Γενετική μηχανική

Η γενετική μηχανική (genetic engineering), καλούμενη επίσης και γενετική τροποποίηση (genetic modification), είναι η άμεση χειραγώγηση του γονιδιώματος ενός οργανισμού με τη χρήση της βιοτεχνολογίας.Lincoln University of Nebraska: What is genetic engineering and how does it work? Νέο DNA μπορεί να εισαχθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή με μια πρώτη απομόνωση και αντιγράφοντας το γενετικό υλικό που ενδιαφέρει με τη χρήση μεθόδων μοριακής κλωνοποίησης, για να δημιουργηθεί έτσι μία νέα αλληλουχία DNA, ή με σύνθεση του DNA, και στη συνέχεια την εισαγωγή του στον οργανισμό - ξενιστή. Γονίδια μπορούν να αφαιρεθούν με τη χρήση μίας νουκλεάσης. Η στόχευση γονιδίου είναι μια διαφορετική τεχνική, που χρησιμοποιεί ομόλογο ανασυνδυασμό για να αλλάξει ένα ενδογενές γονίδιο, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαγραφή ενός γονιδίου, αφαιρουμένων των εξωνίων, την πρόσθεση ενός γονιδίου ή να εισαγάγει σημειακές μεταλλάξεις.

Ο οργανισμός που δημιουργείται μέσω της γενετικής μηχανικής θεωρείται ως γενετικά τροποποιημένος οργανισμός (ΓΤΟ). Οι πρώτοι ΓΤΟ ήταν τα βακτήρια το 1973. Γενετικά τροποποιημένα ποντίκια δημιουργήθηκαν το 1974. Βακτήρια που παράγουν ινσουλίνη κυκλοφόρησαν για πρώτη φορά στο εμπόριο το 1982 και τα γενετικώς τροποποιημένα τρόφιμα έχουν αρχίσει να πωλούνται από το 1994. Το GlofishΠρόκειται για γενετικά τροποποιημένο ψάρι - ζέβρα για ενυδρείο, το οποίο εμφανίζει κόκκινο φθορισμό κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία, ο πρώτος ΓΤΟ που σχεδιάστηκε ως κατοικίδιο, πωλήθηκε για πρώτη φορά στις Ηνωμένες Πολιτείες τον Δεκέμβριο του 2003.

Οι τεχνικές γενετικής μηχανικής έχουν εφαρμοστεί σε πολλούς τομείς, συμπεριλαμβανομένης της έρευνας, της γεωργίας, της βιομηχανικής βιοτεχνολογίας και της ιατρικής. Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται στα απορρυπαντικά και φάρμακα όπως η ινσουλίνη και η ανθρώπινη αυξητική ορμόνη είναι πλέον δυνατό να κατασκευάζονται από γενετικά τροποποιημένα κύτταρα, πειραματικές γενετικά τροποποιημένες κυτταρικές σειρές  και γενετικά τροποποιημένα ζώα, όπως ποντίκια ή ψάρια - ζέβρες, που χρησιμοποιούνται για ερευνητικούς σκοπούς και γενετικά τροποποιημένες καλλιέργειες έχουν πλέον εμπορευματοποιηθεί.

Ορισμός
Η γενετική μηχανική μεταβάλλει τη γενετική σύσταση ενός οργανισμού με τη χρήση τεχνικών που απομακρύνουν κληρονομήσιμο γενετικό υλικό ή εισάγουν DNA το οποίο παρασκευάζεται εκτός του οργανισμού, είτε απευθείας εντός του ξενιστή ή σε ένα κύτταρο το οποίο στη συνέχεια συντήκεται ή υβριδοποιείται με τον ξενιστή.The European Parliament and the council of the European Union (12 March 2001), Official Journal of the European Communities, σελ. 17 Η διαδικασία περιλαμβάνει τη χρήση ανασυνδυασμένων νουκλεϊκών οξέων (DNA ή RNA), τεχνικές για να σχηματιστούν νέοι συνδυασμοί κληρονομήσιμου γενετικού υλικού, που ακολουθείται από τεχνικές για την ενσωμάτωση του εν λόγω υλικού, είτε έμμεσα, μέσω ενός φορέα του συστήματος, ή απευθείας μέσω μικροενέσεων, μακροέγχυσης και μικροέγκλεισης.

