρμόζεται για το RNA και επιτρέπει τη διάκριση μεταξύ ενισχυμένων αντιγράφων του ίδιου mRNA μορίου και διαβασμάτων (reads) που προέρχονται από ξεχωριστά mRNA μόρια του ίδιου γονιδίου. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι, στην περίπτωση της πρωτεωμικής μοναδιαίων κυττάρων, η πρόκληση της ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών μέσω αλληλούχησης αντιμετωπίζεται με την αξιοποίηση της σύνδεσης ειδικών αντισωμάτων με ολιγονουκλεοτίδια, μέσω των οποίων επιτυγχάνεται μετατροπή και ενίσχυση του σήματος.

Μετά τη δημιουργία τους, οι βιβλιοθήκες επισημαίνονται με κυτταρικά barcodes και, ανάλογα με το πρωτόκολλο, με UMIs. Στη συνέχεια, συνδυάζονται όλες μαζί (multiplexed) για την αλληλούχηση. Από την αλληλούχηση παράγονται, ως δεδομένα, διαβάσματα (read data), τα οποία υποβάλλονται σε βιοπληροφορική ανάλυση. Η προ-επεξεργασία των δεδομένων περιλαμβάνει έλεγχο ποιότητας (quality control), ομαδοποίηση βάσει των αποδοθέντων barcodes (demultiplexing), στοίχιση (alignment) σε γονιδιώματα αναφοράς με χρήση οργανωμένων ροών εργασίας (pipelines) και δημιουργία πινάκων γονιδιακής έκφρασης (expression matrices). Σε πρωτόκολλα που βασίζονται σε UMIs, τα δεδομένα από τα διαβάσματα (reads) μπορούν να ομαδοποιηθούν περαιτέρω, επιτρέποντας την ποσοτική καταμέτρηση των συλληφθέντων mRNA μορίων (count data). Τα εργαλεία για την ανάλυση των δεδομένων είναι γραμμένα σε διάφορες γλώσσες προγραμματισμού, με τις πιο διαδεδομένες να είναι η R και η Python.

 Τεχνολογίες ομικής αλληλούχησης 

 Γονιδιωματική (Genomics) 

 scWGS (single-cell Whole Genome Sequencing): Ολική αλληλούχηση του γονιδιώματος σε μεμονωμένα κύτταρα για ανίχνευση μεταλλάξεων.
 scWES (single-cell Whole Exome Sequencing): Aλληλούχιση μόνο των κωδικών περιοχών του DNA ανά κύτταρο.
 scCNV-seq (single-cell DNA copy number variation Sequencing): Στοχευμένη ανάλυση αριθμού αντιγράφων DNA σε μεμονωμένα κύτταρα.
 scMethyl-seq (scBS-seq / scRRBS ): Ανίχνευση μοτίβων μεθυλίωσης DNA σε επίπεδο ενός κυττάρου. Η scBS επιτρέπει τον προσδιορισμό μεθυλιώσεων DNA σε επίπεδο μονών base pairs 5, ενώ η scRRBS βασίζεται στο reduced representation bisulfite sequencing, όπου το γονιδίωμα υπόκειται σε πέψη από περιοριστικές ενδονουκλεάσες.
 scHi-C (single-cell chromatin conformation): Χαρτογράφηση τρισδιάστατης - δομικής οργάνωσης του γονιδιώματος ανά κύτταρο.

 Μεταγραφομική (Transcriptomics) 

 Smart-seq / Smart-seq2 / Smart-seq3: Ολική αλληλούχηση cDNA (full-length transcripts) από ένα κύτταρο. Η Smart-seq2 αποτελεί βελτιωμένο πρωτόκολλο Smart-seq με αυξημένη ευαισθησία & ομοιομορφία, ενώ η Smart-seq3 ενσωματώνει unique molecular identifiers (UMIs) και καλύτερη ανίχνευση transcript isoforms.
 CEL-Seq / CEL-Seq2: Barcoding + αλληλούχηση 3’ άκρων RNA εκατοντάδων κύτταρων. Η βελτιωμένη CEL-Seq2 χρησιμοποιεί UMIs (Unique Molecular Identifiers) και τυχαίους εκκινητές για αντίστροφη μεταγραφή.
 Drop-seq: Encapsulation κυττάρων & beads σε σταγονίδια για scRNA-seq υψηλής κλίμακας.
 10x Genomics Chromium scRNA-seq: Εμπορική πλατφόρμα microfluidics για scRNA-seq χιλιάδων κυττάρων.
 Fluidigm C1: αυτοματοποιημένη πλατφόρμα microfluidics για σύλληψη μεμονωμένων κυττάρων και προετοιμασία βιβλιοθηκών.
 Seq-Well: Microwell array για μαζική προετοιμασία scRNA-seq.
 Microwell-seq: Απλοποιημένο microwell scRNA-seq για μεγάλους αριθμούς κυττάρων.
 MARS-seq: scRNA-seq με μοναδικούς μοριακούς δείκτες (UMIs) για ακριβή ποσοτικοποίηση.
 Split-seq: Barcoding σε κύκλους (rounds) χωρίς φυσική απομόνωση κυττάρων (εντός κυττάρου).

 Χωρική μεταγραφομική (Spatial Transcriptomics) 

 MERFISH: Πολυπλεξική (multiplex) FISH με διόρθωση σφαλμάτων για απευθείας ποσοτικοποίηση και οπτικοποίηση RNA σε ιστό.
 seqFISH+: FISH για δεκάδες-χιλιάδες γονίδια σε κύτταρα in situ.
 Slide-seq / Slide-seqV2: RNA από ιστό προσδένεται σε πυκνό πλέγμα barcoded beads, παρέχοντας πληροφορίες για χωρική διαφορική έκφραση.
 HDST: Υψηλής ανάλυσης χωρική αποτύπωση μεταγραφώματος.

