Εγγενής φθορισμός του DNA

Ο όρος εγγενής φθορισμός του DNA αναφέρεται στην ακτινοβολία που εκπέμπεται απευθείας από το DNA όταν απορροφά υπεριώδη (UV) ακτινοβολία. Δεν πρέπει να συγχέεται με την ακτινοβολία που εκπέμπουν φθορίζοντες δείκτες, οι οποίοι, είτε απλώς προσκολλώνται στο DNA, είτε συνδέονται με αυτό μέσω χημικών δεσμών. Τέτοιοι δείκτες, οι οποίοι μπορεί να είναι χημικά τροποποιημένες νουκλεοβάσεις, χρησιμοποιούνται ευρέως σε βιολογικές εφαρμογές.

Ο εγγενής φθορισμός του DNA ανακαλύφθηκε τη δεκαετία του 1960 μελετώντας νουκλεϊκά οξέα σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες 77 Κ. Από τις αρχές του 21ου αιώνα, η πολύ ασθενέστερη εκπομπή των νουκλεϊκών οξέων σε υδατικά διαλύματα θερμοκρασίας δωματίου μελετάται με εξελιγμένες φασματοσκοπικές τεχνικές. Αυτές οι τεχνικές χρησιμοποιούν ως πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας παλμικά λέιζερ και παρακολουθούν την εξέλιξη του εκπεμπόμενου φωτός σε χρονικές κλίμακες από φεμτοδευτερόλεπτα σε νανοδευτερόλεπτα. Ένα αποφασιστικό στοιχείο για αυτές τις μελέτες υπήρξε η ανάπτυξη ειδικών πειραματικών πρωτοκόλλων.

Οι μελέτες του φθορισμού του DNA, σε συνδυασμό με θεωρητικούς υπολογισμούς  και μετρήσεις παροδικής απορρόφησης, παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την εξέλιξη των ηλεκτρονικά διεγερμένων καταστάσεων. Έτσι, συμβάλλουν στην κατανόηση των πρώτων βημάτων μιας πολύπλοκης σειράς διεργασίων που πυροδοτείται από την υπεριώδη ακτινοβολία και μπορεί να οδηγήσει σε βλάβη του DNA και εμφάνιση καρκινογόνων μεταλάξεων.

Οι αρχές που διέπουν την συμπεριφορά του εγγενούς φθορισμού του RNA, στον οποίο έχουν αφιερωθεί λιγότερες μελέτες, είναι οι ίδιες με αυτές που περιγράφονται για το DNA.

Η κατανόηση των θεμελιωδών διεργασιών που διέπουν τον φθορισμό του DNA ανοίγει τον δρόμο για την ανάπτυξη βιοαισθητήρων χωρίς φθορίζοντες δείκτες. Τέτοιες μελλοντικές οπτοηλεκτρονικές συσκευές θα πλεονεκτούν έναντι αυτών που βασίζονται σε δείκτες φθορισμού, καθώς δεν απαιτούν χημική σύνθεση ή δεν ενέχουν τις αβεβαιότητες που οφείλονται στις μη ομοιοπολικές συνδέσεις φθοριζόντων δεικτών με τα νουκλεϊκά οξέα.
Συνθήκες μέτρησης του εγγενούς φθορισμού του DNA
Λόγω της ασθενούς έντασης του εγγενούς φθορισμού του DNA, η σωστή εκτέλεση μετρήσεων και η λήψη αξιόπιστων αποτελεσμάτων απαιτούν ειδικές προφυλάξεις. Μια πρώτη απαίτηση αφορά την καθαρότητα τόσο των δειγμάτων DNA όσο και των χημικών ουσιών και του νερού που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή των ρυθμιστικών διαλυμάτων. Ο φθορισμός του ρυθμιστικού διαλύματος πρέπει να καταγράφεται συστηματικά και, σε ορισμένες περιπτώσεις, να αφαιρείται με κατάλληλο τρόπο.

