Τοποϊσομεράση

Οι τοποϊσομεράσες DNA (ή τοποϊσομεράσες) (DNA topoisomerases) είναι ένζυμα που καταλύουν αλλαγές στην τοπολογική κατάσταση του DNA, μετατρέποντας χαλαρές και υπερελικωμένες μορφές, συνδεδεμένα (αλυσιδωτά) και ασύνδετα είδη, καθώς και DNA με και χωρίς κόμβους. Τα τοπολογικά ζητήματα στο DNA προκύπτουν λόγω της αλληλένδετης φύσης της δομής της διπλής έλικας του, η οποία, παραδείγματος χάρη, μπορεί να οδηγήσει σε υπερπεριέλιξη του διπλού DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής και της μεταγραφής του DNA. Εάν αφεθεί αμετάβλητο, αυτή η στρέψη τελικά θα σταματήσει τις πολυμεράσες DNA ή RNA που εμπλέκονται σε αυτές τις διεργασίες από το να συνεχίσουν κατά μήκος της έλικας του DNA. Μια δεύτερη τοπολογική πρόκληση προκύπτει από τη σύνδεση ή το μπλέξιμο του DNA κατά την αντιγραφή. Εάν δεν επιλυθούν, οι συνδέσεις μεταξύ του αντιγραμμένου DNA θα εμποδίσουν την κυτταρική διαίρεση. Οι τοποϊσομεράσες του DNA προλαμβάνουν και διορθώνουν αυτούς τους τύπους τοπολογικών προβλημάτων. Το επιτυγχάνουν αυτό συνδεόμενες με το DNA και κόβοντας τον σκελετό σακχάρου-φωσφορικών είτε της μίας (τοποϊσομεράσες τύπου Ι), είτε και των δύο (τοποϊσομεράσες τύπου II) των αλυσίδων του DNA. Αυτή η παροδική ρήξη επιτρέπει στο DNA να ξεμπερδευτεί ή να ξετυλιχθεί και, στο τέλος αυτών των διεργασιών, ο σκελετός του DNA ξανακλείνει. Δεδομένου ότι η συνολική χημική σύνθεση και η συνδεσιμότητα του DNA δεν αλλάζουν, το υπόστρωμα και το προϊόν του DNA είναι χημικά ισομερή, που διαφέρουν μόνο στην τοπολογία τους.

 Ανακάλυψη 

Η πρώτη DNA τοποϊσομεράση ανακαλύφθηκε σε βακτήρια από τον James C. Wang το 1971 και αρχικά ονομάστηκε ω (ωμέγα) πρωτεΐνη.  Τώρα ονομάζεται τοποϊσομεράση Ι (topo I) της Εσερίχια κόλι (E. coli) και είναι αντιπροσωπευτική της οικογένειας ενζύμων τύπου IA. Στη συνέχεια, παρόμοια δραστικότητα βρέθηκε σε ευκαρυωτικά κύτταρα (ήπαρ αρουραίου) από τους James Champoux και Renato Dulbecco. Το υπεύθυνο ένζυμο, το ευκαρυωτικό topo Ι, έχει έναν ξεχωριστό μηχανισμό και είναι αντιπροσωπευτικό της οικογένειας τύπου ΙΒ. Η πρώτη τοποϊσομεράση τύπου II που ανακαλύφθηκε ήταν η DNA γυράση από βακτήρια, από τον Martin Gellert και τους συνεργάτες του το 1976, και χαρακτηρίστηκε επίσης από τον Nicholas Cozzarelli και τους συνεργάτες του. Η DNA γυράση καταλύει την εισαγωγή αρνητικών υπερελίκων στο DNA και είναι το μόνο ένζυμο τύπου II που το κάνει αυτό, καθώς όλα τα άλλα καταλύουν τη χαλάρωση του DNA. Τα ένζυμα τύπου II διακρίνονται μηχανιστικά από τον τύπο Ι, καθώς εξαρτώνται από το ATP και διασπούν παροδικά και τις δύο αλυσίδες του DNA αντί μόνο τη μία. Οι τοποϊσομεράσες τύπου II στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν από βακτηριακούς ιούς και ευκαρυώτες. Οι κωδικοί EC Topo είναι οι εξής: ανεξάρτητος από ATP (τύπος I), EC 5.6.2.1, εξαρτώμενος από ATP (τύπος II): EC 5.6.2.2. Η εξαίρεση μεταξύ των τοποϊσομερασών τύπου Ι, είναι η αντίστροφη γυράση, η οποία περιέχει μια περιοχή ελικάσης (EC 3.6.4.12) και εισάγει θετική υπερελίκωση με τρόπο εξαρτώμενο από ATP. Επομένως, είναι η μόνη τοποϊσομεράση τύπου Ι που ταξινομείται ως EC 5.6.2.2 (Πίνακας 1).

 Τοπολογία DNA 
Η διπλή έλικα του DNA περιλαμβάνει την αλληλοσύνδεση των δύο πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων η μία γύρω από την άλλη, η οποία ενδεχομένως να δημιουργεί τοπολογικά προβλήματα. Η τοπολογία του DNA αναφέρεται στη διασταύρωση των δύο αλυσίδων του DNA που μεταβάλλει την περιστροφή της διπλής έλικας και προκαλεί τριτοταγείς διαμορφώσεις του DNA, όπως υπερέλικες, κόμβους και κατενάνια. Πιθανά τοπολογικά ζητήματα που σχετίζονται με τη δομή της διπλής έλικας του DNA αναγνωρίστηκαν αμέσως μετά την πρώτη αποσαφήνιση της δομής του το 1953 από τους James Watson, Francis Crick και Rosalind Franklin. και αναπτύχθηκαν περαιτέρω από το έργο των Max Delbruck και John Cairns. Το κλειστού κυκλικού σχήματος δίκλωνο DNA μπορεί να περιγραφεί με 3 παραμέτρους: αριθμός σύνδεσης (Linking number, Lk), στρέψη (Twist, Tw) και περιέλιξη (Writhe, Wr) (Εικ. 1). Όπου Lk αναφέρεται στον αριθμό των φορών που συνδέονται οι δύο κλώνοι, Tw αναφέρεται στον αριθμό των ελικοειδών στροφών στο DNA, μετρούμενο σε σχέση με τον ελικοειδή άξονα, και Wr ποσοτικοποιεί την περιέλιξη της διαδρομής της έλικας του DNA στο διάστημα και συχνά εξισώνεται με 'υπερπεριέλιξη'.