 Επιγονιδιωματική (Epigenomics) 

 scATAC-seq (chromatin accessibility): Μέτρηση περιοχών ευχρωματίνης σε ένα κύτταρο.
 scChIP-seq (histone modifications): Καταγραφή επιγενετικών τροποποιήσεων της χρωματίνης σε μεμονώμενα κύτταρα.
 scCUT&Tag / scCUT&RUN: τεχνολογίες χαρτογράφησης χρωματίνης που χρησιμοποιούν αντισώματα για να χαρτογραφήσουν αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-DNA ή τροποποιήσεις ιστονών στο γονιδίωμα.

 Πρωτεομική (Proteomics) 

 CyTOF (mass cytometry): Μέτρηση δεκάδων πρωτεΐνες ανά κύτταρο (κυτταρομετρία) με αντισώματα δεσμευμένα σε ισότοπα μέταλλων.
 SCoPE-MS: Single-cell proteomics με χρήση φασματομετρίας μάζας.
 Perturb-seq (CRISPR perturbations + scRNA-seq): CRISPR-based παρεμβάσεις και ανάλυση scRNA-seq για λειτουργική χαρτογράφηση. Μετρώντας ταυτόχρονα το sgRNA που επιδρά σε γονίδια και τον μεταγραφωμικό φαινότυπο για κάθε κύτταρο, προσδιορίζεται πώς συγκεκριμένες γονιδιακές μεταλλάξεις επηρεάζουν τις κυτταρικές διεργασίες σε μεγάλη κλίμακα.

 Πολυ-ομική ανάλυση (Multi-omics) 

 CITE-seq: Συνδυάσμος scRNA-seq με μέτρηση πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης (εξωκυτταρική πλευρά) μέσω barcoded αντισωμάτων.
 ECCITE-seq (scRNA + πρωτεΐνες + CRISPR guides): Επέκταση του CITE-seq με CRISPR guide tracking και TCR/BCR sequencing.
 SNARE-seq (scRNA + scATAC): Ταυτόχρονη ανάλυση μεταγραφώματος και προσβασιμότητας χρωματίνης (ATAC) στο ίδιο κύτταρο.
 scNMT-seq: Συνδυασμός μεταγράφωματος, μεθυλίωσης DNA και πρόσβασης χρωματίνης στο ίδιο κύτταρο.
 TEA-seq: Συνδυασμός μεταγραφώματος, επιτόπων (πρωτεΐνες) και προσβασιμότητας χρωματίνης στο ίδιο κύτταρο.

 Ανάλυση δεδομένων 
Οι βιοπληροφορικές μέθοδοι στη Single-Cell ομική αντιμετωπίζουν προκλήσεις όπως αραιότητα (scarcity) δεδομένων, θόρυβος, batch effects, και multimodal integration. Κοινές ροές εργασίας περιλαμβάνουν προεπεξεργασία, μείωση διαστάσεων, ομαδοποίηση, σχολιασμό, trajectory inference, και λειτουργική ανάλυση.
Εικόνα 3. Σχηματική απεικόνιση μιας τυπικής ροής εργασίας ανάλυσης scRNA-seq

Κάθε στάδιο (χωρισμένο με διακεκομμένες γραμμές) αποτελείται από έναν αριθμό συγκεκριμένων βημάτων, πολλά από τα οποία λειτουργούν πάνω σε -και τροποποιούν- ένα αντικείμενο SingleCellExperiment.

 Προεπεξεργασία και Έλεγχος Ποιότητας (QC) 
Ο έλεγχος ποιότητας (QC) και η προεπεξεργασία δεδομένων είναι κρίσιμα αρχικά βήματα στις ροές εργασίας single-cell omics, στοχεύοντας στον εντοπισμό και τη μείωση τεχνικών artifacts, θορύβου και μεροληψιών που θα μπορούσαν να στρεβλώσουν downstream αναλύσεις όπως ομαδοποίηση, διαφορική έκφραση ή trajectory inference. Αυτά τα βήματα αντιμετωπίζουν προκλήσεις εγγενείς στα single-cell δεδομένα, όπως ανεπάρκεια (sparsity), γεγονότα «dropout» (όπου τα γονίδια αποτυγχάνουν να ανιχνευθούν λόγω χαμηλής απομόνωσης mRNA), επιμόλυνση από ambient RNA, και batch effects από πειραματικό variation. Από το 2025, δίνεται έμφαση στην αυτοματοποίηση, omics-specific metrics, και στην ενσωμάτωση μηχανικής μάθησης για κλιμάκωση σε μεγάλα datasets (π.χ. εκατομμύρια κύτταρα).

Ο έλεγχος ποιότητας (QC) στη single-cell ομική παίζει κρίσιμο ρόλο στη διασφάλιση της αξιοπιστίας των downstream αναλύσεων μέσω της αξιολόγησης της βιωσιμότητας των κυττάρων και της ακεραιότητας των δεδομένων μέσα από μια σειρά ποσοτικών μετρικών, καταλήγοντας τελικά στο φιλτράρισμα κυττάρων υψηλής ποιότητας για περαιτέρω μελέτη. Αυτά τα κατώφλια εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τις ιδιαιτερότητες του συνόλου δεδομένων και της υποκείμενης βιολογίας, όπως ο τύπος ιστού ή ο οργανισμός που εμπλέκεται, και συχνά απεικονίζονται καλύτερα με violin plots ή scatter plots που απεικονίζουν γονίδια ανά κύτταρο έναντι μοναδικών μοριακών identifiers (UMIs).

