Συμπληρωματικό DNA

Στη γενετική, το συμπληρωματικό DNA (cDNA) είναι το DNA που μεταγράφηκε αντίστροφα (μέσω αντίστροφης μεταγραφάσης) από ένα RNA (π.χ., αγγελιοφόρο RNA ή μικροRNA. Το cDNA υπάρχει τόσο σε μονόκλωνες όσο και σε δίκλωνες μορφές και σε φυσική και σε τεχνητή μορφή.
Στις τεχνητές μορφές, είναι συχνά ένα αντίγραφο του φυσικού DNA από το φυσικό γονιδίωμα οποιουδήποτε συγκεκριμένου οργανισμού. Το mRNA του ίδιου του οργανισμού μεταγράφηκε φυσικά από το DNA του και το cDNA μεταγράφεται αντίστροφα από το mRNA, δίνοντας ένα αντίγραφο του αρχικού DNA. Το τεχνητό cDNA χρησιμοποιείται συχνά για την έκφραση συγκεκριμένης πρωτεΐνης σε ένα κύτταρο που κανονικά δεν εκφράζει αυτήν την πρωτεΐνη (δηλαδή, ετερόλογη έκφραση), ή για την αλληλουχία ή τον ποσοτικό προσδιορισμό μορίων mRNA χρησιμοποιώντας μεθόδους που βασίζονται στο DNA (qPCR, RNA-seq). Το cDNA που κωδικοποιεί μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη μπορεί να μεταφερθεί σε ένα κύτταρο-δέκτη για έκφραση ως μέρος του ανασυνδυασμένου DNA, συχνά συστημάτων έκφρασης βακτηρίων ή ζυμομυκήτων. Το cDNA δημιουργείται επίσης για την ανάλυση μεταγραφωμικών κατατομών (προφίλ) σε ιστούς όγκου, μεμονωμένων κυττάρων ή μεμονωμένων πυρήνων σε προσδιορισμούς όπως σε μικροσυστοιχίες (microarrays), αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR) και RNA-seq.
Σε φυσικές μορφές, το cDNA παράγεται από ρετροϊούς (όπως HIV 1 και 2, ιός ανοσοανεπάρκειας πιθήκου, κ.λπ.) και στη συνέχεια ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή, όπου δημιουργεί έναν προϊό.
Ο όρος cDNA χρησιμοποιείται επίσης, τυπικά σε ένα πλαίσιο βιοπληροφορικής, για να αναφέρεται σε μια αλληλουχία μεταγραφήματος mRNA, που εκφράζεται ως βάσεις DNA (δεοξυ-GCAT) αντί για βάσεις RNA (GCAU).
Η κατοχύρωση με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας του cDNA αποτέλεσε αντικείμενο απόφασης του Ανωτάτου Δικαστηρίου των ΗΠΑ του 2013  στην υπόθεση της Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc. Ως συμβιβαστική λύση, το Δικαστήριο έκρινε ότι μόνο εξώνια cDNA είναι κατάλληλα για ευρεσιτεχνία, ενώ μεμονωμένες αλληλουχίες DNA που εμφανίζονται στη φύση συμπεριλαμβανομένων των εσωνίων δεν είναι.
 Σύνθεση 
Το RNA χρησιμεύει ως πρότυπο για τη σύνθεση cDNA. Στην κυτταρική ζωή, το cDNA παράγεται από ιούς και ρετρομεταθετόνια για την ενσωμάτωση του RNA στο στόχο γονιδιωματικό δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ. Στη μοριακή βιολογία, το RNA καθαρίζεται από το αρχικό υλικό αφού αφαιρεθούν το γονιδιωματικό DNA, οι πρωτεΐνες και άλλα κυτταρικά συστατικά. Το cDNA στη συνέχεια συντίθεται μέσω in vitro αντίστροφης μεταγραφής.
 Καθαρισμός RNA 
Το RNA μεταγράφεται από το γονιδιωματικό DNA σε κύτταρα ξενιστές και εκχυλίζεται πρώτα από λυτικά κύτταρα και στη συνέχεια καθαρίζεται το RNA χρησιμοποιώντας ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθόδους όπως φαινόλη-χλωροφόρμιο, στήλη πυριτίου και μεθόδους εκχύλισης RNA με βάση σφαιρίδια. Οι μέθοδοι εξαγωγής ποικίλλουν ανάλογα με το αρχικό υλικό. Για παράδειγμα, η εξαγωγή RNA από φυτικό ιστό απαιτεί πρόσθετα αντιδραστήρια, όπως η πολυβινυλοπυρρολιδόνη (PVP), για την απομάκρυνση των φαινολικών ενώσεων, των υδατανθράκων και άλλων ενώσεων που διαφορετικά θα καταστήσουν το RNA άχρηστο. Για την απομάκρυνση του DNA και των πρωτεϊνών, χρησιμοποιούνται ένζυμα όπως η δεοξυνουκλεάση (DNase) και η πρωτεϊνάση K για αποικοδόμηση. Είναι σημαντικό ότι η ακεραιότητα του RNA διατηρείται με την απενεργοποίηση των ριβονουκλεασών με χαοτροπικούς παράγοντες όπως το ισοθειοκυανικό γουανιδίνιο, το δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), η φαινόλη ή το χλωροφόρμιο. Στη συνέχεια, το ολικό RNA διαχωρίζεται από άλλα κυτταρικά συστατικά και κατακρημνίζεται με αλκοόλη. Υπάρχουν διάφορα εμπορικά προϊόντα για απλές και γρήγορες εξαγωγές RNA για συγκεκριμένες εφαρμογές. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν πρόσθετες μέθοδοι που βασίζονται σε σφαιρίδια για την απομόνωση συγκεκριμένων υποτύπων RNA (π.χ. mRNA και μικροRNA με βάση το μέγεθος ή τις μοναδικές περιοχές RNA.
 Αντίστροφη μεταγραφή 
 Σύνθεση πρώτου κλώνου 
Χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο αντίστροφης μεταγραφάσης και καθαρισμένα εκμαγεία RNA, παράγεται ένας κλώνος cDNA (σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου). Η αντίστροφη μεταγραφάση M-MLV από τον ιό της λευχαιμίας τρωκτικού Moloney χρησιμοποιείται συνήθως λόγω της μειωμένης δραστηριότητάς της ριβονουκλεάσης Η που είναι κατάλληλη για μεταγραφή μακρύτερων RNAs. Η αντίστροφη μεταγραφάση AMV από τον ιό της μυελοβλάστωσης των πτηνών μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για εκμαγεία RNA με ισχυρές δευτερεύουσες δομές (δηλ. υψηλή θερμοκρασία τήξης). Το cDNA δημιουργείται συνήθως από mRNA για αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο(RT-qPCR) και αλληλούχιση RNA (RNA-seq). Το mRNA μεταγράφεται επιλεκτικά αντίστροφα χρησιμοποιώντας εκκινητές ολιγο-dΤ που είναι το αντίστροφο συμπλήρωμα της πολυαδενυλιωμένης ουράς στο 3' άκρο όλου του mRNA. Ο εκκινητής ολιγο-dT αναδιατάσσεται στην πολυαδενυλιωμένη ουρά του mRNA για να χρησιμεύσει ως θέση δέσμευσης για την ανάστροφη μεταγραφάση ώστε να ξεκινήσει η αντίστροφη μεταγραφή. Ένα βελτιστοποιημένο μείγμα εκκινητών ολίγο-dT και τυχαίου εξαμερούς αυξάνει την πιθανότητα απόκτησης cDNA πλήρους μήκους, ενώ μειώνει την απόκλιση 5' ή 3'. Το ριβοσωμικό RNA μπορεί επίσης να εξαντληθεί για να εμπλουτιστεί τόσο το mRNA όσο και τα μη πολυ-αδενυλιωμένα μεταγραφήματα όπως κάποιο μη κωδικοποιητικό RNA.