Μια δεύτερη απαίτηση σχετίζεται με τη βλάβη του DNA που προκαλείται από το διεγείρον υπεριώδες φως, η οποία αλλοιώνει τον φθορισμό του. Για να ξεπεραστούν αυτές οι δυσκολίες, είναι απαραίτητη η συνεχής ανάδευση του διαλύματος. Όταν χρησιμοποιείται διέγερση με λέιζερ, ενδείκνυται η κυκλοφορία του διαλύματος DNA μέσω περισταλτικής αντλίας. Είναι επίσης απαραίτητο να ελέγχεται η αναπαραγωγιμότητα των διαδοχικών μετρήσεων του φθορισμού.

Φασματικές Μορφές και Κβαντικές Αποδόσεις

Τα φάσματα φθορισμού των μονομερών χρωμοφόρων του DNA (νουκλεοβάσεις, νουκλεοσίδια και νουκλεοτίδια) σε ουδέτερα υδατικά διαλύματα που λαμβάνονται με διέγερση γύρω στα 260 nm εμφανίζουν μέγιστη ένταση στην υπεριώδη περιοχή (300-400 nm) και εκτείνονται σε όλο το ορατό φάσμα.

Τα φάσματα των πολυμερών (που αποτελούνται από περισσότερες από μία νουκλεοβάσεις) δεν είναι το άθροισμα των φασμάτων των μονομερών συστατικών τους. Σε ορισμένες περιπτώσεις, εκτός από την κύρια κορυφή στην υπεριώδη περιοχή, μια δεύτερη είναι παρούσα σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Αυτή αποδίδεται στον σχηματισμό εξιμερών ή εξιπλόκων.

Τα φάσματα των διπλών ελίκων επηρεάζονται από το μέγεθός τους και το ιξώδες του διαλύματος, ενώ αυτά των τετραπλών ελίκων γουανίνης (G-Quadruplexes) από τα μεταλλικά κατιόντα που βρίσκονται στην κεντρική τους κοιλότητα. Λόγω της εξάρτησης του φθορισμού του DNA από τη δευτεροταγή δομή του, μπορεί κανείς να παρακολουθήσει τον σχηματισμό και την τήξη τετραπλών ελίκων πλώς παρακολουθώντας τον φθορισμό.

Οι κβαντικές αποδόσεις φθορισμού (Φ), δηλαδή ο αριθμός των εκπεμπόμενων φωτονίων προς τον αριθμό των απορροφούμενων φωτονίων, κυμαίνονται μεταξύ 10−4 και 10−3. Οι υψηλότερες τιμές έχουν παρατηρηθεί για τετράκλωνες δομές. Το νουκλεοσίδιο του DNA θυμιδίνη (dT) προτάθηκε ως αναφορά για τον προσδιορισμό μικρών κβαντικών αποδόσεων φθορισμού.

Ένας περιορισμένος αριθμός μετρήσεων πραγματοποιήθηκε επίσης με διέγερση στο UVA (330 nm), όπου μονόκλωνα και δίκλωνα DNA, αλλά όχι τα μονομερή συστατικά τους, απορροφούν ασθενώς. Ο αντίστοιχος φθορισμός παρουσιάζει ένα μέγιστο μεταξύ 415 και 430 nm ενώ οι τιμές του Φ είναι τουλάχιστον μια τάξη μεγέθους υψηλότερες σε σύγκριση με εκείνες που προσδιορίζονται με διέγερση γύρω στα 260 nm.

Ο φθορισμός ορισμένων δευτερευουσών, αλλά φυσικώς απαντώμενων, νουκλεοβάσεων ή νουκλεοσιδίων, όπως η 5-μεθυλοκυτοσίνη, η N7-μεθυλογουανοσίνη ή η N6-μεθυλαδενίνη, έχει μελετηθεί τόσο σε μονομερή όσο και σε πολυμερή μορφή.  Τα φάσματα εκπομπής αυτών των συστημάτων είναι μετατοπισμένα προς το ερυθρό σε σύγκριση με εκείνα των κύριων νουκλεοβάσεων.