Στον πυρήνα του, οι γενικές μετρικές QC περιστρέφονται γύρω από την αξιολόγηση της βιωσιμότητας και του περιεχομένου των κυττάρων. Για παράδειγμα, ο αριθμός των γονιδίων ή χαρακτηριστικών που ανιχνεύονται ανά κύτταρο λειτουργεί ως βασικός δείκτης· μετρήσεις κάτω από 200 έως 500 γονίδια μπορεί να δείχνουν άδεια σταγονίδια ή αποπτωτικά κύτταρα, ενώ υπερβολικά υψηλές μετρήσεις που υπερβαίνουν τα 25.000 έως 30.000 μπορεί να σηματοδοτούν «διπλά» — ουσιαστικά δύο κύτταρα που συνελήφθησαν κατά λάθος ως ένα. Ιδανικά, για single-cell αλληλούχηση RNA (scRNA-seq), στόχο θα αποτελούσε ένα εύρος 1.000 έως 10.000 γονιδίων ανά κύτταρο. Παρομοίως, το σύνολο των UMIs ή reads ανά κύτταρο αντικατοπτρίζει το βάθος αλληλούχησης, και είναι συνήθης πρακτική να φιλτράρονται όποια κύτταρα πέφτουν κάτω από 500 έως 1.000 UMIs για να αποτραπούν προβλήματα από under-sampling. Μια άλλη σημαντική μετρική είναι το ποσοστό των μιτοχονδριακών γονιδίων, όπου τα αυξημένα επίπεδα — συνήθως πάνω από 5% έως 20% — μπορούν να σηματοδοτούν καταπονημένα ή αποπτωτικά κύτταρα, καθώς τα κατεστραμμένα κύτταρα τείνουν να απελευθερώνουν μιτοχονδριακά περιεχόμενα· αυτό υπολογίζεται εύκολα διαιρώντας τις μετρήσεις των μιτοχονδριακών γονιδίων με τις συνολικές μετρήσεις και πολλαπλασιάζοντας επί 100.

Η ανίχνευση «διπλών» ή «πολλαπλών» είναι εξίσου σημαντική, καθώς αυτά τα τεχνουργήματα μπορούν να αυξήσουν τεχνητά τις μετρήσεις γονιδίων και να θολώσουν την πραγματική ετερογένεια των κυττάρων. Κοινές προσεγγίσεις περιλαμβάνουν εργαλεία βασισμένα σε προσομοιώσεις όπως Scrublet ή DoubletFinder, τα οποία δημιουργούν συνθετικά «διπλά» από τα παρατηρούμενα δεδομένα και βαθμολογούν μεμονωμένα κύτταρα με βάση το πόσο κοντά μοιάζουν σε αυτές τις προσομοιώσεις. Μέθοδοι βασισμένες σε μηχανική μάθηση, όπως Solo ή scDblFinder, κάνουν ένα βήμα παραπέρα εφαρμόζοντας ταξινομητές (classifiers) εκπαιδευμένους σε αυτά τα συνθετικά διπλά για πιο ακριβή αναγνώριση. Ανάλογα με την απόδοση εγκλεισμού — συχνά υψηλότερη σε πλατφόρμες τύπου σταγονιδίων όπως η 10x Genomics — το αναμενόμενο ποσοστό «διπλών» μπορεί να κυμαίνεται από 1% έως 10%.