 Σύνθεση δεύτερου κλώνου 
Το αποτέλεσμα των συνθέσεων του πρώτου κλώνου, τα υβρίδια RNA-DNA, μπορεί να επεξεργαστούν μέσω πολλαπλών μεθόδων σύνθεσης δεύτερου κλώνου ή να επεξεργαστούν απευθείας σε κατάντη αναλύσεις. Μια πρώιμη μέθοδος γνωστή ως σύνθεση με φουρκέτα βασιζόταν στον σχηματισμό φουρκέτας στο 3' άκρο του cDNA του πρώτου κλώνου έως την έναρξη της σύνθεσης του δεύτερου κλώνου. Ωστόσο, η ενεργοποίηση είναι τυχαία και η υδρόλυση της φουρκέτας οδηγεί σε απώλεια πληροφοριών. Η διαδικασία Gubler και Hoffman χρησιμοποιεί ριβονουκλεάση Η της E. Coli για να κόψει mRNA που αντικαθίσταται με DNA πολυμεράση I της E. Coli και σφραγίζεται με DNA λιγάση της E. Coli. Μια βελτιστοποίηση αυτής της διαδικασίας βασίζεται στη χαμηλή δραστικότητα ριβονουκλεάσης H του M-MLV για την κοπή του mRNA με το υπόλοιπο RNA να αφαιρείται αργότερα με την προσθήκη ριβονουκλεάσης Η μετά τη μετάφραση πολυμεράσης DNA της δεύτερης αλυσίδας του cDNA. Αυτό αποτρέπει την απώλεια πληροφοριών αλληλουχίας στο 5' άκρο του mRNA.
Εφαρμογές
Το συμπληρωματικό DNA χρησιμοποιείται συχνά στην κλωνοποίηση γονιδίων ή ως γονιδιακός ανιχνευτής ή στη δημιουργία μιας βιβλιοθήκης cDNA. Όταν οι επιστήμονες μεταφέρουν ένα γονίδιο από ένα κύτταρο σε ένα άλλο κύτταρο για να εκφράσουν το νέο γενετικό υλικό ως πρωτεΐνη στο κύτταρο δέκτη, το cDNA θα προστεθεί στον δέκτη (και όχι σε ολόκληρο το γονίδιο), επειδή το DNA για ένα ολόκληρο γονίδιο μπορεί να περιλαμβάνει DNA που δεν κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ή που διακόπτει την κωδικοποιητική αλληλουχία της πρωτεΐνης (π.χ. εσώνια). Μερικές αλληλουχίες cDNA λαμβάνονται συχνά ως εκφρασμένες ετικέτες αλληλουχίας (expressed sequence tags).
Με την ενίσχυση αλληλουχιών DNA μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) πλέον συνηθισμένης, διεξάγεται τυπικά αντίστροφη μεταγραφή ως αρχικό βήμα, ακολουθούμενη από PCR για να ληφθεί μια ακριβής αλληλουχία cDNA για ενδοκυτταρική έκφραση. Αυτό επιτυγχάνεται με το σχεδιασμό ειδικών για την αλληλουχία εκκινητών DNA που υβριδοποιούνται στα 5' και 3' άκρα μιας περιοχής cDNA που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη. Μόλις ενισχυθεί, η αλληλουχία μπορεί να κοπεί σε κάθε άκρο με νουκλεάσες και να εισαχθεί σε μία από τις πολλές μικρές κυκλικές αλληλουχίες DNA γνωστές ως φορείς έκφρασης (expression vectors). Τέτοιοι φορείς επιτρέπουν την αυτο-αντιγραφή, μέσα στα κύτταρα, και πιθανώς την ενσωμάτωση στο DNA του ξενιστή. Περιέχουν επίσης συνήθως έναν ισχυρό προαγωγέα για να οδηγήσει τη μεταγραφή του cDNA στόχου σε mRNA, το οποίο στη συνέχεια μεταφράζεται σε πρωτεΐνη.
Το cDNA χρησιμοποιείται επίσης για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης μέσω μεθόδων όπως RNA-seq ή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR). Για την αλληλούχιση, το RNA πρέπει να κατακερματίζεται λόγω περιορισμών στο μέγεθος της πλατφόρμας αλληλούχισης. Επιπροσθέτως, ο δεύτερος κλώνος του cDNA που συντίθεται πρέπει να απολινωθεί με προσαρμογείς που επιτρέπουν στα θραύσματα cDNA να ενισχυθούν με PCR και να συνδεθούν με κύτταρα ροής αλληλούχισης. Οι ειδικές για το γονίδιο μέθοδοι ανάλυσης χρησιμοποιούν συνήθως μικροσυστοιχίες και RT-qPCR για να ποσοτικοποιήσουν τα επίπεδα cDNA μέσω φθορισμού και άλλων μεθόδων.
Στις 13 Ιουνίου 2013, το Ανώτατο Δικαστήριο των Ηνωμένων Πολιτειών αποφάσισε στην υπόθεση Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics ότι ενώ τα φυσικά απαντώμενα γονίδια δεν μπορούν να λάβουν ευρεσυτεχνία, το cDNA είναι κατάλληλο για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας επειδή δεν εμφανίζεται φυσικά.