Η γενετική μηχανική κανονικά δεν περιλαμβάνει την παραδοσιακή αναπαραγωγή ζώων και φυτών, σε εξωσωματική γονιμοποίηση, πρόκληση πολυπλοειδίας, τεχνικές μεταλλάξεων και σύντηξης κυττάρων που δεν χρησιμοποιούν ανασυνδυασμένα νουκλεϊκά οξέα ή ένα γενετικά τροποποιημένο οργανισμό κατά τη διαδικασία,. Ωστόσο, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή έχει επίσης ορίσει, υπό την ευρεία έννοια, τη γενετική μηχανική έτσι ώστε να περιλαμβάνει τόσο την επιλεκτική αναπαραγωγή όσο και άλλα μέσα τεχνητής επιλογήςEconomic Impacts of Genetically Modified Crops on the Agri-Food Sector; P. 42 Glossary - Term and Definitions The European Commission Directorate-General for Agriculture, "Genetic engineering: The manipulation of an organism's genetic endowment by introducing or eliminating specific genes through modern molecular biology techniques. A broad definition of genetic engineering also includes selective breeding and other means of artificial selection.", Ανακτήθηκε στις 23 Φεβρουαρίου 2014. Η κλωνοποίηση και η έρευνα βλαστικών κυττάρων, αν και δεν θεωρούνται κλάδοι της γενετικής μηχανικής,, συνδέονται στενά και η γενετική μηχανική μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε αυτές. Η συνθετική βιολογία είναι αναπτυσσόμενος κλάδος της Βιολογίας που προωθεί περαιτέρω τη γενετική μηχανική με την εισαγωγή τεχνητά δημιουργημένου γενετικού υλικού από "ακατέργαστο" υλικό σε έναν οργανισμό.Ernesto Andrianantoandro, Subhayu Basu, David K Kariga & Ron Weiss (16 May 2006). "Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline". Molecular Systems Biology 2 (2006.0028): 2006.0028. doi:10.1038/msb4100073. PMC 1681505. PMID 16738572

Εάν προστίθεται στον ξενιστή γενετικό υλικό από άλλο είδος, ο προκύπτων οργανισμός καλείται διαγονιδιακός (transgenic). Εάν το γενετικό υλικό από το ίδιο είδος ή είδος που μπορεί με φυσική διαδικασία να δώσει απογόνους με τον ξενιστή, ο προκύπτων οργανισμός καλείται ομογονιδιακός (cisgenic)Jacobsen, E.; Schouten, H. J. (2008). "Cisgenesis, a New Tool for Traditional Plant Breeding, Should be Exempted from the Regulation on Genetically Modified Organisms in a Step by Step Approach". Potato Research 51: 75. Η γενετική μηχανική μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την αφαίρεση γενετικού υλικού από τον οργανισμό-στόχο, δημιουργώντας έναn οργανισμό με "εκτοπισμένο" γονίδιο (gene knockout).Capecchi, Mario R. (2001). "Generating mice with targeted mutations". Nature Medicine 7 (10): 1086–90 Στην Ευρώπη η γενετική τροποποίηση είναι συνώνυμη με τη γενετική μηχανική, ενώ στις ΗΠΑ η γενετική τροποποίηση μπορεί επίσης να παραπέμπει σε συμβατικές μεθόδους αναπαραγωγής. Το αντίστοιχο καναδικό ρυθμιστικό σύστημα βασίζεται στο κατά πόσο ένα προϊόν έχει καινοτόμα χαρακτηριστικά, ανεξάρτητα από τη μέθοδο προέλευσης. Με άλλα λόγια, ένα προϊόν προσδιορίζεται ως γενετικά τροποποιημένο, αν φέρει κάποιο χαρακτηριστικό που δεν βρέθηκε προηγουμένως στο είδος είτε παρήχθη χρησιμοποιώντας παραδοσιακές μεθόδους αναπαραγωγής (π.χ., επιλεκτική αναπαραγωγή, κυτταρική σύντηξη, αναπαραγωγή με μετάλλαξη) ή γενετική μηχανική.[McHugen, Alan (September 14, 2000). "Chapter 1: Hors-d'oeuvres and entrees/What is genetic modification? What are GMOs?". Pandora's Picnic Basket. Oxford University Press. ISBN 978-0198506744] Στο πλαίσιο της επιστημονικής κοινότητας, ο όρος γενετική μηχανική δεν είναι συνήθως σε χρήση, προτιμώνται οι επιμέρους πιο συγκεκριμένοι όροι, όπως διαγονιδιακός κλπ.

