HPLC

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je oblik kolonske hromatografije koji se često koristi u analitičkoj hemiji. Nekada se naziva i Tečna hromatografija pod visokim pritiskom. HPLC se koristi za razdvajanje komponenti iz smjese na osnovu hemijskih interakcija između supstance koja se analizira i stacionarne faze u koloni.

 Način rada 
Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smjese) kroz kolonu (cijev punjena materijalom sitnih čestica, a time i velike površine) pumpanjem tečnosti (mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja komponenata smjese. Vrijeme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i sastava mobilne faze. Vrijeme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja kolone) naziva se retenciono vrijeme i karakteristično je za određenu supstancu. Korištenje visokog pritiska povećava linearnu brzinu i daje komponentama manje vremena za zadržavanje, što poboljšava rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni rastavarači čisti ili u bilo kojoj kombinaciji (npr. voda, metanol, organski rastvarači...). Voda može sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumijeva promjenu sastava mobilne faze u toku eluiranja.

 Tipovi HPLC-a 

 Hromatografija na normalnim fazama 

Ova metoda koristi polarnu stacionarnu fazu i nepolarnu mobilnu fazu, a koristi se kada je supstanca koja se analizira polarna. Polarna supstanca se adsorbira i zadržava na česticama stacionarne faze. Jačina adsorpcije je veća što je veća polarnost supstance, a samim time jeće i vrijeme zaržavanja. Korištenje polarnijih rastvarača u mobilnoj fazi smanjuje retenciono vrijeme. Ovaj tip hromatografije je napušten 1970-tih sa razvojem HPLC-a na obrnutim fazama, zbog slabe reproducibilnosti, uslijed promjena na česticama stacionarne faze pod uticajem rastvarača.

 Hromatografija na obrnutim fazama 

HPLC na obrnutim fazama (RP-HPLC) koristi nepolarnu stacionarnu fazu i polarnu mobilnu fazu. Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa RMe2SiCl, gdje je R alkilna grupa ravnog lanca kao C18H37 ili C8H17. Vrijeme zadržavanja je duže za manje polarne supstance. Vrijeme zadržavanja se povećava dodatkom polarnih rastvarača u mobilnu fazu a smanjuje se dodatkom hidrofobnih rastvarača. RP-HPLC funkcioniše na principu hidrofobnih interakcija, koje su rezultat odbijajućih sila između polarnog rastvarača i relativno nepolarne supstance koja se analizira i nepolarne stacionarne faze.

Na brzinu eluiranja utiče pH, zbog mogućnosti promjene polarnosti supstance. Zbog toga se često u mobilnu fazu dodaju puferi. Kolone za RP-HPLC ne bi trebalo koristiti sa jakim bazama, zbog mogućnosti razgradnje silikatnih čestica.

 Komponente uređaja za HPLC 

Uređaj za HPLC se sastoji od sljedećih komponenata:

 Rezervoar mobilne faze
 Pumpa
 Injektor
 Kolona
 Detektor

 Detektori za HPLC 

Detektor ima važnu ulogu da detektuje komponente koje izlaze iz kolone nakon eluiranja. Detektor generiše električni signal koji je proporcionalan intenzitetu neke osobine mobilne faze ili supstance koja se eluira. Tipovi detektora u HPLC-u su:Settle, F.A.: Handbook of instrumental techniques for analytical chemistry, Prentice Hall, 1997, 

 UV-VIS detektor
 Fluorescentni detektor
 Elektrohemijski detektor
 Detektor indeksa loma
 Maseni spektrometar (MS)

 Također pogledajte 

 Hromatografija

 Vanjski linkovi 

 Basic Liquid Chromatography, Textbook on HPLC (full) 
 A guide to HPLC
 LC Equipment

 Reference 

Kategorija:Analitička hemija