 Ιοί και ρετρομεταθετόνια 
Ορισμένοι ιοί χρησιμοποιούν επίσης cDNA για να μετατρέψουν το ιικό RNA τους σε mRNA (ιικό RNA → cDNA → mRNA). Το mRNA χρησιμοποιείται για την παραγωγή ιικών πρωτεϊνών για να πάρουν τον έλεγχο του κύτταρου του ξενιστή.
Ένα παράδειγμα αυτού του πρώτου βήματος από το ιικό RNA στο cDNA μπορεί να παρατηρηθεί στον κύκλο μόλυνσης από τον HIV. Εδώ, η μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή συνδέεται με το λιπιδικό περίβλημα του ιού, το οποίο επιτρέπει στο ιικό καψίδιο με δύο αντίγραφα του ιικού γονιδιώματος RNA να εισέλθει στον ξενιστή. Το αντίγραφο cDNA στη συνέχεια γίνεται μέσω αντίστροφης μεταγραφής του ιικού RNA, μια διαδικασία που διευκολύνεται από τον συνοδό CypA και μια αντίστροφη μεταγραφάση που σχετίζεται με το καψίδιο του ιού.
Το cDNA παράγεται επίσης από ρετρομεταθετόνια (retrotransposons) σε ευκαρυωτικά γονιδιώματα. Τα ρετρομεταθετόνια είναι κινητά γενετικά στοιχεία που κινούνται μέσα, και μερικές φορές μεταξύ, των γονιδιωμάτων μέσω ενδιάμεσων RNA. Αυτός ο μηχανισμός είναι κοινός με τους ιούς με εξαίρεση τη δημιουργία μολυσματικών σωματιδίων.
Παραπομπές
Mark D. Adams et al. "Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project." Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.
Philip M. Murphy, and H. Lee Tiffany. "Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor." Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283. Web.

 Εξωτερικοί σύνδεσμοι 
 H-Invitational Database
 Functional Annotation of the Mouse database
 Complementary DNA tool
 http://news.icecric.com/today-match-prediction/ 

Κατηγορία:DNA