Γενετικά τροποποιημένοι οργανισμοί
Τα φυτά, τα ζώα ή οι μικροοργανισμοί που έχουν υποστεί αλλαγές μέσω γενετικής μηχανικής ονομάζονται γενετικά τροποποιημένοι οργανισμοί ή ΓΤΟ. Τα βακτήρια ήταν οι πρώτοι οργανισμοί που υπέστησαν γενετική τροποποίηση. DNA από το πλασμίδιο που περιέχει νέα γονίδια μπορεί να εισαχθεί μέσα στο βακτηριακό κύτταρο και τα βακτήρια στη συνέχεια θα εκφράσουν αυτά τα γονίδια, παράγοντας τις αντίστοιχες πρωτεΐνες. Αυτά τα γονίδια μπορούν να κωδικοποιούν για τα φάρμακα ή ένζυμα που επεξεργάζονται τρόφιμα και άλλα υποστρώματα.Panesar, Pamit et al (2010) "Enzymes in Food Processing: Fundamentals and Potential Applications", Chapter 10, I K International Publishing House, ISBN 978-9380026336 Τα φυτά έχουν τροποποιηθεί για προστασία απέναντι στα έντομα, ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα, αντοχή σε ιούς, ενισχυμένη διατροφή, ανοχή σε περιβαλλοντικές πιέσεις και την παραγωγή κατάλληλων εμβολίων."GM traits list". International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications Οι περισσότεροι ΓΤΟ του εμπορίου είναι ανθεκτικοί σε έντομα ή / και σε ζιζανιοκτόνα φυτά."ISAAA Brief 43-2011: Executive Summary". International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications Γενετικά τροποποιημένα ζώα χρησιμοποιήθηκαν για έρευνα, ως πειραματόζωα και για παραγωγή γεωργικών ή φαρμακευτικών προϊόντων. Σε αυτά περιλαμβάνονται ζώα με γονίδια "νοκ άουτ", με αυξημένη ευαισθησία σε ασθένειες, με ορμόνες για επιπλέον ανάπτυξη και ικανότητα να εκφράζουν τις πρωτεΐνες στο γάλα τους.

Ιστορικό
Ο άνθρωπος άλλαζε τα γονιδιώματα των ειδών επί χιλιάδες χρόνια μέσω της τεχνητής επιλογής και, πιο πρόσφατα, με τη βοήθεια των τεχνητών μεταλλάξεων. Η γενετική μηχανική ως άμεσος τρόπος χειρισμού του DNA από τον άνθρωπο, εκτός των προαναφερθεισών μεθόδων, υφίσταται μόλις από τη δεκαετία του 1970. Ο όρος «γενετική μηχανική» επινοήθηκε για πρώτη φορά από τον Τζακ Ουίλλιαμσον (Jack Williamson) στο μυθιστόρημα επιστημονικής φαντασίας "Νησί του Δράκου", που δημοσιεύθηκε το 1951,Stableford, Brian M. (2004). Historical dictionary of science fiction literature. σελ. 133. ISBN 9780810849389 ένα έτος πριν από τη διευκρίνιση του ρόλου του DNA στην κληρονομικότητα, που επιβεβαιώθηκε από τους Alfred Hershey και Martha Chase ,Hershey A, Chase M (1952). "Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage" (PDF). J Gen Physiol 36 (1): 39–56. doi:10.1085/jgp.36.1.39 και δύο χρόνια πριν οι Τζέιμς Γουότσον (James Watson) και Φράνσις Κρικ (Francis Crick) καταδείξουν ότι το μόριο του DNA έχει δομή διπλής έλικας.

Το 1972 ο Πωλ Μπεργκ (Paul Berg) δημιούργησε τα πρώτα μόρια ανασυνδυασμένου DNA συνδυάζοντας DNA από τον ιό πιθήκου SV40 με εκείνο του ιού λάμδα. Το 1973 οι Χέρμπερτ Μπόιερ (Herbert Boyer) και Στάνλεϋ Κοέν (Stanley Cohen) δημιούργησαν τον πρώτο διαγονιδιακό οργανισμό, εισάγοντας γονίδια αντίστασης σε αντιβιοτικά στο πλασμίδιο ενός βακτηρίου Εscherichia coli. Ένα χρόνο αργότερα ο Ρούντολφ Γένιχ Rudolf Jaenisch δημιούργησε ένα διαγονιδιακό ποντίκι με την εισαγωγή ξένου DNA σε έμβρυό του, καθιστώντας το το πρώτο στον κόσμο διαγονιδιακό ζώο.Jaenisch, R. and Mintz, B. (1974 ) Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc. Natl. Acad. 71(4) 1250–1254   Αυτά τα επιτεύγματα είχαν ως αποτέλεσμα να εκφραστούν ανησυχίες της επιστημονικής κοινότητας σχετικά με τους πιθανούς κινδύνους από τη γενετική μηχανική, τα οποία συζητήθηκαν πρώτα σε βάθος στο Συνέδριο Asilomar το 1975. Μία από τις κύριες συστάσεις από αυτή τη συνάντηση ήταν ότι θα πρέπει να καθιερωθεί εποπτεία της κυβέρνησης της έρευνας ανασυνδυασμένου DNA έως ότου η τεχνολογία θεωρηθεί ασφαλής.

