CRISPR

de|bawd|450x450px|Diagram o fecaniaeth amddiffyn gwrth-firws CRISPR mewn organebau procaryotig.
Teulu o ddilyniannau DNA mewn bacteria yw CRISPR (). Mae'r dilyniannau yn cynnwys darnau DNA o firwsau sydd wedi ymosod ar y bacteria. Mae'r bacteria wedyn yn defnyddio'r darnau DNA yma i ddarganfod a dinistrio DNA mewn ymosodiadau eraill gan firwsau tebyg. Mae dilyniannau CRISPR yn rhan bwysig o system amddiffyn bacteria. Maen nhw hefyd yn cael eu defnyddio fel rhan o dechnoleg o'r enw CRISPR/Cas9 sy'n gallu newid genynnau mewn organebau mewn ffordd effeithiol a manwl.

System imiwnedd mewn organebau procaryotig yw CRISPR/Cas. Mae'n system sy'n rhoi ymwrthedd rhag elfennau genetig dieithr, megis y rheiny sy'n bresennol mewn plasmidau o facteria eraill ac mewn firwsau bacterioffag. (registration required) Maen nhw'n darparu math o imiwnedd caffaeledig i'r bacteria. Mae RNA sy'n dal y dilyniant o'r ymosodwyr blaenorol yn helpu proteinau Cas i ddarganfod a thorri DNA dieithr. Call proteinau Cas eraill, hefyd wedi eu harwain gan RNA, dorri RNA dieithr fel a geir yn lle DNA mewn rhai firwsau.  Fe welir dilyniannau CRISPR mewn tua 40% o'r genomau bacteriaidd sydd wedi eu dilyniannu, ac mewn 90% o archaea sydd wedi eu dilyniannu.

Daw'r talfyriad CRISPR o'r enw Saesneg - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Bathwyd yr enw pan nad oedd gwyddonwyr yn gwybod am darddiad a defnydd is-ddilyniannau ysbeidiol. Ar y pryd, disgrifwyd CRISPR fel darnau o DNA procaryotig yn cynnwys dilyniannau byr, ailadroddol. Mewn dilyniannau ailadroddol palindromig, mae dilyniant y niwcleotidau yr un fath yn y ddau gyfeiriad. Dilynnir pob adran ailadroddol gan ddarnau byr o ddarnau DNA ysbeidiol o ymosodiadau blaenorol i DNA dieithr (ee firws neu blasmid). Ceir clystyrau bychain o enynnau cas (system yn gysylltiedig â CRISPR) o gwmpas dilyniannau CRISPR.

Mae fersiwn syml o system CRISPR/Cas, o'r enw CRISPR/Cas9, wedi ei addasu i olygu genomau. Wrth ddanfon yr ensym niwcleas Cas9 wedi ei gyfuno ag RNA arwain (gRNA) synthetig i mewn i gell, gellir torri genom y gell mewn man dewisiol, gan ganiatau dileu genynnau a/neu ychwaneug genynnau newydd. Mae'r cymhlygyn Cas9-gRNA yn cyfateb â'r cymhlygyn CAS III-crRNA yn y diagram uchod mewn bacteria.

Mae gan dechnegau golygu genom CRISPR/CAS lawer o ddefnyddiau posibl, yn cynnwys mewn meddygaeth ac mewn gwella cnydau. Cyhoeddwyd yn 2015 mai system olygu genom CRISPR/Cas9-gRNA oedd dewis cymdeithas y AAAS fel darganfyddiad gwyddonol y flwyddyn. Mae rhai pryderon ethegol wedi eu crybwyll ynglŷn â defnyddio CRISPR ar gyfer golygu'r llinach genhedlu.

 Hanes 
Dechreuodd daranfyddiad darnau ailadroddol o DNA mewn tri rhan o'r byd.