alt= Εικόνα που δείχνει χαλαρωμένο κυκλικό DNA και πώς οι αυξήσεις ή οι μειώσεις στον αριθμό σύνδεσης έχουν ως αποτέλεσμα αλλαγές στις παραμέτρους συστροφής και περιελίξεων του DNA, επιπρόσθετα της απεικόνισης της δημιουργίας κόμβων και της αλυσίδωσης του DNA.|thumb|Σχήμα 1. Επισκόπηση της τοπολογίας του DNA. Ο αριθμός σύνδεσης (Lk) περιγράφει τον αριθμό των φορών που οι δύο μονές έλικες του DNA διασταυρώνονται σε ένα κλειστό κυκλικό μόριο DNA. Τα χαλαρά μόρια DNA έχουν έναν εγγενή αριθμό σύνδεσης (Lk0) που αντιστοιχεί στην περιστροφή των δύο μονών έλικων η μία γύρω από την άλλη στη διπλή έλικα, περίπου μία φορά ανά 10,5 ζεύγη βάσεων (Tw0~ 10,5). Η υπερελίκωση αντιστοιχεί σε αυξήσεις ή μειώσεις του αριθμού σύνδεσης (ΔLk) που προκύπτουν από κυτταρικές διεργασίες όπως η μεταγραφή και η αντιγραφή του DNA (Σχήμα 2). Οι αλλαγές στον αριθμό σύνδεσης προσαρμόζονται στις αλλαγές στη συστροφή (στρέβλωση) (Tw) και τη περιέλιξη (Wr), οι οποίες αλλάζουν τη δομή και τους μηχανισμούς του DNA. Η δημιουργία δεσμών μέσα σε ένα μόριο DNA και οι συνδέσεις μεταξύ των μορίων DNA (κατενάνια) αντιπροσωπεύουν τοπολογικές διαμορφώσεις υψηλότερης τάξης του DNA.|253x253px

Οι 3 παράμετροι σχετίζονται ως εξής: Lk = Tw +Wr. Αυτή είναι μια μαθηματική ταυτότητα που αρχικά έλαβε ο Călugăreanu το 1959. και αναφέρεται ως θεώρημα Călugăreanu, ή Călugăreanu–White–Fuller. Το Lk δεν μπορεί να τροποποιηθεί χωρίς να σπάσει η μία ή και οι δύο αλυσίδες της έλικας. Τα Tw και Wr είναι αλληλομετατρέψιμα και εξαρτώνται από τις συνθήκες του διαλύματος. Η υπερελίκωση είναι ένας ιδιόμορφος όρος για το DNA με μη μηδενική διαφορά σύνδεσης, που αναφέρεται πιο σωστά ως ειδική διαφορά σύνδεσης (σ = ΔLk/Lk0, όπου Lk0 είναι ο μέσος αριθμός σύνδεσης του χαλαρού κύκλου DNA). Το DNA λέγεται ότι είναι θετικά υπερελικωμένο εάν το Lk του είναι υψηλότερο από το Lk0 για την χαλαρή κατάσταση (Lk-Lko = ΔLk, ΔLk>0). Αυτό σημαίνει ότι το Tw ή/και το Wr αυξάνονται σε σχέση με το χαλαρό μόριο. Αντίθετα, το DNA είναι αρνητικά υπερελικωμένο εάν το Lk του μορίου είναι χαμηλότερο από το Lk0 (ΔLk<0).

Οι συνέπειες των τοπολογικών διαταραχών στο DNA εξηγούνται από την αντιγραφή του DNA, κατά την οποία οι αλυσίδες του διπλού δεσμού διαχωρίζονται. Αυτός ο διαχωρισμός οδηγεί στο σχηματισμό θετικών υπερελίκων (υπερπεριέλιξη ή υπερστροφή του DNA) μπροστά από την διχάλα αντιγραφής και στην αλληλοσύνδεση των θυγατρικών αλυσίδων (προκατενάνια) πίσω από αυτήν. (Σχ. 2). Εάν οι θετικές υπερέλικες δεν χαλαρώσουν, η πρόοδος της διχάλας αντιγραφής παρεμποδίζεται, ενώ η αποτυχία αποσύνδεσης των θυγατρικών αλυσίδων αποτρέπει τον διαχωρισμό του γονιδιώματος, ο οποίος απαιτείται για την κυτταρική διαίρεση. Η μεταγραφή από την RNA πολυμεράση παράγει επίσης θετική υπερελίκωση μπροστά και αρνητική υπερελίκωση πίσω από το μεταγραφικό σύμπλεγμα (Σχ. 2). Αυτό το φαινόμενο είναι γνωστό ως πρότυπο διπλής υπερελίκωσης τομέα, όπως περιγράφεται από τους Leroy Liu και James Wang το 1987. Αυτές οι τοπολογικές διαταραχές πρέπει να επιλυθούν για να προχωρήσει ο μεταβολισμός του DNA, επιτρέποντας στο κύτταρο να αντιγράψει, να μεταγράψει και να διαμερίσει αποτελεσματικά το γονιδίωμα για να επιτρέψει την κυτταρική διαίρεση και τη ζωτικότητα. Οι κόμβοι στο DNA μπορούν να βρεθούν σε βακτηριοφάγους και ως προϊόντα αντιδράσεων ανασυνδυασμού. Γενικά, οι κόμβοι στο DNA είναι επιβλαβείς και πρέπει να αφαιρούνται (από τοποϊσομεράσες). Τα κατενάνια του DNA σχηματίζονται κατά την αντιγραφή κυκλικών μορίων και πρέπει να διαλυθούν από τοποϊσομεράσες ή ανασυνδυάσες για να επιτραπεί ο σωστός διαχωρισμός των θυγατρικών μορίων κατά την κυτταρική διαίρεση. Εκτός από τις επιβλαβείς πτυχές της τοπολογίας του DNA που απαιτούν ανάλυση, υπάρχουν και ευεργετικές πτυχές. Για παράδειγμα, η αντιγραφή του πλασμιδίου απαιτεί αρνητική υπερελίκωση της αρχής, η οποία διευκολύνει την τοπική τήξη και εκθέτει το μονόκλωνο DNA που απαιτείται για την έναρξη της αντιγραφής. Ομοίως, η έναρξη της αντιγραφής από την κύρια βακτηριακή αρχή "oriC" απαιτεί επίσης αρνητική υπερελίκωση. Επιπλέον, η συμπύκνωση του γονιδιώματος του E. coli επιτυγχάνεται εν μέρει με αρνητική υπερελίκωση.