Το 1976 η Genentech, η πρώτη εταιρεία γενετικής μηχανικής, ιδρύθηκε από τους Herbert Boyer και Robert Swanson και ένα χρόνο αργότερα η εταιρεία παρήγαγε μια ανθρώπινη πρωτεΐνη (σωματοστατίνη) από το βακτήριο E.coli. Η Genentech ανακοίνωσε την παραγωγή ανθρώπινης ινσουλίνης το 1978.

Το 1980, το Ανώτατο Δικαστήριο των ΗΠΑ στην υπόθεση Diamond κατά Chakrabarty έκρινε ότι η γενετικά τροποποιημένη ζωή θα μπορούσε να κατοχυρωθεί με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας. Η ινσουλίνη που παράγεται από βακτήρια, με την εμπορική ονομασία "humulin", εγκρίθηκε να κυκλοφορήσει στο εμπόριο από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων το 1982.

Στη δεκαετία του 1970 ο μεταπτυχιακός φοιτητής Στίβεν Λίνταου (Steven Lindow) του Πανεπιστημίου του Wisconsin-Madison μαζί με τους με DC Arny και C. Upper βρήκε ένα βακτήριο, που προσδιόρισε ως P. syringae, που έπαιξε σημαντικό ρόλο στην επαγωγή σχηματισμού πυρήνων πάγου και, το 1977, ανακάλυψε ένα μεταλλαγμένο στέλεχος. Αργότερα, δημιούργησε με επιτυχία ένα ανασυνδυασμένο στέλεχος το οποίο μείωνε τον σχηματισμό πάγου.H. Patricia Hynes. (1989) Biotechnology in agriculture: an analysis of selected technologies and policy in the United States.  Reproductive and Genetic Engineering (2)1:39–49   Το 1983, μια εταιρεία βιοτεχνολογίας, η Advanced Genetic Sciences (AGS) έκανε αίτηση για κυβερνητική έγκριση  να πραγματοποιήσει δοκιμές πεδίου με το στέλεχος του P. syringae για την προστασία των καλλιεργειών από τον παγετό, αλλά  ομάδες διαδηλωτών για την προστασία του περιβάλλοντος καθυστέρησαν τις δοκιμές πεδίου για τέσσερα χρόνια με νομικές παρεμβάσεις.Rebecca Bratspies (2007) Some Thoughts on the American Approach to Regulating Genetically Modified Organisms.  Kansas Journal of Law and Public Policy 16:393  Το 1987, το τροποποιημένο στέλεχος του P. syringae έγινε ο πρώτος γενετικά τροποποιημένος οργανισμός (ΓΤΟ) που απελευθερώθηκε στο περιβάλλονBBC News 14 June 2002 GM crops: A bitter harvest?, όταν ένα χωράφι με καλλιέργεια φράουλας και ένας αγρός καλλιέργειας πατάτας στην Καλιφόρνια ψεκάστηκαν με αυτόThomas H. Maugh II for the Los Angeles Times. June 09, 1987.  Altered Bacterium Does Its Job : Frost Failed to Damage Sprayed Test Crop, Company Says. Και τα δύο πεδία δοκιμής δέχθηκαν επίθεση από ομάδες ακτιβιστών το βράδυ πριν από τις δοκιμές.

Οι πρώτες δοκιμές στον τομέα των γενετικά τροποποιημένα φυτών πραγματοποιήθηκαν στη Γαλλία και τις ΗΠΑ το 1986, με φυτά καπνού που είχαν "κατασκευαστεί" για να είναι ανθεκτικά στα ζιζανιοκτόνα. Η Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας ήταν η πρώτη χώρα για που κυκλοφόρησε στο εμπόριο διαγονιδιακά φυτά, παρουσιάζοντας φυτά καπνού ανθεκτικά στον ιό της μωσαϊκής το 1992. Το 1994 η εταιρία Monsanto - Calgene έλαβε έγκριση για να κυκλοφορήσει στο εμπόριο την τομάτα Flavr Savr, τομάτα με μεγαλύτερη διάρκεια ζωής μετά την κοπή της από το φυτό, ώστε να αντέχει στα ράφια των εμπόρων χωρίς να σαπίζει. Το 1994, η Ευρωπαϊκή Ένωση ενέκρινε την εμπορία φυτών καπνού κατασκευασμένων  για να είναι ανθεκτικά στο ζιζανιοκτόνο bromoxynil, καθιστώντας την την πρώτη εμπορική  καλλιέργεια γενετικά τροποποιμένων φυτών στην Ευρώπη. Το 1995, η ποικιλία πατάτας Bt κρίθηκε ως ασφαλής από την Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος, αφού εγκρίθηκε από την Υπηρεσία Ελέγχουν Τροφίμων, καθιστώντας την το πρώτο ζιζανιοκτόνο φυτό εγκρίθηκε στις ΗΠΑ.Genetically Altered Potato Ok'd For Crops Lawrence Journal-World - 6 May 1995 Το 2009, 11 διαγονιδιακά φυτά αναπτύχθηκαν εμπορικά σε 25 χώρες, με τη σειρά, κατά καλλιεργούμενη έκταση, ΗΠΑ, Βραζιλία, Αργεντινή, Ινδία, Καναδάς, Κίνα, Παραγουάη και Νότια Αφρική.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2009 ISAAA Brief 41-2009, 23 February 2010. Retrieved 10 August 2010