Το ambient RNA παρουσιάζει έναν ακόμη κίνδυνο επιμόλυνσης. To ελεύθερο RNA από λυμένα κύτταρα διαρρέει μέσα στα σταγονίδια, και εργαλεία όπως το SoupX ή το EmptyDrops βοηθούν να μετριαστεί αυτό εκτιμώντας τα περιβαλλοντικά προφίλ από ελέγχους άδειων σταγονιδίων και αφαιρώντας τα ανάλογα. Σε δείγματα που προέρχονται από αίμα ή ιστό, είναι επίσης συνετό να φιλτραριστούν τα ερυθροκύτταρα ή τα σήματα που σχετίζονται με την αιμοσφαιρίνη στοχεύοντας κύτταρα με ασυνήθιστα υψηλή έκφραση γονιδίων αιμοσφαιρίνης για να εξαλειφθεί η επιμόλυνση από ερυθρά αιμοσφαίρια. Όταν πρόκειται για ελέγχους QC ειδικούς ανά ομική τεχνολογία, κάθε υποκατηγορία απαιτεί το δικό της σύνολο προσαρμοσμένων μετρικών για να ληφθούν υπόψη οι μοναδικές προκλήσεις του επιπέδου δεδομένων. Στο scRNA-seq για τη μεταγραφωμική, για παράδειγμα, τα κύτταρα φιλτράρονται συνήθως σε εκείνα που εκφράζουν μεταξύ 200 και 25.000 γονιδίων, με περιεχόμενο μιτοχονδρίων κάτω από 5% και τα ριβοσωμικά γονίδια να αποτελούν τουλάχιστον 15% για να επιβεβαιωθεί η βιωσιμότητα· επιπλέον, οι επιδράσεις του κυτταρικού κύκλου μπορούν να αξιολογηθούν χρησιμοποιώντας γονίδια-δείκτες — ίσως μέσω της λειτουργίας CellCycleScoring του Seurat — και να αφαιρεθούν με παλινδρόμηση αν αλλοιώνουν τα αποτελέσματα λόγω σημάτων proliferation. Για το scATAC-seq στην επιγενωμική, η προσοχή μετατοπίζεται σε μετρικές όπως enrichment score της θέσης έναρξης μεταγραφής (TSS) πάνω από 2 έως 4, nucleosome signal κάτω από 4, θραύσματα μέσα σε κορυφές που υπερβαίνουν τα 3.000 έως 20.000, και αναλογία περιοχών blacklist κάτω από 0,05, όλα τα οποία βοηθούν στον εντοπισμό πυρήνων χαμηλής ποιότητας ή πιθανών διπλών. Στη singe-cell πρωτεωμική, όπως με το CyTOF, τα δεδομένα συχνά υφίστανται μετασχηματισμό arcsine χρησιμοποιώντας συντελεστή (cofactor) 5 για κλιμάκωση δεικτών, μαζί με δείκτες μη-πλεονασμού (non-redundancy scores) για να μετρηθεί η μεταβλητότητα και ανίχνευση ακραίων τιμών μέσω υπολογισμών απόστασης δείγματος. Ο έλεγχος ποιότητας στη ροή κυτταρομετρίας, εντωμεταξύ, βασίζεται σε αυτοματοποιημένο gating για να αποκλειστεί το υπόλειμμα και τα διπλά — βλέπε διαγράμματα forward scatter area (FSC-A) έναντι side scatter area (SSC-A) — ακολουθούμενο από μετασχηματισμό arcsine με συντελεστή 150 και απεικονίσεις βασισμένες σε πυκνότητα για την ποιότητα των δεικτών. Η χωρική μεταγραφωμική προσθέτει παραμέτρους σε επίπεδο θέσης, όπως να εξασφαλίζεται ότι οι μετρήσεις RNA ανά spot υπερβαίνουν τις 500 έως 1.000 ενώ επαληθεύεται η ευθυγράμμιση της εικόνας, και το φιλτράρισμα spots χαμηλού μοριακού φορτίου για να αποφευχθούν φαινόμενα άκρων. Για single-cell immune profiling των υποδοχέων Τ-κυττάρων (TCR) ή Β-κυττάρων (BCR), η αφθονία των κλωνοτύπων και CDR3 length distributions εξετάζονται διεξοδικά, με μόνο εκείνους τους κλωνότυπους που υποστηρίζονται από τουλάχιστον δύο reads ανά κύτταρο να διατηρούνται.

Πέρα από αυτούς τους ελέγχους, η προεπεξεργασία δεδομένων είναι ουσιώδης για τη μετατροπή των ακατέργαστων μετρήσεων σε πίνακες έτοιμους για ανάλυση, με ισχυρή έμφαση στην κανονικοποίηση, την κλιμάκωση και την επιλογή χαρακτηριστικών για την αντιστάθμιση τεχνικής μεταβλητότητας. Η κανονικοποίηση σε μεγέθος βιβλιοθήκης είναι ένα θεμελιώδες βήμα, όπου οι μετρήσεις κλιμακώνονται σε σχέση με το σύνολο των UMIs ανά κύτταρο — συχνά εκφρασμένες ως μετρήσεις ανά εκατομμύριο (CPM) — και μετά λογαριθμοποιούνται (χρησιμοποιώντας log1p) για να εξομαλυνθεί η διακύμανση, αν και αυτή η βασική προσέγγιση δεν αντιμετωπίζει πλήρως την υπερδιασπορά σε αραιά δεδομένα. Πιο εξελιγμένες τεχνικές προσφέρουν καλύτερη διαχείριση του θορύβου· η SCTransform του Seurat, για παράδειγμα, εφαρμόζει κανονικοποιημένη αρνητική διωνυμική παλινδρόμηση για να μοντελοποιήσει τεχνικά αποτελέσματα και να πετύχει την σταθεροποίηση διακύμανσης χωρίς να χρειάζονται spike-ins, κάτι που την καθιστά ιδιαίτερα κατάλληλη για scRNA-seq. Εναλλακτικές όπως sctransform ή scran από το R/Bioconductor χρησιμοποιούν στρατηγικές pooling για εκτίμηση συντελεστών μεγέθους, αποδεικνύοντας ανθεκτικότητα έναντι της ανεπάρκειας δεδομένων.Σε περιβάλλοντα πρωτεωμικής ή ροής κυτταρομετρίας, η κανονικοποίηση median ratio εμπνευσμένη από το DESeq2 αποτελούν ανερχόμενες προσεγγίσεις. Προσαρμογές ειδικές για ομική ολοκληρώνουν αυτό το στάδιο, όπως στάθμιση TF-IDF για κορυφές scATAC-seq για να τονιστεί η συχνότητα όρων σε σχέση με την αντίστροφη συχνότητα εγγράφου (inverse document frequency), ή ποσοστιαία (quantile) κανονικοποίηση για να εναρμονιστούν πολυ-ομικά σύνολα δεδομένων.

Μετά τον έλεγχο ποιότητας, η αντιμετώπιση των batch effects είναι ένα κρίσιμο βήμα για τον μετριασμό τεχνικών παραλλαγών που προκύπτουν από παράγοντες όπως διαφορετικές πειραματικές πορείες ή δείγματα δωρητών. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες μέθοδοι για τη διόρθωση των επιδράσεων παρτίδας. Η Κανονική Ανάλυση Συσχέτισης (Canonical Correlation Analysis, CCA) ή οι Αμοιβαίοι Πλησιέστεροι Γείτονες (Mutual Nearest Neighbors, MNN), λειτουργούν ευθυγραμμίζοντας κοινούς υποχώρους (shared subspaces) μεταξύ συνόλων δεδομένων για να τα εναρμονίσουν.