 Τύποι 
Οι DNA τοποϊσομεράσες είναι ένζυμα που έχουν εξελιχθεί για να επιλύουν τοπολογικά προβλήματα στο DNA (Πίνακας 2). Αυτό επιτυγχάνεται μέσω παροδικής θραύσης της μίας ή και των δύο αλυσίδων του DNA. Αυτό έχει οδηγήσει στην ταξινόμηση των τοποϊσομερασών σε δύο τύπους: τον τύπο Ι, ο οποίος καταλύει αντιδράσεις που περιλαμβάνουν παροδικές θραύσεις μονόκλωνης αλυσίδας, και τον τύπο II, ο οποίος καταλύει αντιδράσεις που περιλαμβάνουν παροδικές θραύσεις διπλόκλωνης αλυσίδας (Εικ. 3• Πίνακας 2). Υπάρχουν υποτύποι εντός αυτών των ταξινομήσεων.

 Τύπος I 
Αυτά τα ένζυμα καταλύουν αλλαγές στην τοπολογία του DNA μέσω παροδικών μονόκλωνων θραυσμάτων στο DNA. Οι αντιδράσεις μπορούν να εμφανιστούν τόσο σε μονόκλωνα όσο και σε δίκλωνα υποστρώματα DNA και μπορούν να προχωρήσουν μέσω ενός μηχανισμού περιστροφής ή διέλευσης κλώνων (Εικ. 3). Το εύρος των αντιδράσεων περιλαμβάνει: χαλάρωση υπερέλικας DNA, λύσιμο μονόκλωνων κύκλων και αποσύνδεση, υπό την προϋπόθεση ότι τουλάχιστον ένας συνεργάτης έχει μια μονόκλωνη περιοχή. Στην περίπτωση του αρχαϊκού ενζύμου, της αντίστροφης γυράσης, είναι δυνατή η θετική υπερελίκωση του DNA.

 Τύπος IA 
Τα τμήματα τύπου IA είναι μονομερή και συνδέονται με μονόκλωνα τμήματα του DNA. Εισάγουν μια παροδική μονόκλωνη θραύση μέσω του σχηματισμού ενός τυροσυλοφωσφορικού δεσμού μεταξύ μιας τυροσίνης στο ένζυμο και μιας 5'-φωσφορικής ομάδας στο DNA. Το τμήμα του DNA εντός του οποίου συμβαίνει η θραύση ονομάζεται 'πύλη' ή τμήμα G, και η διάσπασή του επιτρέπει τη διέλευση ενός άλλου τμήματος του DNA, του τμήματος 'μεταφοράς' ή τμήματος Τ, σε μια διαδικασία 'διέλευσης κλώνου'. Ακολουθεί η σύνδεση του τμήματος G. Για να πραγματοποιηθεί η διέλευση της αλυσίδας, η τοποϊσομεράση IA πρέπει να υποστεί μια αλλαγή διαμόρφωσης για να ανοίξει η πύλη του DNA και να επιτρέψει τη μεταφορά του τμήματος Τ. Κατά τη διάρκεια μιας αντίδρασης χαλάρωσης του DNA, αυτή η διαδικασία αλλάζει τον αριθμό σύνδεσης του DNA κατά +/-1 (Σχ. 4). Παραδείγματα τοποϊσομερασών τύπου IA περιλαμβάνουν τις προκαρυωτικές τοποϊσομεράσες I και III, τις ευκαρυωτικές τοποϊσομεράσες IIIα και IIIβ και το αρχαϊκό ένζυμο αντίστροφης γυράσης. Η αντίστροφη γυράση, η οποία εμφανίζεται σε θερμόφιλα αρχαία, περιλαμβάνει μια τοποϊσομεράση τύπου IA συνδεδεμένη με μια ελικάση και είναι το μόνο γνωστό ένζυμο που μπορεί να εισαγάγει θετικές υπερέλικες στο DNA. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την αντίστροφη γυράση βρίσκεται επίσης σε ορισμένες ομάδες θερμόφιλων βακτηρίων, όπου πιθανότατα μεταφέρθηκε μέσω οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων από τα Αρχαία.

 Τύπος IB 
Οι τοποϊσομεράσες τύπου IB καταλύουν αντιδράσεις που περιλαμβάνουν παροδικές μονόκλωνες θραύσεις στο DNA μέσω του σχηματισμού ενός τυροσυλοφωσφορικού δεσμού μεταξύ μιας τυροσίνης στο ένζυμο και μιας 3'-φωσφορικής ομάδας στο DNA. Αντί να χρησιμοποιούν έναν μηχανισμό διέλευσης αλυσίδας, αυτά τα ένζυμα λειτουργούν μέσω μιας 'περιστροφής' ή 'ελεγχόμενης περιστροφής' της διασπασμένης αλυσίδας γύρω από την άθικτη αλυσίδα.  Αυτός ο μηχανισμός ελεγχόμενης περιστροφής περιγράφηκε για πρώτη φορά για το Vaccinia topo I.  και επιτρέπει την περιστροφή του DNA του ελεύθερου άκρου γύρω από την άθικτη αλυσίδα, με την ταχύτητα να ελέγχεται από την 'τριβή' εντός της ενζυμικής κοιλότητας, πριν η εγκοπή επανασυνδεθεί (Σχ. 3). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα μια μεταβλητή αλλαγή στον αριθμό συνδέσεων ανά συμβάν διάσπασης και επανασύνδεσης. Αυτός ο μηχανισμός είναι διαφορετικός από αυτόν των ενζύμων τύπου IA, και οι δύο ομάδες ενζύμων είναι δομικά και εξελικτικά άσχετες. Παραδείγματα τοποϊσομερασών τύπου IB περιλαμβάνουν την ευκαρυωτική πυρηνική και μιτοχονδριακή τοποϊσομεράση I, εκτός από την ιική τοποϊσομεράση I, αν και έχουν εντοπιστεί και στις τρεις επικράτειες της ζωής.