 Dilyniannau ailadroddol 
Daeth y disgrifiad cyntaf o beth sydd erbyn hyn yn cael ei alw'n CRISPR o ymchwilydd ym Mhrifysgol Osaka, Yoshizumi Ishino, yn 1987. Ar gamgymeriad, fe gloniodd ran o ddilyniant CRISPR ynghyd â genyn iap, y terged oedd Ishino â diddordeb ynddo. Roedd trefniant y dilyniannau ailadroddol yn anarferol - fel arfer, mae dilyniannau ailadroddol wedi eu trefnu yn olynol ar hyd dilyniannau DNA, heb ymyriadau rhyngddynt. Doedd gwyddonwyr ar y pryd ddim yn gwybod beth oedd swyddogaeth dilyniannau ailadroddol ysbeidiol mewn clystyrau.

Yn 1993, cyhoeddodd ymchwilwyr yn yr Iseldiroedd oedd yn gweithio ar Mycobacterium tuberculosis (y bacteria sy'n achosi twbercwlosis neu'r diciâu) ddwy erthygl am glwstwr o ddilyniannau ailadroddol uniongyrchol â darnau eraill o DNA rhyngddynt yn y bacteriwm. Fe welodd yr ymchwilwyr fod y darnau DNA ysbeidiol yma yn amrywio yn arw rhwng straenau gwahanol o M. tuberculosis. Fe ddefnyddion nhw'r nodwedd yma i ddatblygu dull o ddosbarthu'r straenau, ac mae'r dull yma - spoligotyping - yn cael ei ddefnyddio hyd heddiw.

Ar yr un pryd, gwelwyd dilyniannau ailadroddol yn y rhywogaethau archaea Haloferax a Haloarcula. Dechreuodd Francisco Mojica astudio swyddogaeth y dilyniannau ailadroddol yma ym Mhrifysgol Alicante yn Sbaen. Er fod ei ragdybiaeth wreiddiol yn anghywir, dyfalodd Mojica ar y pryd fod y clystyrau yma o ddilyniannau ailadroddol yn bwysig ar gyfer didoli DNA datblygedig i mewn i epigelloedd yn ystod cellraniad oherwydd nad all blasmidau a chromosomau â dilyniannau o'r un fath gydfodoli yn Haloferax volcanii. Gwelodd Mojica hefyd drawsgrifiad y dilyniannau ailadroddol bylchog am y tro cyntaf. Erbyn 2000, roedd grŵp ymchwil Mojica wedi dynodi dilyniannau ailadroddom bylchog mewn 20 rhywogaeth o ficrobau. Yn 2001, cynnigwyd y term CRISPR am y tro cyntaf gan Mojica a Ruud Jansen (roedd Jansen hefyd yn chwilio am ddilyniannau tebyg) er mwyn lleihau'r dryswch ynglŷn â'r talfyriadau gwahanol oedd yn cael eu defnyddio mewn erthyglau gwyddonol.

 Systemau Cas (CRISPR-associated systems) 
Daeth gwelliant mawr yn nealltwriaeth gwyddonwyr o CRISPR pan sylweddolodd Jansen fod genynnau arbenning bob amser i'w gweld ynghyd â'r clystyrau a welodd o ddilyniannau ailadroddol. Rhoddwyd yr enw CRISPR-associated systems, neu cas, ar y genynnau yma. Gwelodd Jansen bedwar genyn cas yn gyntaf (cas 1 i 4. Roedd gan y proteinau Cas fotiffau helicas a niwcleas, gan awgrymu eu bod yn bwysig ar gyfer strwythur dynamig y locws CRISPR. Hwn oedd y cyhoeddiad lle bathwyd yr enw CRISPR fel enw cyffredinol y patrwm. Ond parhaodd swyddogaeth CRISPR i fod yn ddirgelwch.
bawd|Diagram syml o locws CRISPR. Dangosir y tair cydran a geir mewn locws CRISPR: genynnau cas, dilyniant arweiniol (leader), a rheng o ddilyniannau ailadroddol (blychau llwyd) a dilyniannau ysbeidiol (llinellau lliwgar). Dydy trefn y tair cydran ddim bob amser yr un fath. Hefyd, gellir cael nifer o locysau CRISPR tebyg mewn un genom, ond dim ond un all fod yn gysylltiedig â genynnau cas.
Yn 2005, dangosodd tri grwp ymchwil annibynnol fod rhai dilyniannau ysbeidiol CRISPR wedi dod o DNA bacterioffag a DNA o du allan i'r cromosom, megis plasmidau. I bob pwrpas, tameidiau o DNA sydd wedi ceisio ymosod ar y gell yn flaenorol yw'r dilyniannau ysbeidiol yma. Roedd y darganfyddiad hwn yn arwydd y gallai system CRISPR/cas chwarae rhan yn imiwnedd ymaddasol bacteria. Yn gyntaf, fe wrthododd y cylchgronau gwyddonol mwyaf enwog bob un o'r tri gwaith ymchwil, ond fe'u cyhoeddwyd yn ddiweddarach mewn cylchgronau eraill.