Τα φάσματα εκπομπής που περιγράφονται σε αυτή την ενότητα προέρχονται από θεμελιώδεις μελέτες. Μερικές φορές διαφέρουν από αυτά που αναφέρονται σε εργασίες που γίνονται με στοχο εφαρμογές, τα οποία καταγράφονται, για ευκολία, με πιο πυκνά διαλύματα και είναι μετατοπισμένα σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Αυτό συμβαίνει γιατί τα φωτόνια που εκπέμπονται σε μικρά μήκη κύματος επαναπορροφώνται από το πυκνό διάλυμα DNA (φαινόμενο εσωτερικού φίλτρου) με αποτέλεσμα να εξαφανίζεται το μπλε τμήμα του φάσματος.

 Χρονική ανάλυση φθορισμού
Σε αντίθεση με τα περισσότερα φθορίζοντα μόρια, η χρονική εξέλιξη του εγγενούς φθορισμού του DNA δεν μπορεί να περιγραφεί με μια μονο-εκθετική συνάρτηση. Ο φθορισμός των μονομερών του DNA διαρκεί το πολύ λίγα πικοδευτερόλεπτα. Στην περίπτωση των πολυμερών, ο φθορισμός συνεχίζεται για πολύ μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, φωτόνια εκπέμπονται ακόμα και για αρκετές δεκάδες νανοδευτερόλεπτα μετά τη διέγερση.

Για να αποκτηθεί πλήρης εικόνα αυτής της σύνθετης χρονικής εξέλιξης, απαιτείται ως πηγή διέγερσης ένα λέιζερ με παλμούς φεμτοδευτερολέπτων. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για αυτόν τον σκοπό είναι: η φθορισμική μετατροπή προς μεγαλύτερη συχνότητα (fluorescence upconversion), η φασματοσκοπία φθορισμού με οπτική πύλη Kerr (Kerr-gated fluorescence spectroscopy) και η χρονικά συσχετισμένη καταμέτρηση μοναδικών φωτονίων (time-correlated single photon counting). Όλες αυτές οι τεχνικές ανιχνεύουν χρονικές μεταβολέςν της έντασης, των φασματικών μορφών και της ανισοτροπίας του φθορισμού, παρέχοντας πληροφορίες σχετικά με τους διάφορους τύπους διεγερμένων καταστάσεων που εκπέμπουν.

Εκπέμπουσες καταστάσεις και χρόνοι ζωής
Μονομερή χρωμοφόρα
Ο φθορισμός των μονομερών χρωμοφόρων του DNA προέρχεται από τις ηλεκτρονικά διεγερμένες καταστάσεις των νουκλεοβάσεων τύπου ππ*, που εχουν την χαμηλότερη ενέργεια. Αυτές οι καταστάσεις είναι επίσης υπεύθυνες για την απορρόφηση φωτονίων.
Ο χρόνος ζωής τους είναι εξαιρετικά σύντομος: απενεργοποιούνται πλήρως μέσα σε, το πολύ, λίγα πικοδευτερόλεπτα. Αυτή η εξαιρετικά γρήγορη απενεργοποίηση οφείλεται στην ύπαρξη κωνικών τομών που συνδέουν τις επιφάνειες δυναμικής ενέργειας (potential energy surfaces) της διεγερμένης και της θεμελιώδους κατάστασης. Κατά συνέπεια, η κυρίαρχη οδός απενεργοποίησης είναι μη ακτινοβόλος, πράγμα που οδηγεί σε πολύ χαμηλές κβαντικές αποδόσεις φθορισμού.