Μέθοδοι βασισμένες σε «άγκυρες» (Anchor-based) όπως το Harmony ή το fastMNN ολοκληρώνουν δεδομένα ταυτοποιώντας αμοιβαίες άγκυρες, κάτι που βοηθά στη διατήρηση των υποκείμενων βιολογικών σημάτων ενώ διορθώνει τον τεχνικό θόρυβο. Για πιο πολύπλοκα ή θορυβώδη σύνολα δεδομένων, τεχνικές βαθιάς μάθησης όπως οι αυτοκωδικοποιητές (autoencoders) τύπου SAUCIE ή οι παραλλαγές αυτοκωδικοποιητών (variational autoencoders) μπορεί να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικές, καθώς μαθαίνουν λανθάνουσες αναπαραστάσεις για να ενοποιήσουν τα δεδομένα. Οι βέλτιστες πρακτικές συστήνουν την εφαρμογή διόρθωσης επιδράσεων παρτίδας μόνο αφού ολοκληρωθεί ο ποιοτικός έλεγχος κάθε μεμονωμένου δείγματος και την επικύρωση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιώντας απεικονίσεις UMAP για να διασφαλιστεί ότι δεν έχει συμβεί υπερ-διόρθωση, η οποία θα μπορούσε αθέλητα να διαγράψει ουσιώδεις βιολογικές διαφορές, όπως εκείνες που συνδέονται με διακριτούς δωρητές.

 Απλοποιημένη Μείωση Διαστάσεων (dimensionality) 
Στη singe-cell ομική, η επιλογή χαρακτηριστικών και η μείωση διαστάσεων είναι κρίσιμες για τη μετατροπή δεδομένων υψηλών διαστάσεων — συχνά χιλιάδες γονίδια ή κορυφές ανά κύτταρο — σε χαμηλότερες διαστάσεις που διατηρούν τη βιολογική δομή ενώ επιτρέπουν απεικόνιση, ομαδοποίηση και downstream αναλύσεις. Αυτές οι μέθοδοι αντιμετωπίζουν την «κατάρα της διαστατικότητας» ("curse of dimensionality"), όπου η ανεπάρκεια δεδομένων και η υπολογιστική πολυπλοκότητα δημιουργούν προκλήσεις.

 Επιλογή Χαρακτηριστικών (Feature Selection) 
Η επιλογή χαρακτηριστικών αρχίζει με τον εντοπισμό εξαιρετικά μεταβλητών γονιδίων (HVGs) ή χαρακτηριστικών (highly variable features), συνήθως των κορυφαίων 2.000–5.000 γονίδιων με υψηλή διασπορά (διακύμανση διαιρεμένη με μέσο όρο).

Εργαλεία όπως το FindVariableFeatures του Seurat ή το decomposeVariance του scran δίνουν προτεραιότητα σε βιολογικά πληροφοριακά χαρακτηριστικά, μειώνοντας τον θόρυβο και το υπολογιστικό φορτίο (computational burden).

 Τεχνικές Μείωσης Διαστάσεων 

 Γραμμικές Μέθοδοι 
Η Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (Principal Component Analysis, PCA) είναι ένα κοινό σημείο εκκίνησης, εφαρμοσμένο σε λογαριθμοποιημένα - κανονικοποιημένα δεδομένα για να συλλάβει την παγκόσμια διακύμανση (global variance). Συνήθως διατηρούνται οι κορυφαίες 50 κύριες συνιστώσες για να δημιουργηθεί ένα γραμμικό ενσωμάτωμα (embedding), που λειτουργεί ως ισχυρή είσοδος για downstream εργασίες. Η PCA είναι γρήγορη και ερμηνεύσιμη αλλά υποθέτει γραμμικότητα, χάνοντας ενδεχομένως πολύπλοκες σχέσεις.

Για το scATAC-seq, η Λανθάνουσα Σημασιολογική Ευρετηρίαση (Latent Semantic Indexing, LSI) εφαρμόζει αποσύνθεση τύπου PCA σε αραιούς πίνακες σταθμισμένους με TF-IDF, μειώνοντας διαστάσεις σχετικές με την προσβασιμότητα κορυφών. Καινοτομίες όπως η SMOPCA επεκτείνουν την PCA ενσωματώνοντας χωρική επίγνωση (spatial awareness) για πολυ-ομικά δεδομένα, ευθυγραμμίζοντας ενσωματώσεις ενώ διατηρούν τη γεωμετρία του ιστού.

 Μη Γραμμικές Μέθοδοι 
Οι μη-γραμμικές μέθοδοι συλλαμβάνουν τοπικές και καθολικές δομές που οι γραμμικές μπορεί να παραβλέπουν. Η t-SNE διατηρεί τοπικές ομοιότητες ελαχιστοποιώντας τη διασπορά Kullback–Leibler, καθιστώντας την ιδανική για απεικόνιση αλλά αργή και μη-ντετερμινιστική για μεγάλα σύνολα δεδομένων, συχνά παραμορφώνοντας τη γενική δομή.