Στα τέλη της δεκαετίας του 1980 και στις αρχές της δεκαετίας του 1990, κατευθυντήριες γραμμές για την αξιολόγηση της ασφάλειας των γενετικά τροποποιημένων φυτών και τροφίμων δόθηκαν από οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένου του FAO και της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας.WHO (1987): Principles for the Safety Assessment of Food Additives and Contaminants in Food, Environmental Health Criteria 70. World Health Organization, GenevaWHO (1991): Strategies for assessing the safety of foods produced by biotechnology, Report of a Joint FAO/WHO Consultation. World Health Organization, GenevaWHO (1993): Health aspects of marker genes in genetically modified plants, Report of a WHO Workshop. World Health Organization, GenevaWHO (1995): Application of the principle of substantial equivalence to the safety evaluation of foods or food components from plants derived by modern biotechnology, Report of a WHO Workshop. World Health Organization, Geneva

Το 2010, επιστήμονες στο Ινστιτούτο J. Craig Venter ανακοίνωσαν ότι δημιουργήσαν το πρώτο συνθετικό βακτηριακό γονιδίωμα και το πρόσθεσαν ότι σε κύτταρο που δεν περιείχε DNA. Το βακτήριο, που ονομάστηκε Synthia, ήταν η πρώτη στον κόσμο συνθετική μορφή ζωής.

Διαδικασία
Το πρώτο βήμα είναι να επιλεγεί και να απομονωθεί το γονίδιο που θα εισαχθεί στον γενετικώς τροποποιημένο (ΓΤ) οργανισμό. Από το 2012, τα περισσότερα εμπορευματοποιημένα ΓΤ φυτά έχουν γονίδια που μεταφέρονται σε αυτούς που παρέχουν προστασία έναντι των εντόμων ή ανοχή στα ζιζανιοκτόνα.  Το γονίδιο μπορεί να απομονωθεί με τη χρήση ενζύμων περιορισμού για να κοπεί σε τμήματα DNA και στη συνέχεια με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα για να διαχωριστούν τα τμήματα ανάλογα με το μήκος τους. Ξ αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να ενισχύσει τμήμα γονιδίου, το οποίο μπορεί στη συνέχεια να απομονωθεί μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης.. Εάν το συγκεκριμένο επιλεγμένο γονίδιο ή το γονιδίωμα οργανισμού - δότη έχει καλά μελετηθεί, μπορεί να είναι παρόν σε μια γενετική βιβλιοθήκη. Εάν η αλληλουχία DNA είναι γνωστή, αλλά δεν υπάρχουν αντίγραφα του γονιδίου διαθέσιμα, μπορεί να συντεθεί τεχνητά.

Το γονίδιο που πρόκειται να εισαχθεί μέσα στο γενετικώς τροποποιημένο οργανισμό πρέπει να συνδυάζεται με άλλα γενετικά στοιχεία, προκειμένου να λειτουργήσει σωστά. Το γονίδιο μπορεί επίσης να τροποποιηθεί σε αυτό το στάδιο για καλύτερη έκφραση ή αποτελεσματικότητα. Το γονίδιο που πρόκειται να εισαχθεί πρέπει να περιέχει μια περιοχή έναρξης και μια περιοχή τερματισμού, καθώς και ένα επιλέξιμο δείκτη γονιδίου. Η περιοχή έναρξης εκκινεί τη μεταγραφή του γονιδίου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της θέσης και το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης, ενώ η περιοχή τερματισμού είναι αυτή που ολοκληρώνει τερματίζοντας τη μεταγραφή. Ο επιλέξιμος δείκτης, που στις περισσότερες περιπτώσεις προσδίδει ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικό στον οργανισμό, είναι απαραίτητος για να καθοριστεί ποια κύτταρα μετασχηματίζονται με το νέο γονίδιο. Τα παρασκευάσματα γίνονται χρησιμοποιώντας τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA, όπως ένζυμο προσδέσεων (λιγάση του DNA) και μοριακής κλωνοποίησης. Ο χειρισμός του DNA πραγματοποιείται, εν γένει, σε πλασμίδιο.