Η πορεία προς την κωνική τομή συνοδεύεται από ενδομοριακές δομικές κινήσεις, π.χ. κάμψη ή περιστροφή γύρω από ομοιοπολικούς δεσμούς. Ένα σημαντικό μέρος των φωτονίων εκπέμπεται ενώ το σύστημα κινείται ακόμα κατά μήκος της επιφάνειας δυναμικής ενέργειας της διεγερμένης κατάστασης, πριν δηλαδή φτάσει σε ένα σημείο ελάχιστης ενέργειας. Και καθώς η ηλεκτρονική δομή μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της εκπομπής, η καμπύλη απόσβεσης του φθορισμού δεν μπορεί να προσαρμοσθεί με μονοεκθετική συνάρτήση.
Πολυχρωμοφορικά συστήματα
Λόγω της στενής τους εγγύτητας, οι νουκλεοβάσεις πολυμερικών DNA  είναι συνήθως ηλεκτρονικά συζευγμένες. Έτσι, οι διεγερμένες καταστάσεις που ευθύνονται για την απορρόφηση φωτονίων (καταστάσεις Franck-Condon) αποεντοπίζονται σε περισσότερες της μίας νουκλεοβάσεις, δημιουργώντας συλλογικές καταστάσεις (εξιτόνια).  Η ηλεκτρονική σύζευξη εξαρτάται από τη γεωμετρική διάταξη των χρωμοφόρων. Συνεπώς, οι ιδιότητες των συλλογικών αυτών καταστάσεων επηρεάζονται από παράγοντες που καθορίζουν τη σχετική θέση των νουκλεοβάσεων. Μεταξύ αυτών, η διαμορφωτική αταξία που χαρακτηρίζει τα νουκλεϊκά οξέα μεταβάλλει τις τιμές της σύζευξης, δημιουργώντας πολυάριθμες καταστάσεις Franck-Condon. Καθεμία από αυτές εξελίσσεται πάνω σε μία συγκεκριμένη ενεργειακή επιφάνεια.

Μπορεί κανείς να διακρίνει δύο οριακοούς τύπους διεγερμένων καταστάσεων. Από τη μία, οι καταστάσεις τύπου ππ*, εντοπισμένες σε μεμονωμένες νουκλεοβάσεις ή αποεντοπισμένες σε αρκετές από αυτές. Από την άλλη, οι διεγερμένες καταστάσεις μεταφοράς φορτίου, στις οποίες ένα σημαντικό ποσοστό ενός ατομικού φορτίου έχει μεταφερθεί από μια νουκλεοβάση σε μια άλλη, ο φθορισμός των οποίων είναι ιδιαίτερα ασθενής. Μεταξύ αυτών των δύο τύπων υπάρχει πληθώρα καταστάσεων, με διάφορους βαθμούς αποεντοπισμού και μεταφοράς φορτίου. Οι ιδιότητές τους μπορεί να μεταβάλλονται κατά τη διάρκεια της ζωής τους λόγω των διαμορφωτικών ενδομοριακών κινήσεων των νουκλεϊκών οξέων, που λαμβάνουν χώρα στην ίδια χρονική κλίμακα. Λόγω αυτής της πολυπλοκότητας, η προσαρμογή των καμπυλών απόσβεσης του φθορισμού με πολυεκθετικές συναρτήσεις είναι μόνο φαινομενολογική, δηλαδή οι χρονικές σταθερές που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο δεν αντιστοιχούν αναγκαστικά σε συγκεκριμένες καταστάσεις.

Μπορεί κανείς να ξεχωρίσει πειραματικά τους διαφορους τύπους εκπέμπουσων καταστάσεων καταγράφοντας την ανισοτροπία του φθορισμού. Η μεταφορά ηλεκρικού φορτίου μεταξύ δύο νουκλεοβάσεων μειώνει τη ανισοτροπία φθορισμού της αντίστιχης διεγερμένης κατάστασης. Επιπλέον,  σε όλα τα πολυμερή του DNA παρατηρείται μείωση της ανισοτροπίας φθορισμού στην κλίμακα του φεμτοδευτερολέπτων. Αυτό ερμηνεύτηκε με την υπερ-ταχεία μεταφορά ενέργειας διέγερσης μεταξύ των νουκλεοβάσεων.