Cyhoeddwyd yr erthygl gyntaf i gynnig y gall CRISPR-Cas chwarae rhan mewn imiwnedd mewn microbau gan grŵp Mojica yn 2005. Rhagdybiodd Mojica y gallai trawsgrifiad RNA y dilyniannau ysbeidiol chwarae rhan gan alluogi'r system i adnabod targed y protein Cas. Byddai mecanwaith o'r fath yn cyfateb i system ymyriant RNA mewn celloedd ewcaryotig. Felly, yr un pryd ag y daeth Ian Wilmut yn enwog am glônio Dolly'r ddafad, estynodd Koonin a'i gydweithwyr (2005) y rhagdybiaeth ymyriad RNA gan gynnig dulliau gweithio ar gyfer yr is-fathau gwahanol o CRISPR-Cas yn ôl swyddogaeth rhagweliedig eu proteinau. Cynnigiodd eraill fod y dilyniannau CRISPR yn arwain ensymau Cas i ddiraddio DNA firysau.

Dangosodd gwaith ymchwil o lawer o grwpiau gwahanol y mecanweithiau sylfaenol wrth wraidd imiwnedd CRISPR-Cas. Yn 2007, cyhoeddwyd y dystiolaeth arbrofol gyntaf mai system imiwnedd ymaddasol oedd CRISPR. Caffaelodd locws CRISPR yn Streptococcus thermophilus ddilyniannau ysbeidiol o DNA firws oedd yn ymosod arno. Llwyddodd yr ymchwilwyr i newid ymwrthedd S. thermophilus i firws bacterioffag gan ychwanegu a dileu dilyniannau ysbeidiol wedi eu canfod mewn firysau gwahanol. Yn 2008, dynododd Brouns a chydweithwyr gymhlygyn protein Cas mewn E. coli oedd yn gallu torri'r RNA CRISPR o fewn i'r dilyniannau ailadroddol i mewn i foleciwlau RNA yn cynnwys dilyniannau ysbeidiol; fe welodd yr ymchwilwyr fod o moleciwlau yma yn aros ynghlwm i'r cymhlygyn protein. Yr un flwyddyn, dangosodd Marraffini a Sontheimer ddilyniant CRISPR yn S. epidermidis oedd yn targedu DNA yn hytrach nag RNA er mwyn atal cyfunedd. Doedd y darganfyddiad hwn ddim yn cydfynd â'r syniad fod mecanwaith imiwnedd CRISPR-Cas yn debyg i system ymyriad RNA, er y darganfyddwyd system CRISPR-Cas oedd yn targedu RNA dieithr yn ddiweddarach mewn Pyrococcus furiosus. Dangosodd gwaith yn 2010 fod CRISPR-Cas yn torri'r ddau edafedd o DNA firysau bacterioffag a phlasmidau yn S. thermophilus.