Η πιο κοινή μορφή της γενετικής μηχανικής περιλαμβάνει την εισαγωγή νέου γενετικού υλικού τυχαία μέσα στο γονιδίωμα του ξενιστή. Άλλες τεχνικές επιτρέπουν την εισαγωγή νέου γενετικού υλικού, που θα εισαχθεί σε μια συγκεκριμένη θέση στο γονιδίωμα του ξενιστή, ή τη δημιουργία μεταλλάξεων στην επιθυμητή γονιδιωματική περιοχή ικανή να εκτοπίσει τα ενδογενή γονίδια. Η τεχνική της γονιδιακής στόχευσης χρησιμοποιεί ομόλογο ανασυνδυασμό για να στοχεύσει τις επιθυμητές αλλαγές σε συγκεκριμένο ενδογενές γονίδιο. Αυτό τείνει να συμβεί σε σχετικά χαμηλή συχνότητα σε φυτά και ζώα και γενικά απαιτεί τη χρήση επιλέξιμων δεικτών.  Η συχνότητα της γονιδιακής στόχευσης μπορεί να ενισχυθεί σε μεγάλο βαθμό με τη χρήση επεξεργασμένων νουκλεασών όπως νουκλεάσες δακτύλου ψευδαργύρου, (zinc finger nucleases) ενδονουκλεάσες μηχανικής παλιννόστησης ή νουκλεάσες δημιουργούμενες από μηχανισμό μεταγραφής (transcription activator-like)Πρόκειται για πρωτεΐνες που παράγονται από το βακτήριο Xanthomonas, όταν προσβάλλει ορισμένα φυτικά είδη. Εκτός από την ενίσχυση της γονιδιακής στόχευσης, οι επεξεργασμένες νουκλεάσες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για να εισαγάγουν μεταλλάξεις σε ενδογενή γονίδια, που δημιουργούν ένα εκτοπιζόμενο γονίδιο.

Μετασχηματισμός
Περίπου 1% των βακτηρίων είναι εκ φύσεως σε θέση να δεχθούν ξένο DNA. Αν, για παράδειγμα, τα βακτήρια υποβληθούν σε "πίεση" με σοκ θερμότητας ή ηλεκτρικό σοκ, είναι πιθανόν η κυτταρική μεμβράνη τους να γίνει διαπερατή σε DNA, που μπορεί, στη συνέχεια, να ενσωματωθεί στο γονιδίωμά τους ή να υφίσταται ως εξωχρωμοσωμικό DNA. Το DΝΑ εν γένει εισάγεται σε ζωικά κύτταρα χρησιμοποιώντας μικροέγχυση, με την οποία μπορεί να εγχυθεί  απευθείας εντός του πυρήνα ή μέσω χρήσης των ιικών φορέων. Στα φυτά το DNA γενικά εισάγεται χρησιμοποιώντας τη μεσολάβηση του ανασυνδυασμένου Agrobacterium ή με τη χρήση "γονιδιακού όπλου" (gene gun).

Στο ανασυνδυασμένο Agrobacterium το κατασκευασμένο πλασμίδιο περιέχει Τ-DΝΑ , δηλαδή DΝΑ το οποίο είναι υπεύθυνο για την εισαγωγή του DNA στο γονιδίωμα του φυτού - ξενιστή. Αυτό το πλασμίδιο μεταφέρεται στο Agrobacterium, που δεν περιέχει πλασμίδια και, στη συνέχεια, "μολύνονται" τα φυτικά κύτταρα. Το Agrobacterium τότε φυσικά θα εισαγάγει το γενετικό του υλικό σε φυτικά κύτταρα. Στον βιολιστικό μετασχηματισμό, σωματίδια χρυσού ή βολφραμίου, επικαλύπτονται με DNA και στη συνέχεια εξακοντίζονται σε νεαρά κύτταρα φυτών ή φυτικών εμβρύων. Τμήματα από το γενετικό υλικό θα εισέλθουν στα κύτταρα και θα τα μετασχηματίσει. Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε φυτά που δεν είναι ευαίσθητα σε "μόλυνση" από Agrobacterium και επίσης επιτρέπει μετασχηματισμό των πλαστιδίων. Μία άλλη μέθοδος μετασχηματισμού για φυτικά και ζωικά κύτταρα είναι η ηλεκτροδιάτρηση (electroporation). Η ηλεκτροδιάτρηση συνίσταται στην υποβολή φυτικών ή ζωικών κυττάρων σε ηλεκτρική εκκένωση, η οποία μπορεί να κάνει την κυτταρική μεμβράνη διαπερατή από το DNA πλασμιδίου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα ηλεκτροδιάτρητά κύτταρα θα ενσωματώσουν το DNA στο γονιδίωμά τους. Λόγω των ζημιών που προκλήθηκαν στα κύτταρα και το DNA η απόδοση μετατροπής μέσω βιολιστικών και μεθόδων ηλεκτροδιάτρησης είναι χαμηλότερη από  μετασχηματισμό με τη μεσολάβηση και μικροέγχυση με τη βοήθεια του Agrobacterium.