 Τύπος IC 
Οι τοποϊσομεράσες τύπου IC μοιράζονται έναν παρόμοιο μηχανισμό με τα ένζυμα τύπου IB, αλλά είναι δομικά διαφορετικές. Ο μοναδικός εκπρόσωπος είναι η topo V, που βρίσκεται στο υπερθερμόφιλο 'Methanopyrus kandleri'.

 Τύπος II 
Οι τοποϊσομεράσες τύπου II καταλύουν αλλαγές στην τοπολογία του DNA μέσω παροδικών δίκλωνων θραύσεων στο DNA. Οι αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα σε υποστρώματα δίκλωνου DNA και προχωρούν μέσω ενός μηχανισμού διέλευσης κλώνου (Σχ. 5). Το εύρος των αντιδράσεων περιλαμβάνει χαλάρωση του DNA, υπερελίκωση του DNA, λύσιμο και αποσύνδεση. Ενώ όλες οι τοποϊσομεράσες τύπου II μπορούν να καταλύσουν τη χαλάρωση του DNA, η γυράση, μια αρχετυπική βακτηριακή τοποϊσομεράση, μπορεί επίσης να εισαγάγει αρνητικές υπερελικώσεις. Σε αντίθεση με τις τοποϊσομεράσες τύπου Ι που είναι γενικά μονομερείς, οι τοποϊσομεράσες τύπου II είναι ομοδιμερείς ή ετεροτετραμερείς. Ταξινομούνται σε δύο υποτύπους με βάση εξελικτικές, δομικές και μηχανιστικές παραμέτρους. Ο γενικός μηχανισμός διέλευσης της αλυσίδας για τις τοποϊσομεράσες τύπου II ξεκινά με τη σύνδεση ενός διπλού DNA, που ονομάζεται τμήμα πύλης (τμήμα G), στην πύλη DNA. Ένα άλλο διμερές, που ονομάζεται τμήμα μεταφοράς (τμήμα Τ), συλλαμβάνεται από έναν σφιγκτήρα που λειτουργεί με ATP και διέρχεται από μια παροδική θραύση στο τμήμα G, που περιλαμβάνει δεσμούς 5ʹ φωσφοτυροσίνης και στις δύο αλυσίδες, πριν απελευθερωθεί μέσω της πύλης C και επανασυνδεθεί το τμήμα G (Εικ. 5). Η ενζυμική μετατροπή απαιτεί τη σύνδεση και την υδρόλυση του ATP.

 Τύπος IIA 
Οι τοποϊσομεράσες τύπου IIA καταλύουν παροδικές δίκλωνες θραύσεις στο DNA μέσω του σχηματισμού τυροσυλοφωσφορικών δεσμών μεταξύ των τυροσινών στο ένζυμο (ένας σε κάθε υπομονάδα) και των 5'-φωσφορικών που διακλαδώνονται κατά 4 βάσεις σε αντίθετες αλυσίδες DNA. Η αντίδραση διέλευσης αλυσίδων μπορεί να είναι ενδομοριακή ή διαμοριακή (Σχ. 5), επιτρέποντας έτσι αλλαγές στην υπερελίκωση και τη δημιουργία δεσμών ή την αποσύνδεση, αντίστοιχα. Αυτή η διαδικασία αλλάζει τον αριθμό σύνδεσης του DNA κατά +/-2. Παραδείγματα τοποϊσομερασών τύπου IIA περιλαμβάνουν τις ευκαρυωτικές τοποϊσομεράσες IIα και IIβ, εκτός από τη βακτηριακή γυράση και τις τοποϊσομεράσες IV. Η DNA γυράση συμμορφώνεται με τον ίδιο μηχανισμό διέλευσης διπλής έλικας όπως και άλλα ένζυμα τύπου II, αλλά έχει μοναδικά χαρακτηριστικά που συνδέονται με την ικανότητά της να εισάγει αρνητικές υπερέλικες στο DNA. Το τμήμα G είναι μέρος ενός πολύ μεγαλύτερου τμήματος DNA (>100 bp) που τυλίγεται γύρω από το ένζυμο, του οποίου ο ένας βραχίονας σχηματίζει το τμήμα Τ που διέρχεται από τη δίκλωνη θραύση (Σχ. 5). Στην περίπτωση της γυράσης, μια σημαντική ποσότητα της ελεύθερης ενέργειας από την υδρόλυση του ATP μετατρέπεται σε στρεπτική τάση στο DNA, δηλαδή η υπερελίκωση είναι μια διαδικασία που απαιτεί ενέργεια. Επιπλέον, απουσία ATP, η γυράση είναι ικανή να απομακρύνει αρνητικές υπερέλικες σε μια πιο αργή αντίδραση χαλάρωσης του DNA.

 Τύπος IIB 
Τα ένζυμα τύπου IIB καταλύουν επίσης παροδικές δίκλωνες θραύσεις μέσω του σχηματισμού τυροσυλοφωσφορικών δεσμών μεταξύ των τυροσινών στο ένζυμο και των 5'-φωσφορικών σε αντίθετους κλώνους του DNA, αλλά στην περίπτωση των ενζύμων IIB οι δίκλωνες θραύσεις έχουν μια διακύμανση 2 βάσεων. Τα ένζυμα τύπου IIB παρουσιάζουν σημαντικές δομικές διαφορές, αλλά σχετίζονται εξελικτικά με τα ένζυμα τύπου IIA. Αυτές οι διαφορές περιλαμβάνουν την έλλειψη μιας από τις 'πύλες' της πρωτεΐνης (της πύλης C) (Σχ. 5). Αρχικά βρέθηκαν στα αρχαία, αλλά έχουν βρεθεί και σε ευκαρυωτικά κύτταρα και, ειδικότερα, σε φυτά. Παραδείγματα περιλαμβάνουν τις τοποϊσομεράσες VI και την τοποϊσομεράση VIII. Η τοποϊσομεράση VI είναι το καλύτερα μελετημένο ένζυμο αυτού του υποτύπου και πιστεύεται ότι είναι μια προτιμησιακή δεκατενάση (decatenase).