 Cas9 
Dechreuodd ymchwilwyr astudio system CRISPR mwy syml o Streptococcus pyogenes sy'n defnyddio'r protein Cas9. Mae pedwar rhan i system endoniwcleas Cas9, sy'n cynnwys dau foleciwl RNA bychan o'r enw RNA CRISPR (crRNA) ac RNA CRISPR traws-ysgogi (tracrRNA). Llwyddodd Jennifer Doudna ac Emmanuelle Charpentier i ailadeiladu a symleiddio'r endoniwcleas Cas9 gan gyduno'r ddau foleciwl RNA i ffurfio un RNA arwain. Gall Cas9 wedyn, pan wedi ei gyfuno â'r RNA arwain, ddarganfod a thorri targed penodol mewn DNA wedi ei ddynodi gan yr RNA arwain. Gan newid dilyniant niwcleotid yr RNA arwain, gellid rhaglennu'r system Cas9 i dargedu unrhyw ddilyniant DNA er mwyn ei dorri. Dangosodd grŵp arall o gydweithwyr, yn cynnwys Šikšnys, Gasiūnas, Barrangou a Horvath y gallant hefyd ail-ragnlennu'r Cas9 o system CRISPR S. thermophilus er mwyn targedu man o'u dewis gan newid ei ddilyniant crRNA. Rhoddodd y datblygiadau hyn hwb i ymdrechion gwyddonwyr i olygu genomau gen ddefnyddio'r system CRISPR-Cas9.

Dangosodd dau  grŵp ymchwil ar yr un pryd a'i gilydd y gellid defnyddio CRISPR/Cas9 er mwyn golygu'r genom dynol mewn celloedd meithrin. Ers hynny, mae'r system wedi ei defnyddio mewn ystod eang o organebau, gan gynnwys burum pobi (Saccharomyces cerevisiae), pysgod rhesog (D. rerio), pryfed ffrwythau (Drosophila melanogaster), nematodau (C. elegans), planhigion, llygod, mwncïod ac ebryonau dynol.

Mae CRISPR hefyd wedi ei addasu ar gyfer creu ffactorau trawsgrifiad y gellir eu rhaglennu. Gan ddefnyddio'r rhain, gall wyddonwyr dargedu a throi genynnau penodol ymlaen neu i ffwrdd.

 Defnyddiau 
Erbyn diwedd 2014, roedd oddeutu 1000 o erthyglau ymchwil yn crybwyll CRISPR wedi eu cyhoeddi. Mae'r dechnoleg wedi ei defnyddio er mwyn diffodd genynnnau mewn celloedd a llinachau o gelloedd dynol, i astudio Candida albicans, i addasu'r burum sy'n cael ei ddefnyddio i greu biodanwydd, ac ar gyfer addasu genetig mewn cnydau. Gellir defnyddio CRISPR hefyd i newid mosgitos fel nad allant drosglwyddo afiechydon megis malaria.

 Peiriannu'r genom 
Mae systemau golygu genom CRISPR/Cas9 yn defnyddio system CRISPR Math II. Pan gaiff ei defnyddio ar gyfer golygu genom, mae'r system yn cynnwys Cas9, crRNA, tracrRNA ac adran opsiynol o dempled atgyweirio DNA.

bawd|dim|514x514px|Trawsolwg o wneuthuriad plasmid a ddefnyddir ar gyfer golygu'r genom gyda CRISPR/Cas9.

 Prif gydrannau 
 CydranSwyddogaeth crRNA Yn cynnwys yr RNA arwain sy'n lleoli'r adran gywir o DNA y targed, ynghyd â safle sy'n clymu'r moleciwl i'r tracrRNA i ffurfio cymhlygyn gweithredol. tracrRNA Yn clymu i'r crRNA i ffurfio cymhlygyn gweithredol. sgRNA RNA arwain unigol. RNA cyfunedig sy'n cynnwys tracrRNA ac oleiaf un crRNA. Cas9 Yn ei ffurf weithredol, gall y protein hwn addasu DNA. Gall mathau gwahanol o Cas9 weithredu mewn ffyrdd gwahanol (hy rhicio un edafedd, torri'r ddau edafedd neu glymu at DNA).Templed atgyweirio DNA i arwain y broses atgyweirio DNA, gan alluogi ychwanegu dilyniant newydd i'r bwlch ar ôl i Cas9 dorri DNA y targed.

 Cyfeiriadau 

Categori:Nodion
Categori:Biotechnoleg
Categori:Bioleg foleciwlaidd
Categori:Bioleg