Μία ιδιαίτερη κατηγορία εξιτονίων με ασθενή χαρακτήρα μεταφοράς φορτίου ανιχνεύθηκε σε όλους τους τύπους δίκλωνου DNA, συμπεριλαμβανομένου και γονιδιωματικού DNA. Τα εκπεμπόμενα φωτόνια εμφανίζονται σε μικρά μήκη κύματος (λ < 330 nm) και αντιπροσωπεύουν το μέρος του φθορισμού του δίκλωνου με τη μεγαλύτερη διάρκεια ζωής· απενεργοποιούνται τελείως σε κλίμακα νανοδευτερολέπτων. Αντίθετα, η εκπομπή εξιμερών και εξιπλόκων με έντονο χαρακτήρα μεταφοράς φορτίου εμφανίζεται σε μεγάλα μήκη κύματος. Αποδιεγύρονται πλήρως πριν απο ένα νανοδευτερόλεπτο. Η συμβολή των παραπάνω εξιτονίων στον ολικό φθορισμό αυξάνεται με την τοπική ακαμψία του δίκλωνου, η οποία μεταβάλλεται με τον αριθμό των υδρογονικών δεσμών Watson-Crick ή το μέγεθος του συστήματος, καθώς επίσης και από το μήκος κύματος διέγερσης. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα φθορισμού τετοιων εξιτονίων παρέχουν τα φάσματα πολυμερών δίκλωνων με εναλλασσόμενη αλληλουχία γουανίνης-κυτοσίνης. Το εύρος τους είναι ιδιαίτερα μικρό, ιδιότητα που χαρακτηρίζει εξιτόνια άλλων συστημάτων, όπως τα J-aggregates.
Εφαρμογές
Η αξιοποίηση του εγγενούς φθορισμού των νουκλεϊκών οξέων για διάφορες εφαρμογές άρχισε να διερευνάται από το 2019. Οι περισσότερες εργασίες εκμεταλλεύονται το γεγονός ότι η ένταση του φθορισμού τους μεταβάλλεται όταν αλληλεπιδρούν με άλλα μόρια. Με αυτόν τον τρόπο έχουν ανιχνευθεί τμήματα DNA στον ανθρώπινο ορό, ιόντα Pb2+ στο νερό, δέσμευση απταμερών, καθώς και κινολικές χρωστικές που χρησιμοποιούνται συχνά στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων.

Παράλληλα, διερευνήθηκε η ανάλυση μεγάλου αριθμού αλληλουχιών μέσω πολυμεταβλητής ανάλυσης. Η τεχνική της σύγχρονης σάρωσης φθορισμού χρησιμοποιηθηκε για την αυθεντικοποίηση των εμβολίων COVID-19. Η καταγραφή του εγγενούς φθορισμού συμπεριλήφθηκε σε πολυδιάστατη ανάλυση του αδενοσυνδεδεμένου ιού (AVV). Επί πλέον, αναπτύχθηκε οπτική μέθοδος για την αξιολόγηση της αλληλεπίδρασης μικρών μορίων με πιθανές αντικαρκινικές ιδιότητες σε τετράκλωνα γουανίνης.

Επίσης, έχει προταθεί η δυνατότητα ανίχνευσης βλαβών του DNA μέσω παρακολούθησης του εγγενούς φθορισμού του. Η ιδέα αυτής της εφαρμογής βασίζεται στο γεγονός ότι ο φθορισμός δίκλωνου DNA που εκπέμπεται από εξιτόνια σε μικρά μήκη κύματος είναι πολύ ευαίσθητος στη γεωμετρική διάταξη των νουκλεοβάσεων. Η δημιουργία διαφόρων χημικών αλλοιώσεων όχι μόνο εξαφανίζει τον φθορισμό των νουκλεοβάσεων που έχουν υποστεί αντίδραση, αλλά και προκαλεί γεωμετρικές παραμορφώσεις στον τρόπο διάταξης αυτών που δεν έχουν αντιδράσει, επηρεάζοντας έτσι την ηλεκτρονική τους αλληλεπίδραση και, συνακόλουθα, τον φθορισμό τους, ο οποίος μετατοπίζεται προς μεγαλύτερα μήκη κύματος.

Περαιτέρω ανάγνωση
Reviews and Accounts

Book Chapters

 Αναφορές