 Ως στόχοι φαρμάκων 
Για τον μη ειδικό, ίσως η πιο σημαντική πτυχή των τοποϊσομερασών είναι ο ρόλος τους ως φαρμακευτικοί στόχοι τόσο για αντιβακτηριακή όσο και για αντικαρκινική χημειοθεραπεία. Αρκετά αντιβακτηριακά και αντικαρκινικά φάρμακα που στοχεύουν τις τοποϊσομεράσες περιλαμβάνονται στον Πρότυπο Κατάλογο Βασικών Φαρμάκων του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας του 2019 Model List of essential Medicines. Ο λόγος για αυτή την εξέχουσα θέση είναι ότι οι αντιδράσεις τους προχωρούν μέσω παροδικών θραύσεων στο DNA, οι οποίες, εάν σταθεροποιηθούν με σύνδεση φαρμάκου, μπορούν να οδηγήσουν σε κυτταρικό θάνατο λόγω της δημιουργίας τοξικών μονόκλωνων ή δίκλωνων θραύσεων στο γονιδιωματικό DNA. Η πλειονότητα των φαρμάκων που στοχεύουν σε τοποϊσομεράσες δρουν με αυτόν τον τρόπο, δηλαδή σταθεροποιούν το ενδιάμεσο ομοιοπολικής διάσπασης ενζύμου-DNA.

 Αντιβακτηριακές ενώσεις 
Αν και οι τοποϊσομεράσες τύπου Ι, όπως οι βακτηριακές τοποϊσομεράσες Ι, είναι βιώσιμοι αντιβιοτικοί στόχοι, δεν υπάρχουν επί του παρόντος ενώσεις σε κλινική χρήση που να στοχεύουν αυτά τα ένζυμα. Ωστόσο, τα ένζυμα τύπου II, η DNA γυράση και η DNA τοποϊσομεράση IV, έχουν γνωρίσει τεράστια επιτυχία ως στόχοι για τα ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιβιοτικά φθοροκινολόνης (Σχ. 6). 

 Φθοροκινολόνες (FQs) 
Οι αντιβακτηριακές ενώσεις κινολόνης αναπτύχθηκαν για πρώτη φορά τη δεκαετία του 1960 και χρησιμοποιούνται κλινικά από τη δεκαετία του 1980. Τα παράγωγα FQ, όπως η κιπροφλοξασίνη, η λεβοφλοξασίνη και η μοξιφλοξασίνη (Σχ. 6) έχουν σημειώσει υψηλή επιτυχία. Αυτές οι ενώσεις λειτουργούν αλληλεπιδρώντας με τον στόχο τους (γυράση ή τοποϊσομεράση IV) και το DNA στη θέση διάσπασης για να σταθεροποιήσουν το ενδιάμεσο ομοιοπολικής διάσπασης DNA-πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, παρεμβάλλονται στο DNA και αποτρέπουν το στάδιο επανασύνδεσης του DNA της αντίδρασης τοποϊσομεράσης (Σχ. 5). Αυτός είναι ένας εξαιρετικά αποτελεσματικός μηχανισμός αναστολής που χρησιμοποιείται επίσης από πολλά αντικαρκινικά φάρμακα που στοχεύουν στην τοποϊσομεράση. Παρά την εντυπωσιακή τους επιτυχία, η αντοχή στις FQ αποτελεί σοβαρό πρόβλημα. Μια ποικιλία άλλων ενώσεων, όπως κιναζολινοδιόνες και ιμιδαζολοπυραζινόνες, λειτουργούν με παρόμοιο τρόπο και ελπίζεται ότι ορισμένα από αυτά θα αντικαταστήσουν τα FQ στο μέλλον.

 Αμινοκουμαρίνες 
Οι αμινοκουμαρίνες (Σχ. 6), όπως η νοβοβιοκίνη, η χλωροβιοκίνη και η κουμερμυκίνη Α1, είναι φυσικά προϊόντα από τους Streptomyces που αναστέλλουν την αντίδραση της ATPάσης της γυράσης και της τοποϊσομεράσης IV. Παρόλο που μπορούν να είναι πολύ ισχυρά έναντι του στόχου τους, υποφέρουν από προβλήματα διαπερατότητας και τοξικότητας και ως εκ τούτου δεν έχουν απολαύσει το επίπεδο κλινικής επιτυχίας των FQs.

 Πρωτεϊνικοί αναστολείς 
Υπάρχουν διάφοροι πρωτεϊνικοί αναστολείς της γυράσης, συμπεριλαμβανομένων των βακτηριακών τοξινών CcdB, MccB17 και ParE, που σταθεροποιούν το σύμπλοκο διάσπασης, με παρόμοιο τρόπο με τις FQs. Αν και αυτές οι πρωτεΐνες δεν είναι βιώσιμες ως αντιβακτηριακά, ο τρόπος δράσης τους θα μπορούσε να εμπνεύσει την ανάπτυξη νέων αντιβακτηριακών ενώσεων. Άλλοι πρωτεϊνικοί αναστολείς της γυράσης εμποδίζουν τη δέσμευση του DNA από την τοποϊσομεράση αντί να σταθεροποιούν τα σύμπλοκα διάσπασης. Αυτά περιλαμβάνουν την YacG και πρωτεΐνες επανάληψης πενταπεπτιδίων, όπως QnrB1 και MfpA. Αυτοί οι αναστολείς πρωτεϊνών προσδίδουν επίσης αντοχή στις φθοροκινολόνες.