Η UMAP, μια μέθοδος βασισμένη σε γράφημα, βελτιστοποιεί την διασταυρούμενη εντροπία (cross-entropy) για να ισορροπήσει τοπικές και καθολικές σχέσεις, προσφέροντας ανώτερη ταχύτητα και επεκτασιμότητα. Με παραμέτρους ρυθμιζόμενες όπως n_neighbors (15–50) και min_dist (0.1–0.3), η UMAP είναι προεπιλεγμένο εργαλείο απεικόνισης στο Seurat και στο Scanpy. Για πολυ-ομική ολοκλήρωση (integration), μέθοδοι όπως το CellMentor δημιουργούν κοινές ενσωματώσεις σε διαφορετικές υποκατηγορίες (π.χ. RNA και ATAC) μαθαίνοντας modality-specific weights για κάθε υποκατηγορία για να εναρμονίσουν θορυβώδη σήματα και να ενισχύσουν τη συνέπεια τύπων κυττάρων.

 Ενσωματώσεις: Φασματικές και Βασισμένες σε Γράφημα 
Οι μέθοδοι βασισμένες σε γράφημα, όπως η φασματική ενσωμάτωση, αξιοποιούν γραφήματα Laplace αλλά παραδοσιακά κλιμακώνονται μη αποδοτικά (κόστος O(n²)).

Παραλλαγές χωρίς πίνακες (matrix-free) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Lanczos επιτρέπουν υπολογισμό γραμμικού χρόνου, κατάλληλο για σύνολα δεδομένων εκατομμυρίων κυττάρων. Εργαλεία όπως το SnapATAC2 υλοποιούν κανονικοποιημένη κατά συνημίτονο φασματική ενσωμάτωση (cosine-normalized) με στάθμιση IDF, υπολογίζοντας επαναληπτικά ιδιοδιανύσματα για να επιλυθεί η ετερογένεια χρωματίνης, συχνά υπερέχοντας της PCA και της UMAP. Οι Χάρτες Διάχυσης (Diffusion maps) και το PHATE διαπρέπουν στη διατήρηση δομών τύπου τροχιάς για αναλύσεις ψευδοχρόνου (pseudotime).

 Ομαδοποίηση (Clustering) και Annotation Κυτταρικών Τύπων 
Η ομαδοποίηση και το annotation κυτταρικών τύπων είναι κρίσιμα βήματα σε ροές εργασίας single-cell ομικής, αποκαλύπτοντας κυτταρική ετερογένεια και λειτουργικές καταστάσεις από ενσωματώσεις υψηλών διαστάσεων όπως οι συντεταγμένες UMAP. Η ομαδοποίηση συγκεντρώνει παρόμοια κύτταρα σε υποπληθυσμούς, ενώ ο σχολιασμός αποδίδει βιολογικές ετικέτες χρησιμοποιώντας γονίδια-δείκτες ή σύνολα αναφοράς.

Αυτές οι διαδικασίες αντιμετωπίζουν προκλήσεις όπως η βελτιστοποίηση της ανάλυσης για αποφυγή υπερ- ή υπο-ομαδοποίησης, η διόρθωση υπολειπόμενων επιδράσεων παρτίδας και η ανίχνευση σπάνιων υποπληθυσμών. Οι εξελίξεις από το 2024 έως το 2025, αξιοποιώντας θεωρία γραφημάτων, μηχανική μάθηση και μεγάλα γλωσσικά μοντέλα (LLMs), έχουν βελτιώσει την ακρίβεια και την επεκτασιμότητα, αφού ενσωματώνονται σε εργαλεία όπως το Seurat και το Scanpy.

 Μέθοδοι Ομαδοποίησης 
Η ομαδοποίηση ξεκινά συνήθως με γραφήματα k-πλησιέστερων γειτόνων (kNN) που χτίζονται από ενσωματώσεις, με παραμέτρους ανάλυσης (0.4–1.2) που ρυθμίζουν την κοκκώδη ανάλυση (granularity).

 Προσεγγίσεις Βασισμένες σε Γράφημα 
Οι μέθοδοι βασισμένες σε γράφημα χρησιμοποιούνται ευρέως για την αποδοτικότητά τους. Ο αλγόριθμος Louvain βελτιστοποιεί την αρθρωτότητα (modularity) για να αναγνωρίσει κοινότητες αλλά μπορεί να παράγει αποσυνδεδεμένα clusters. Η Leiden το αντιμετωπίζει αυτό διασφαλίζοντας συνδεσιμότητα, καθιστώντας την ιδανική για μεγάλα σύνολα δεδομένων. Οι Κοινοί Πλησιέστεροι Γείτονες (Shared Nearest Neighbors, SNN) ενισχύουν την ανθεκτικότητα σταθμίζοντας ακμές βάσει κοινών γειτόνων, μετριάζοντας τον θόρυβο στα δεδομένα scRNA-seq.

 Μέθοδοι Βασισμένες σε Πυκνότητα και Ιεραρχία 
Για πολύπλοκες κατανομές, η HDBSCAN, μια ιεραρχική μέθοδος βασισμένη σε πυκνότητα, διαπρέπει στη διαχείριση μεταβαλλόμενων πυκνοτήτων (varying densities) και ακραίων τιμών χωρίς να απαιτεί προκαθορισμένο αριθμό clusters, καθιστώντας την κατάλληλη για χωρική ομική. Η ιεραρχική ομαδοποίηση με σύνδεση του Ward σε δεδομένα μειωμένα με PCA δημιουργεί δενδρογράμματα για να απεικονιστούν σχέσεις αλλά είναι υπολογιστικά απαιτητική για σύνολα που υπερβαίνουν τις 100.000 κυττάρων.