Καθώς συχνά μόνο ένα κύτταρο μετασχηματίζεται με γενετικό υλικό, ο οργανισμός πρέπει να αναγεννηθεί από αυτό το κύτταρο και μόνο. Επειδή τα βακτήρια αποτελούνται από ένα μόνο κύτταρο η αναγέννηση αυτή δεν είναι απαραίτητη. Στα φυτά αυτό επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης ιστοκαλλιέργειας. Κάθε είδος φυτού έχει διαφορετικές απαιτήσεις για την επιτυχή αναγέννηση ιστών μέσω ιστοκαλλιέργειας. Αν είναι επιτυχής, δημιουργείται νέος φυτικός οργανισμός, που περιέχει το διαγονιδιακό DNA σε κάθε του κύτταρο. Στα ζώα είναι απαραίτητο να εξασφαλιστεί ότι το εισαχθέν DNA είναι παρόν στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Επιλέξιμοι δείκτες χρησιμοποιούνται για να εντοπιστούν τα διαγονιδιακά από τα μη διαγονιδιακά κύτταρα. Αυτοί οι δείκτες είναι συνήθως παρόντες στον διαγονιδιακό οργανισμό, αν και έχει αναπτυχθεί ένας αριθμός από στρατηγικές που μπορούν να αφαιρέσουν τον επιλέξιμο δείκτη από το ώριμο διαγονιδιακό φυτό. Όταν παραχθούν απόγονοι, μπορούν να υποβληθούν σε διαλογή για την παρουσία του γονιδίου. Όλοι οι απόγονοι από την πρώτη γενεά θα είναι ετερόζυγοι για το νεοεισαχθέν γονίδιο και πρέπει να ζευγαρώσουν μεταξύ τους για να παραγάγουν ομόζυγο ζώο.

Περαιτέρω δοκιμές χρησιμοποιούν τεχνικές όπως η PCR (Polymerase chain reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), εντοπισμό τεχνικής SouthernΠρόκειται για τεχνική που επιτρέπει την ταυτοποίηση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA σε δείγμα. Αποκαλείται, επίσης, και southern blot, για να επιβεβαιωθεί ότι ο οργανισμός περιέχει το νέο γονίδιο. Αυτές οι δοκιμές μπορούν επίσης να επιβεβαιώσουν τη χρωμοσωμική θέση και τον αριθμό των αντιγράφων του εισαχθέντος γονιδίου. Η απλή παρουσία του γονιδίου δεν εγγυάται ότι θα είναι σε θέση αυτό να εκφραστεί σε κατάλληλα επίπεδα στον ιστό - στόχο, και έτσι χρησιμοποιούνται επίσης μέθοδοι που αναζητούν και μετρούν τα προϊόντα που προκύπτουν από την έκφραση του γονιδίου (RNA και πρωτεΐνη). Οι μέθοδοι αυτές περιλαμβάνουν τεστ υβριδοποίησης "Northern", ποσοτική RT-PCR , στύπωμα Western , ανοσοφθορισμό , ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay, μέθοδος ανίχνευσης ουσιών μέσω αντισωμάτων και μεταβολών χρωματισμού) και φαινοτυπική ανάλυση. Για σταθερό μετασχηματισμό, το γονίδιο θα πρέπει να "περάσει" στους απογόνους εμφανίζοντας τύπο  Μενδελιανής κληρονομικότητας, γι' αυτό και μελετώνται επίσης οι απόγονοι του οργανισμού.

