Τριχοειδής ηλεκτροχρωματογραφία

Τριχοειδής ηλεκτροχρωματογραφία (αγγλ.: capillary electrochromatography ή CEC) είναι μια χρωματογραφική τεχνική στην οποία η κινητή φάση οδηγείται μέσα από την χρωματογραφική κλίνη από ηλεκτροόσμωση (electroosmosis). Η τριχοειδής ηλεκτροχρωματογραφία είναι ένας συνδυασμός δύο αναλυτικών τεχνικών, της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (High performance liquid chromatography) και της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (capillary electrophoresis). Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση σκοπεύει στον διαχωρισμό των αναλυόμενων ουσιών με βάση τον λόγο μάζας προς το φορτίο τους (mass to charge ratio) περνώντας ένα υψηλό δυναμικό μέσα από τα άκρα ενός τριχοειδούς σωλήνα (capillary tube), που γεμίζεται με την αναλυόμενη ουσία. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης διαχωρίζει τις αναλυόμενες ουσίες περνώντας τες, κάτω από υψηλή πίεση, μέσα από μια στήλη γεμάτη με τη στατική φάση (stationary phase). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ουσιών και της στατικής φάσης με την κινητή φάση (mobile phase) οδηγούν στον διαχωρισμό των αναλυόμενων ουσιών. Στην τριχοειδή ηλεκτροχρωματογραφία οι τριχοειδείς σωλήνες, πακεταρισμένοι με τη στατική φάση HPLC, υπόκεινται σε μια υψηλή τάση. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με ηλεκτροφορητική μετακίνηση των διαλυμένων ουσιών και διαφορική κατανομή.

Αρχή
Η τριχοειδής ηλεκτροχρωματογραφία (CEC) συνδυάζει τις αρχές που χρησιμοποιούνται στη HPLC και την CE. Η κινητή φάση οδηγείται κατά μήκος της χρωματογραφικής κλίνης χρησιμοποιώντας ηλεκτροόσμωση αντί για πίεση (όπως στην HPLC). Η ηλεκτροόσμωση είναι η κίνηση του επαγομένου υγρού από ένα εφαρμοζόμενο δυναμικό κατά μήκος ενός πορώδους υλικού, τριχοειδούς σωλήνα, μεμβράνης ή οποιουδήποτε άλλου υγρού αγωγού. Η ηλεκτροοσμωτική ροή προκαλείται από τη δύναμη Κουλόμπ που επάγεται από ένα ηλεκτρικό πεδίο στο καθαρό κινητό ηλεκτρικό φορτίο (net mobile electric charge) σε ένα διάλυμα. Κάτω από αλκαλικές συνθήκες, η επιφάνεια των ομάδων σιλανόλης του τετηγμένου διοξειδίου του πυριτίου (fused silica) ιονίζεται οδηγώντας σε αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια. Αυτή η επιφάνεια θα έχει μια στρώση από θετικά φορτισμένα ιόντα σε στενή εγγύτητα που είναι σχετικά ακινητοποιημένα. Αυτή η στρώση ιόντων λέγεται στοιβάδα Στερν (Stern layer). Το πάχος της διπλής στρώσης δίνεται από τον τύπο:

 δ= [εr εo  RT / 2cF²]½

όπου:

 εr = διηλεκτρική σταθερά ή σχετική επιτρεπτότητα (relative permittivity) του μέσου
 εo = επιτρεπτότητα του κενού
 R = παγκόσμια σταθερά των αερίων (universal gas constant)
 T = απόλυτη θερμοκρασία (absolute temperature)
 c = μοριακή συγκέντρωση
 F = σταθερά Φαρεντέι (Faraday constant)

Όταν ένα ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόζεται στο ρευστό (συνήθως μέσω ηλεκτροδίων τοποθετημένων στις εισόδους και τις εξόδους), το καθαρό φορτίο στην ηλεκτρική διπλή στρώση επάγεται ώστε να μετακινηθεί από τη συνισταμένη δύναμη Κουλόμπ (Coulomb). Η συνισταμένη ροή ορίζεται ως ηλεκτροοσμωτική ροή. Στην CEC τα θετικά ιόντα του ηλεκτρολύτη προστίθενται μαζί με την αναλυόμενη ουσία και συσσωρεύονται στην ηλεκτρική διπλή στρώση των σωματιδίων της πλήρωσης στήλης και με την εφαρμογή ενός ηλεκτρικού πεδίου μετακινούνται προς την κάθοδο και σύρουν την υγρή κινητή φάση μαζί τους.