 Αντικαρκινικές ενώσεις 
Τόσο η ανθρώπινη τοποϊσομεράση I όσο και II (ισομορφές α και β) μπορούν να στοχευθούν στην αντικαρκινική χημειοθεραπεία (Σχ. 7). Οι περισσότερες από αυτές τις ενώσεις δρουν με παρόμοιο τρόπο με τις FQs, δηλαδή σταθεροποιώντας το σύμπλοκο ομοιοπολικής διάσπασης DNA-πρωτεΐνης•για αυτό έχουν γίνει γνωστές ως δηλητήρια τοποϊσομεράσης, διαφορετικά από τους καταλυτικούς αναστολείς. Αρκετοί αναστολείς ανθρώπινης τοποϊσομεράσης περιλαμβάνονται στον Κατάλογο Βασικών Φαρμάκων του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας.

 Καμπτοθεκίνη 
Η καμπτοθεκίνη (Camptothecin, CPT) (Σχ. 7), η οποία προέρχεται αρχικά από το δέντρο Camptotheca acuminata, στοχεύει την ανθρώπινη τοποϊσομεράση Ι και παράγωγα όπως η τοποτεκάνη και η ιρινοτεκάνη που χρησιμοποιούνται ευρέως στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. Η καμπτοθεκίνη και τα παράγωγά της δρουν σταθεροποιώντας το σύμπλοκο διάσπασης της τοποϊσομεράσης I, αποτρέποντας την επανασύνδεση της πρωτεϊνικής εγκοπής στο DNA. Αυτοί οι αναστολείς της διεπιφάνειας σταθεροποιούνται μέσω αλληλεπιδράσεων στοίβαξης με το σχισμένο DNA και δεσμών υδρογόνου με το ένζυμο. Αν και τα παράγωγα CPT σταθεροποιούν ένα σύμπλοκο διάσπασης μονής αλυσίδας, οι επακόλουθες συγκρούσεις με μηχανισμούς αντιγραφής ή μεταγραφής πιστεύεται ότι δημιουργούν τοξικές θραύσεις του δίκλωνου DNA. Αυτές οι ενώσεις χρησιμοποιούνται ως θεραπείες πρώτης ή δεύτερης γραμμής για τη θεραπεία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, του πνεύμονα, του μαστού και του τραχήλου της μήτρας. Ωστόσο, τα παράγωγα CPT υποφέρουν από περιορισμούς που σχετίζονται με την τοξικότητα και περιορισμένους θεραπευτικούς χρόνους ημιζωής λόγω χημικής αστάθειας. Οι νέοι αναστολείς της τοποϊσομεράσης I, οι ινδενοϊσοκινολίνες και οι φθοροϊνδενοϊσοκινολίνες, ξεπερνούν τους περιορισμούς των παραγώγων CPT και βρίσκονται επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές.             

 Ετοποσίδη (VP-16) 
Η ετοποσίδη (Σχ. 7) και η στενά συγγενική της τενιποσίδη (VM-26) είναι παράγωγα επιποδοφυλλοτοξίνης που λαμβάνονται από το ρίζωμα του άγριου μανδραγόρα που στοχεύουν την τοποϊσομεράση II σταθεροποιώντας το σύμπλοκο ομοιοπολικής διάσπασης και αποτρέποντας την επανασύνδεση του διασπασμένου DNA. Αυτές χρησιμοποιούνται συνήθως σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα για τη θεραπεία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των όγκων των όρχεων, του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και της λευχαιμίας. Η θεραπεία με ετοποσίδη μπορεί να οδηγήσει σε δευτερογενείς λευχαιμίες που προκύπτουν από συγκεκριμένες γονιδιωματικές μετατοπίσεις, που αφορούν κυρίως την τοποϊσομεράση IIβ.

 Δοξορουβικίνη 
Η δοξορουβικίνη (Σχ. 7) και τα σχετικά παράγωγα δαουνορουβικίνη, επιρουβικίνη και ιδαρουβικίνη είναι ανθρακυκλίνες που λαμβάνονται από το βακτήριο 'Streptomyces'. που στοχεύουν την ανθρώπινη τοποϊσομεράση II, σταθεροποιώντας το σύμπλοκο διάσπασης με παρόμοιο τρόπο με άλλα δηλητήρια τοποϊσομεράσης. Η μιτοξαντρόνη είναι μια συνθετική ανθρακενοδιόνη που είναι χημικά και λειτουργικά παρόμοια με τις ανθρακυκλίνες. Οι ανθρακυκλίνες ήταν οι πρώτοι αναστολείς τοποϊσομεράσης που χρησιμοποιήθηκαν για τη θεραπεία του καρκίνου και παραμένουν από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες και αποτελεσματικές θεραπείες για ένα ευρύ φάσμα καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, του λεμφώματος, των λευχαιμιών, των καρκινωμάτων, των σαρκωμάτων και άλλων όγκων. Αυτές οι ενώσεις είναι παράγοντες παρεμβολής του DNA και ως εκ τούτου μπορούν να επηρεάσουν ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών διεργασιών του DNA, εκτός από την ειδική δηλητηρίαση της τοποϊσομεράσης II. Επιπρόσθετη κυτταροτοξικότητα προέρχεται από οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις που περιλαμβάνουν ανθρακυκλίνες και οι οποίες παράγουν δραστικά είδη οξυγόνου. Η παραγωγή δραστικού οξυγόνου, μαζί με τη δηλητηρίαση από την τοποϊσομεράση IIβ, έχουν ως αποτέλεσμα την καρδιοτοξικότητα των ανθρακυκλινών που περιορίζει τη δόση.

 Μερβαρόνη 
Η μερβαρόνη είναι ένα παράγωγο του θειοβαρβιτουρικού οξέος και η δεξραζοξάνη (ICRF-187), ένα από πολλά σχετικά παράγωγα της διςδιοξοπιπεραζίνης, (Σχ. 7) που αποτελούν παραδείγματα καταλυτικών αναστολέων της τοποϊσομεράσης II, δηλαδή εμποδίζουν την ολοκλήρωση του καταλυτικού κύκλου της τοποϊσομεράσης II αλλά δεν σταθεροποιούν το σύμπλοκο διάσπασης του DNA. Ενώ αυτοί οι καταλυτικοί αναστολείς εμφανίζουν κυτταροτοξικότητα και έχουν δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές, δεν χρησιμοποιούνται επί του παρόντος σε κλινική χρήση για τη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, η δεξραζοξάνη, η οποία αναστέλλει την υδρόλυση του ATP από την τοποϊσομεράση II, χρησιμοποιείται για την πρόληψη της καρδιοτοξικότητας που σχετίζεται με τις ανθρακυκλίνες. 