 Ομαδοποίηση Βασισμένη σε Μηχανική Μάθηση 
Τα Μοντέλα Μείγματος Γκαουσιανών (Gaussian Mixture Models, GMM) παρέχουν πιθανολογικές αναθέσεις υποθέτοντας Γκαουσιανές κατανομές, προσαρμόσιμα στο scATAC-seq μέσω διωνυμικών μειγμάτων. Μέθοδοι βαθιάς μάθησης όπως η DESC χρησιμοποιούν αυτοκωδικοποιητές (autoencoders) για να βελτιώσουν τις αναπαραστάσεις πριν από την ομαδοποίηση, βελτιώνοντας την ανάλυση σε πολυ-ομικά περιβάλλοντα.

 Σχολιασμός Κυτταρικών Τύπων (Cell Type Annotation) 
Ο σχολιασμός συνδέει ομάδες (clusters) ή μεμονωμένα κύτταρα με βιολογικές ταυτότητες. Η χειροκίνητη επισημείωση εντοπίζει γονίδια με διαφοροποιημένη έκφραση (DEGs) ανά ομάδα χρησιμοποιώντας Wilcoxon rank-sum tests, διασταυρώνοντας με γνωστούς δείκτες (π.χ. CD3 για Τ κύτταρα). Αυτοματοποιημένα εργαλεία όπως Enrichr ή g:Profiler απλοποιούν τη διαδικασία αναλύοντας Gene Ontology ή επικαλύψεις οδών. Μέθοδοι βασισμένες σε αναφορά προβάλλουν επισημειώσεις από άτλαντες σε νέα δεδομένα. Το SingleR συσχετίζει προφίλ ερωτήματος με αναφορές, το Azimuth χρησιμοποιεί επιβλεπόμενη ταξινόμηση βασισμένη σε anchors για αποδοτικότητα, και εργαλεία όπως scmap ή Garnett εφαρμόζουν συσχετίσεις Spearman ή SVMs για επισήμανση βασισμένη σε ομοιότητα. Το scPred χρησιμοποιεί SVM classifiers εκπαιδευμένους σε δεδομένα αναφοράς για πολυκατηγορικές προβλέψεις με βαθμούς εμπιστοσύνης. LLMs όπως το GPT-4 επισημαίνουν με βάση περιγραφές γονιδίων-δεικτών, επιτυγχάνοντας 75–95 % ακρίβεια και ενσωματώνονται με Seurat, αν και απαιτείται επικύρωση για πιθανές ανακρίβειες. Πλαίσια αυτοεκπαίδευσης όπως το sICTA χρησιμοποιούν Transformers για επαναληπτική, ερμηνεύσιμη επισημείωση.

 Επαγωγή Τροχιών και Ανάλυση Δυναμικής 
Η επαγωγή τροχιών και η ανάλυση δυναμικής είναι ζωτικές για την αποκωδικοποίηση μεταβάσεων κυτταρικών καταστάσεων σε single-cell omics, ανακατασκευάζοντας χρονικές ή ψευδοχρονικές πορείες από στιγμιότυπα στατικών δεδομένων ώστε να μελετηθεί διαφοροποίηση, ανάπτυξη ή εξέλιξη νόσου. Χρησιμοποιώντας έκφραση γονιδίων, προσβασιμότητα χρωματίνης ή πολυ-omics προφίλ, αυτές οι μέθοδοι αποκαλύπτουν ιεραρχίες γενεαλογίας, εντοπίζουν ρυθμιστικά γονίδια και προβλέπουν μελλοντικές καταστάσεις κυττάρων. Οι εξελίξεις από 2024–2025 δίνουν έμφαση στην ενσωμάτωση multi-omics δεδομένων, στη βελτίωση της κλιμάκωσης και στην εισαγωγή χρονικών ή χωρικών δεικτών για μεγαλύτερη ακρίβεια, συνδεόμενες απρόσκοπτα με εργαλεία όπως Seurat, Scanpy και Monocle.

 Ανάλυση Ψευδοχρόνου (Pseudotime Analysis) 
Η ανάλυση ψευδοχρόνου διατάσσει τα κύτταρα κατά μήκος ενός συνεχούς άξονα που αντικατοπτρίζει βιολογική πρόοδο, όπως διαφοροποίηση. Το Monocle κατασκευάζει τροχιές χρησιμοποιώντας reversed graph embedding, φτιάχνοντας minimum spanning trees ή DDRTrees βασισμένα σε ομοιότητες έκφρασης· υπερέχει σε scRNA-seq αλλά είναι ευαίσθητο στην ποιότητα προεπεξεργασίας. Το Palantir χρησιμοποιεί πιθανοκρατικές διαδικασίες διάχυσης για να μοντελοποιήσει διακλαδώσεις και συγκλίσεις τροχιών, κατάλληλο για ανάδειξη σπάνιων κυτταρικών καταστάσεων. Το Slingshot συνδυάζει ομαδοποίηση με εφαρμογή κύριων καμπυλών για ιχνηλάτηση γραμμικών ή διακλαδιζόμενων γενεαλογιών, προσφέροντας ευελιξία για ποικίλα μοτίβα τροχιάς.