Επεξεργασία του γονιδιώματος
Η επεξεργασία του γονιδιώματος είναι μια μορφή της γενετικής μηχανικής στην οποία το DNA εισάγεται, αντικαθίσταται ή απομακρύνεται από το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας τεχνητά επεξεργασμένες νουκλεάσες ή, όπως αποκαλούνται, «μοριακά ψαλίδια». Οι νουκλεάσες αυτές μπορούν να δημιουργήσουν ειδικές διακοπές της διπλής έλικας (DSBs) σε επιθυμητές θέσεις στο γονιδίωμα, και να αξιοποιήσουν τους ενδογενείς μηχανισμούς του κυττάρου για την επιδιόρθωση της επαγόμενης δικοπής από τις φυσικές διαδικασίες του ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) και μη ομόλογους συνδέσμους τέλους (Nonhomologous end joining, NHEJ). Υπάρχουν, επί του παρόντος, τέσσερις οικογένειες παρόμοιων νουκλεασών: οι μεγανουκλεάσες, οι νουκλεάσες με δακτύλιο ψευδαργύρου (ZFNs), οι ενεργοποιητές μεταγραφής -όπως νουκλεάσες - τελεστές; (Talens), και οι CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) δηλ. περιοχές του DNA που περιέχουν πολλές, σύντομες, άμεσες επαναλήψεις των αλληλουχιών βάσεων.

Εφαρμογές

Η γενετική μηχανική έχει εφαρμογές στην ιατρική, την έρευνα, τη βιομηχανία και τη γεωργία και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ευρύ φάσμα φυτών, ζώων και μικροοργανισμών.

Ιατρική

Στην ιατρική η γενετική μηχανική έχει χρησιμοποιηθεί για τη μαζική παραγωγή ινσουλίνης, ανθρώπινων αυξητικών ορμονών, FOLLISTIM (Ουροφολινοτροπίνης [Urofollitropin], δηλ. εξευγενισμένης μορφής της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης για τη θεραπεία της στειρότητας), ανθρώπινης αλβουμίνης, μονόκλωνων αντισωμάτων, αντιαιμοφιλικών παραγόντων, εμβολίων και πολλών άλλων φαρμάκων.(10 December 2012) Engineering algae to make complex anti-cancer 'designer' drug PhysOrg, Retrieved 15 April 2013 Ο εμβολιασμός περιλαμβάνει, γενικά, έγχυση αδύναμων ζωντανών μικροοργανισμών, νεκρές ή αδρανοποιημένες μορφές ιών ή των τοξινών τους στο πρόσωπο που εμβολιάζεται. Οι γενετικά τροποποιημένοι ιοί που αναπτύσσονται είναι δυνατόν να προκαλέσουν ανοσία, αλλά η τους έχουν αφαιρεθεί οι μολυσματικές ακολουθίες. Σε  υβριδώματα ποντικών, κύτταρα συντήκονται για να δημιουργήσουν μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία έχουν εξανθρωπισθεί μέσω γενετικής μηχανικής για τη δημιουργία ανθρώπινων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η γενετική μηχανική έχει αρχίσει να υπόσχεται πολλά για τη θεραπεία ορισμένων μορφών καρκίνου.Coghlan, Andy (26 March 2013) Gene therapy cures leukaemia in eight days The New Scientist, Retrieved 15 April 2013Coghlan, Andy (10 February 2013)  Liver cancer survival time tripled by virus New Scientist, Retrieved 15 April 2013

Η γενετική μηχανική χρησιμοποιείται για να δημιουργηθούν μοντέλα ανθρώπινων ασθενειών σε ζώα. Τα γενετικά τροποποιημένα ποντίκια είναι η πιο κοινά χρησιμοποιούμενη εφαρμογή αυτού του τομέα. Έχουν χρησιμοποιηθεί για να μελετηθούν ο καρκίνος (το ογκοποντίκι (oncomouse)), η παχυσαρκία, οι καρδιακές παθήσεις, ο διαβήτης, η αρθρίτιδα, η κατάχρηση ουσιών, το άγχος, η γήρανση και η νόσος του Πάρκινσον. Πιθανές θεραπείες μπορεί να δοκιμάζονται με χρήση αυτών των μοντέλων σε ποντίκια. Έχουν εκτραφεί επίσης γενετικώς τροποποιημένοι χοίροι, με στόχο την αύξηση της επιτυχίας της μεταμόσχευσης οργάνου χοίρου σε ανθρώπινο οργανισμό.

Παραπομπές

Εξωτερικοί σύνδεσμοι


Κατηγορία:Βιοτεχνολογία
Κατηγορία:Βιολογική μηχανική

Κατηγορία:Αναδυόμενες τεχνολογίες
Κατηγορία:Μοριακή βιολογία