ΤοποϊσομεράσηΤύπος υποοικογένειαςλειτουργίαΠολυμερικότηταΜεταλλική εξάρτησηΕξάρτηση ATPΜονόκλωνη ή δίκλωνη διάσπαση;Πολικότητα διάσπασηςΑλλαγή στον αριθμό συνδέσμου (L)Τοποϊσομεράση I
(E. coli)Τύπος IAΑφαιρεί τις (-), αλλά όχι τις (+) υπερέλικες. Αποτρέπει την υπερβολική υπερελίκωση του γονιδιώματος και υποστηρίζει τη μεταγραφή.Μονομερέςναι (Mg2+)ΌχιSSΤοποϊσομεράση III
(E. coli)Αφαιρεί τις (-), αλλά όχι τις (+) υπερέλικες. Επικαλυπτόμενη λειτουργία με την τοποϊσομεράση IVΤοποϊσομεράση IIIα
(H. sapiens)Αφαιρεί τις (-), αλλά όχι τις (+) υπερέλικες. Βοηθά στην αποσύνδεση των προκατενανίων στην κυτταρική αντιγραφή του DNA. Μπορεί να καταλύσει τη δημιουργία δεσμών, την αποσύνδεση και τη διασύνδεση μονόκλωνων κύκλων, καθώς και τη δημιουργία δεσμών, την αποσύνδεση, την αλυσιδωτή σύνδεση και την αποσύνδεση κύκλων DNA διπλού δεσμού με κενά ή σχισμές.Τοποϊσομεράση IIIβ
(H. sapiens)Φαίνεται ότι είναι μια πιθανολογούμενη RNA τοποϊσομεράση. Συμμετέχει στην επεξεργασία RNA.Αντίστροφη γυράση
(Αρχαία)Αφαιρεί τις (-), αλλά όχι τις (+) υπερέλικες, εισάγει θετικές υπερέλικεςΜονομερές και ετεροδιμερέςΝαιΤοποϊσομεράση I
(H. sapiens)Τύπος IB Αφαιρεί τις (+) και τις (-) υπερέλικες. Υποστηρίζει την κίνηση της διχάλας κατά την αντιγραφή και τη μεταγραφήΜονομερέςΌχιόχιSS3'±nΤοποϊσομεράση I

(Vaccinia virus)Τοποϊσομεράση V
(Αρχαία)Τύπος ICΧαλαρώνει τις (+) και (-) υπερέλικες. Συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA.μονομερέςΌχιΌχιSS3'±nΤοποϊσομεράση II (DNA γυράση)
(E. coli)Τύπος IIA Παράγει τις (-) υπερέλικες (η μόνη τοποϊσομεράση που είναι γνωστή ότι το κάνει)ΕτεροτετραμερέςΝαι (Mg2+)ΝαιDS5'±2Τοποϊσομεράση IV
(E. coli) Διασπά την αλυσίδα του αντιγραφομένου DNA. Χαλαρώνει τις (+) υπερέλικες γρηγορότερα από τις (-)ΕτεροτετραμερέςΤοποϊσομεράση IIα
(H. sapiens)Essential; Unlinks intertwined daughter duplexes in replication; contributes to DNA relaxation during transcription Απαραίτητο. Αποσυνδέει τα αλληλένδετα θυγατρικά διπλά μόρια κατά την αντιγραφή. Συμβάλλει στη χαλάρωση του DNA κατά τη μεταγραφήΟμοδιμερέςΤοποϊσομεράση IIβ
(H. sapiens)Ρόλος στην καταστολή του ανασυνδυασμού ή στην υποστήριξη της μεταγραφής σε νευρώνεςΟμοδιμερέςΤοποϊσομεράση VI
(Αρχαία)Τύπος IIBΧαλαρώνει τις (+) και τις (-) υπερέλικες. Είναι υπεύθυνη για την αποσύνδεση των ενδιάμεσων προϊόντων αντιγραφήςΕτεροτετραμερέςΝαι (Mg2+)ΝαιDS5'±2

 Ο ρόλος της τοποϊσομεράσης στη μεταγραφική ρύθμιση 

Τουλάχιστον μία τοποϊσομεράση, η DNA τοποϊσομεράση II βήτα, έχει ρυθμιστικό ρόλο στη μεταγραφή γονιδίων. Οι εξαρτώμενες από την Topo IIβ θραύσεις διπλής έλικας DNA και τα συστατικά του μηχανισμού επιδιόρθωσης βλαβών του DNA είναι σημαντικά για την ταχεία έκφραση των άμεσα πρώιμων γονιδίων, καθώς και για τη γονιδιακή ρύθμιση που ανταποκρίνεται στο σήμα. Η τοποϊσομεράση IIβ, με άλλα σχετικά ένζυμα, φαίνεται να είναι σημαντική για την απελευθέρωση της παυμένης RNA πολυμεράσης σε γονίδια με υψηλή μεταγραφή ή μακρά γονίδια.

 Η τοποϊσομεράση IIβ στην έναρξη της μεταγραφής 

Οι θραύσεις διπλής έλικας του DNA που προκαλούνται από ερεθίσματα και περιορίζονται σε βραχυπρόθεσμο χρονικό διάστημα (10 λεπτά έως 2 ώρες) προκαλούνται από την τοποϊσομεράση IIβ στις περιοχές υποκινητή των γονιδίων που ρυθμίζονται από το σήμα. Αυτά τα DSB επιτρέπουν την ταχεία ανοδική ρύθμιση της έκφρασης τέτοιων γονιδίων που ανταποκρίνονται στο σήμα σε έναν αριθμό συστημάτων (βλ. Πίνακα παρακάτω). Αυτά τα σηματορυθμιζόμενα γονίδια περιλαμβάνουν γονίδια που ενεργοποιούνται σε απόκριση σε διέγερση με οιστρογόνα, ορό, ινσουλίνη, γλυκοκορτικοειδή (όπως δεξαμεθαζόνη) και ενεργοποίηση νευρώνων. Όταν η επαγόμενη θραύση της διπλής έλικας του DNA έχει επιδιορθωθεί, τότε η μεταγραφή του γονιδίου που ανταποκρίνεται στο σήμα επιστρέφει σε χαμηλό βασικό επίπεδο.