 RNA Velocity και Δυναμική Μοντελοποίηση 
Το RNA velocity συμπεραίνει κατευθυνόμενες αλλαγές κατάστασης κυττάρων αναλύοντας spliced (ματισμένο) έναντι unspliced (μη ματισμένο) mRNA, συλλαμβάνοντας δυναμικές μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο. Το scVelo χρησιμοποιεί δυναμική μοντελοποίηση βασισμένη σε πιθανοφάνεια για υπολογισμό διανυσμάτων ταχύτητας, προβάλλοντας κύτταρα σε μελλοντικές καταστάσεις σε embeddings όπως UMAP. Το CellDancer επεκτείνει αυτό ενσωματώνοντας ψευδοχρόνο για να μοντελοποιήσει κυκλική δυναμική, όπως κυτταρικούς κύκλους, με βελτιωμένη ακρίβεια. Αυτές οι μέθοδοι απαιτούν δεδομένα spliced/unspliced υψηλής ποιότητας και είναι ευάλωτες σε θόρυβο και γεγονότα dropout σε scRNA-seq.

 Μέθοδοι Βασισμένες σε Optimal Transport 
Οι προσεγγίσεις optimal transport μοντελοποιούν τροχιές ως ροές μεταξύ κυτταρικών καταστάσεων. Το Waddington-OT εφαρμόζει optimal transport για στοίχιση κυττάρων σε χρονικά σημεία, υποστηρίζοντας multi-omics και ενσωμάτωση χρονικών δεδομένων για επαγωγή αναπτυξιακών τροχιών. Το TrajectoryNet συνδυάζει optimal transport με νευρωνικά δίκτυα, αποδίδοντας ανθεκτικές συνεχείς τροχιές σε θορυβώδεις συνθήκες.

 Άλλες Προσεγγίσεις Δυναμικής 
Το CytoTRACE εκτιμά δυναμικό διαφοροποίησης από ποικιλία καταμέτρησης γονιδίων, παρακάμπτοντας πλήρη κατασκευή τροχιάς και επιτρέποντας συγκρίσεις μεταξύ ειδών. Μέθοδοι μεταβολικής επισημείωσης όπως scSLAM-seq καταγράφουν ρυθμούς μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο για ενισχυμένη χρονική ανάλυση. CRISPR-based ιχνηλάτηση γενεαλογίας, όπως Perturb-seq και scGESTALT, ενσωματώνει δεδομένα έκφρασης με γενετικά barcodes για χαρτογράφηση ιστορικών κλώνων με υψηλή ακρίβεια.

 Λειτουργική και Ρυθμιστική Ανάλυση 
Η λειτουργική και ρυθμιστική ανάλυση εντοπίζει DEGs, εμπλουτισμένες οδούς, μοτίβα μεταγραφικών παραγόντων (TF motifs) και eQTLs για να διευκρινίσει κυτταρική λειτουργία και ρύθμιση.

 Διαφορική Ανάλυση 
Η διαφορική ανάλυση συγκρίνει γονίδια ή peaks μεταξύ ομάδων, συνθηκών ή τροχιών. Μέθοδοι pseudobulk συγκεντρώνουν κύτταρα και χρησιμοποιούν εργαλεία bulk όπως DESeq2 ή edgeR, ανθεκτικές στην αραιότητα. Μέθοδοι single-cell όπως MAST ή SCDE χειρίζονται zero-inflation, ενώ το DiSC επικεντρώνεται σε κατανεμητικά χαρακτηριστικά για ανάλυση ατομικού επιπέδου. Το TradeSeq ανιχνεύει αλλαγές έκφρασης κατά μήκος τροχιών ψευδοχρόνου.

 Ανάλυση Εμπλουτισμού και Μονοπατιών 
Η Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) κατατάσσει γονίδια κατά fold-change για ανίχνευση μεταβολών οδών, προσαρμοσμένη για single-cell μέσω scGSEA. Υπεργεωμετρικά τεστ στο clusterProfiler ή Enrichr εντοπίζουν υπεραντιπροσωπευμένα Gene Ontology (GO) ή KEGG pathways. Το Network-based SingleCellGGM συμπεραίνει συνεκφραζόμενες μονάδες για λειτουργικά προγράμματα.

 Ρυθμιστική Ανάλυση 
Η ρυθμιστική ανάλυση σαρώνει scATAC-seq ανοικτή χρωματίνη για TF motifs. HOMER και MEME αναζητούν γνωστά motifs, ενώ το chromVAR του Signac υπολογίζει TF activity deviation scores. Το SCENIC χτίζει regulons ενσωματώνοντας RNA και ATAC δεδομένα, συνδέοντας συνεκφραζόμενα γονίδια με μοτίβα προαγωγέων. Μέθοδοι με ενίσχυση AI προβλέπουν πρόσδεση μοτίβων με deep learning, βελτιώνοντας ακρίβεια.

 Χαρτογράφηση eQTL 
Η χαρτογράφηση eQTL συνδέει γενετικές παραλλαγές με μοριακά φαινότυπα. Εργαλεία pseudobulk όπως LeafCutter ή Matrix eQTL αναλύουν συγκεντρωμένα δεδομένα, ενώ το reg-eQTL ενσωματώνει επιδράσεις TF. Το single-cell-specific eQTLsingle ανιχνεύει eQTLs απευθείας από scRNA-seq, και το AirQTL χρησιμοποιεί μεικτά μοντέλα για αιτιώδεις παραλλαγές. Το Multi-omics eQTL ενσωματώνει single-nucleus RNA-seq με γονότυπους, ιδίως για ρύθμιση ειδική του εγκεφάλου. Η spatial omics το ενισχύει αποσυνθέτοντας bulk spatial δεδομένα ή χρησιμοποιώντας ανάλυση μονού κυττάρου για να χαρτογραφήσει ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις χωρικά.

 Παραπομπές