Η σχέση μεταξύ της γραμμικής ταχύτητας u του υγρού στον τριχοειδή και του εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου δίνεται από την εξίσωση Σμολουτσόφσκι (Smoluchowski equation) ως εξής:

 u =  εrεoζEη

όπου:
  εr = η διηλεκτρική σταθερά ή σχετική επιτρεπτότητα του μέσου
  εo = η επιτρεπτότητα του κενού
  ζ = το δυναμικό κατά μήκος της στρώσης Στερν (Stern) (δυναμικό ζήτα)
  E = η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (Electric field strength)
  η = το ιξώδες του διαλύτη

Ο διαχωρισμός των συστατικών στην CEC βασίζεται στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ της στατικής φάσης και της διαφορικής ηλεκτροφορετικής μετανάστευσης των διαλυμένων ουσιών.

Οργανολογία και εργασία
Τα βασικά συστατικά μιας τριχοειδούς ηλεκτροχρωματογραφίας είναι ένα φιαλίδιο (vial) δείγματος, φιαλίδια προέλευσης και προορισμού, πληρωμένος τριχοειδής, ηλεκτρόδια, μια πηγή υψηλής τάσης, ένας ανιχνευτής, μια έξοδος δεδομένων  και μια συσκευή χειρισμού. Το φιαλίδιο προέλευσης, το φιαλίδιο προορισμού και ο τριχοειδής γεμίζονται με έναν ηλεκτρολύτη όπως ένα υδατικό ρυθμιστικό διάλυμα. Ο τριχοειδής είναι πληρωμένος με τη στατική φάση. Για την εισαγωγή του δείγματος, η είσοδος του τριχοειδούς τοποθετείται σε ένα φιαλίδιο που περιέχει το δείγμα και έπειτα επιστρέφεται στο πηγαίο φιαλίδιο (το δείγμα εισάγεται στον τριχοειδή μέσω μιας ενέργειας τριχοειδούς, πίεσης, ή σιφωνισμού). Η μετακίνηση των αναλυόμενων ουσιών αρχικοποιείται έπειτα από ένα ηλεκτρικό πεδίο που εφαρμόζεται μεταξύ των φιαλιδίων προέλευσης και προορισμού και παρέχεται στα ηλεκτρόδια από ρεύμα υψηλής τάσης. Οι αναλυόμενες ουσίες διαχωρίζονται καθώς μετακινούνται λόγω της ηλεκτροφορητικής τους κινητικότητας και ανιχνεύονται κοντά στο τέλος της εξόδου του τριχοειδούς. Η έξοδος του ανιχνευτή στέλνεται σε μια έξοδο δεδομένων και σε μια συσκευή επεξεργασίας όπως έναν ολοκληρωτή  (integrator) ή υπολογιστή. Τα δεδομένα τότε εμφανίζονται ως ένα ηλεκτροφόρημα (electropherogram), που αναφέρει την απάντηση του ανιχνευτή ως μια συνάρτηση του χρόνου. Οι διαχωρισμένες χημικές ενώσεις εμφανίζονται ως κορυφές με διαφορετικούς χρόνους μεταφοράς σε ένα ηλεκτροφόρημα.

Πλεονεκτήματα
Η αποφυγή της χρήσης πίεσης για την εισαγωγή της κινητής φάσης στη στήλη, καταλήγει σε έναν αριθμό σημαντικών πλεονεκτημάτων. Πρώτα απ' όλα, ο ρυθμός ροής λόγω πίεσης κατά μήκος μιας στήλης είναι ευθέως ανάλογος του τετραγώνου της διαμέτρου του σωματιδίου και αντιστρόφως ανάλογος του μήκους της στήλης. Αυτό περιορίζει το μήκος της στήλης και το μέγεθος του σωματιδίου, με το μέγεθος του σωματιδίου είναι σπάνια μικρότερο από 3 μm και το μήκος της στήλης περιορίζεται στα 25 cm. Ο ρυθμός ροής που οδηγείται ηλεκτρικά είναι ανεξάρτητος από το μήκος της στήλης και το μέγεθος. Ένα δεύτερο πλεονέκτημα της χρήσης της ηλεκτροόσμωσης στη δίοδο της κινητής φάσης στη στήλη είναι ότι η μειώνεται η διασπορά του διαλυμένης ουσίας στη στήλη, αυξάνοντας την αποτελεσματικότητα της στήλης.

Παραπομπές
 Smith, N. "Capillary ElectroChromatography" Available at:https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/bibliography?docname=AP8508ACECPrimer.pdf 
 Bartle, K. D. Capillary ElectroChromatography Published by The Royal Society of Chemistry, Cambridge. ISBN 0-85404-530-9

Κατηγορία:Χρωματογραφία
Κατηγορία:Πρωτεΐνες
Κατηγορία:Εργαστηριακές τεχνικές
Κατηγορία:Μέθοδοι μοριακής βιολογίας