Η τοποϊσομεράση IIβ και η PARP-1 βρέθηκαν να είναι σταθερά παρούσες σε μέτριο επίπεδο κοντά στην θέση έναρξης της μεταγραφής ενός υποκινητή γονιδίου που ανταποκρίνεται στο σήμα. Μετά την εμφάνιση του σήματος, η τοποϊσομεράση IIβ προκάλεσε θραύση διπλής αλυσίδας και η PARP-1 συμμετείχε στην αντικατάσταση της ιστόνης H1 από την HMGB1/HMGA2, η οποία μπορεί να προάγει τη μεταγραφή. Τα Topo IIβ και PARP-1 αυξήθηκαν στη θέση της θραύσης της διπλής αλυσίδας και τα συστατικά της οδού επιδιόρθωσης του DNA μη ομόλογης ένωσης άκρων, συμπεριλαμβανομένων των DNA-PKcs, Ku70/Ku80 και της DNA λιγάσης IV που συναρμολογήθηκαν με την topo IIβ και την PARP-1. Αυτή η συναρμολόγηση ήταν παρούσα στο συνδετικό DNA δίπλα σε ένα μόνο νουκλεόσωμα στην περιοχή προαγωγέα ενός γονιδίου (βλ. Σχήμα). Το νουκλεόσωμα βρισκόταν κοντά στη θέση έναρξης μεταγραφής του γονιδίου. Τα συστατικά της οδού επιδιόρθωσης του DNA που δεν συναρμολογείται με τα άκρα ήταν απαραίτητα για το κλείσιμο της θραύσης της διπλής αλυσίδας του DNA.

+ Παράγοντες που προκαλούν προσωρινές θραύσεις διπλής έλικας DNA (DSBs) που απαιτούνται για τη μεταγραφή και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τα DSBs σε γονίδια που ανταποκρίνονται στο σήμα. Πρόσδεμα ή ενεργοποιητικός παράγοντας Γονίδια που αξιολογήθηκαν για DSBsDSB μετά από ενεργοποίηση που προκαλείται από σήμα Το DSB ήταν απαραίτητο για μεταγραφήΘέση DSBΠρωτεΐνες που υπάρχουν στο DSBΔιάρκεια DSB μετά από ενεργοποίηση που προκαλείται από σήμαΑναφορέςΟιστραδιόληpS2ναιναιυποκινητήςτοποϊσομεράση IIβ, PARP-1, DNA-PKcs, Ku70, Ku8010 λεπτάΙνσουλίνηΣυνθάση λιπαρών οξέωνναιναιυποκινητήςτοποϊσομεράση IIβ, PARP-1, DNA-PKcs, Ku70, Ku80, πρωτεϊνική φωσφατάση 1 (PP1), P/CAF3 ώρες Θερμική καταπόνηση ή ορόςHSPA1B, JUN, FOS, EGR1, MYCναιναιυποκινητής & POLII θέση παύσηςDNA-PKcs, Ku70, γH2AX, TRIM2830 δευτερόλεπτα έως 5 λεπτά Δεξαμεθαζόνη ή οιστραδιόληPS2, MMTV, PLZF, HSD11B2ναιναιυποκινητήςτοποϊσομεράση IIβ, PARP-1, DNA-PKcs, Ku70, Ku80, BRG115 λεπτά Ενεργοποίηση KCl ή NMDA καλλιεργημένων πρωτογενών φλοιωδών νευρώνωνFOS, EGR1, NPAS4, NR4A1ναιναιυποκινητήςτοποϊσομεράση IIβ, PARP-1, DNA-PKcs, Ku70, Ku80, CTCFΜέχρι 2 ώρεςΠροσαρμογή φόβου (αξιολογήθηκε σε νευρώνες ιππόκαμπου και μέσου προμετωπιαίου φλοιού ποντικού)>200 γονίδια με νέα DSB και αυξημένη έκφρασηναιΤα DSB συσχετίστηκαν με μεταγραφήυποκινητέςδεν δοκιμάστηκαν10 λεπτά και δεύτερη κορυφή στα 30 λεπτά

Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης από το τοποϊσομεράση IIβ

Η RNA πολυμεράση II έχει συχνά μια θέση παύσης που βρίσκεται περίπου 30-60 νουκλεοτίδια κατάντη της θέσης έναρξης μεταγραφής ενός γονιδίου.  The pausing of RNA polymerase II at these sites and the controlled release of the pausing is thought to have a regulatory role in gene transcription.  As pointed out by Singh et al., Η παύση της RNA πολυμεράσης II σε αυτές τις θέσεις και η ελεγχόμενη απελευθέρωση της παύσης θεωρείται ότι έχει ρυθμιστικό ρόλο στη μεταγραφή γονιδίων. Όπως επισημαίνουν οι Singh κ.α., περίπου το 80% των γονιδίων με υψηλή έκφραση στα κύτταρα HeLa βρίσκονται σε παύση. Πολύ βραχυπρόθεσμες, αλλά όχι άμεσα επανακλεινόμενες, θραύσεις διπλής έλικας του DNA που προκαλούνται από την τοποϊσομεράση IIβ εμφανίζονται σε θέσεις παύσης της RNA πολυμεράσης II και φαίνεται να είναι απαραίτητες για την αποτελεσματική απελευθέρωση της κατάστασης παύσης και την πρόοδο στη μεταγραφή γονιδίων. Για τα γονίδια στα οποία συμβαίνει, η θραύση της διπλής έλικας του DNA που προκαλείται από το TOP2B θεωρείται ότι αποτελεί μέρος της διαδικασίας ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης.

 Παραπομπές 

 Παραπέρα μελέτη 


 Εξωτερικοί σύνδεσμοι 

Κατηγορία:Αντιγραφή DNA