Роджэр Цьсен

Роджэр Цьсен (, ; 1 лютага 1952 — 24 жніўня 2016) — амерыканскі хімік кітайскага паходжання, прафесар кафедры хіміі і біяхіміі Каліфарнійскага ўніверсітэта ў Сан-ДыегаRoger Y. Tsien at the University of California, San Diego . У 2008 годзе быў ганараваны Нобелеўскай прэміяй па хіміі «за адкрыццё і распрацоўку зялёнага флуарэсцэнтнага бялку (GFP)» сумесна з двума іншымі хімікаміWebsite of the Nobel Prize committee.

 Біяграфія 

 Раннія гады 
Роджэр Ёнчын Цьсен нарадзіўся ў Нью-Ёрку 1 лютага 1952 года малодшым з трох сыноў у сям’і Сюэчжу Цьсена, інжынера-механіка пры Масачусецкім тэхналагічным інстытуце, і медсястры Іін. Радавод яго сям’і звязаны з лініяй навукоўцаў-дваран з Ханчжоу, які мае даўнія гістарычна дакументаваныя адносіны з дынастыяй Сун. Больш таго, сям’я мела незвычайны лёс, які адлюстроўвае кітайскія гістарычныя падзеі падчас і адразу пасля Другой сусветнай вайны. Яе прадстаўнікі нярэдка рабілі кар’еру на Захадзе, нягледзячы на няўдачы і забабоны. Так, Цянь Сюэсэнь, адзін з заснавальнікаў Лабараторыі рэактыўнага руху пры Каліфарнійскім тэхналагічным інстытуце, прыходзіцца стрыечным братам бацьку Цьсена. Брат Цьсена, Рычард таксама з’яўляецца вядомым навукоўцам у Стэнфардзе. Роджэр аднойчы сказаў: «Я ад нараджэння асуджаны на такую працу».Бацька Роджэра валодаў невялікай гандлёвай кампаніяй у Нью-Ёрку, а таксама займаўся інжынерным кансалтынгам у акрузе Уэстчэстэр. Затым Бацька перавёз сям’ю ў Лівінгстан, штат Нью-Джэрсі, калі Роджэру споўнілася восем гадоў. Там бацька працаваў над вакуумнымі трубкамі і нафтахімікатамі ў Радыёкарпарацыі Амерыкі і Esso Research and Engineering.

У дзяцінстве Цьсен пакутаваў ад астмы і таму шмат часу праводзіў у памяшканнях. Ён праяўляў незвычайна высокія здольнасці да навуковага пазнання, якія затым развіліся ў любоў да тэарэтычнай і практычнай хіміі. Гэта чакана пачалося з цікавасці да абумоўленага лігандамі паводзінам храмафораў — афарбаваным пераходам іёнаў металаў, якія ўдзельнічаюць у шырокім дыяпазоне класічных эксперыментаў неарганічнай хіміі, і найбольш ярка праявіла сябе ў спробах сінтэзаваць ацэтылсаліцылавую кіслату, часта на заднім двары, у хатняй посудзе і з імправізаванымі прыборамі. Першы ўзнагародны значок байскаўт Роджэр атрымаў за заслугі ў галіне хіміі. Яго запісная кніжка, у якую ён, васьмігадовае дзіця, запісваў свае хімічныя вопыты, цяпер захоўваецца ў Музеі Нобеля ў СтакгольмеHuang C. L.-H. Roger Yonchien Tsien. 1 February 1952 — 24 August 2016 // Biogr. Mems Fell. R. Soc., 2018, v. 65, p. 405—428..

 Школьныя гады 
Талент да хіміі і любоў да яе захаваліся ў маладога Роджэра і ў школьныя гады. Ён прайшоў летнюю даследчую праграму ва Універсітэце Агая ў 1967 годзе пры падтрымцы Нацыянальнага навуковага фонду. Даследаванне было прысвечана амбіцыйным уласцівасцям тыацыаната (SCN-), якія ўзнікае з падобнага размеркавання адмоўнага зарада паміж нуклеафільнымі атамамі серы і азоту. Гэта сіметрычнае размеркаванне зарада меркавала магчымасць утварэння сувязі, якая злучае два ці больш іёна металу праз звязванне атама N і S c металамі класа А і В, адпаведна. Нягледзячы на тое, што Роджэру гэтая праца не прынесла задавальнення і нават раздражняла яго, даследаванне, тым не менш, было адзначана вышэйшай узнагародай ў 1968 годзе ў рамках конкурсу «Пошук талентаў у навуцы ад кампаніі Westinghouse», калі яму было 16 гадоўHuang C. L.-H. Roger Yonchien Tsien. 1 February 1952 — 24 August 2016 // Biogr. Mems Fell. R. Soc., 2018, v. 65, p. 405—428..

 Развіццё навуковай кар’еры 
Затым Роджэр паступае ў Гарвард, дзе яго цікавасць да хіміі была перапынена гуманітарным ухілам універсітэта. Ва ўніверсітэце Цьсен сустрэўся з Уолтарам Гілбертам на курсах па малекулярнай біялогіі, з Джэкам Нікалсам, Дэвідам Х’юбелам (замежны член Лонданскага каралеўскага таварыства, 1982) і Торстэнам Візелем (замежны член Лонданскага каралеўскага таварыства, 1982) на курсах па нейрафізіялогіі зрокавых сістэм і з Нэльсанам Кіангам на лекцыях па нейрафізіялогіі слыхавых сістэм. Роджэр уступіў у таварыства Phi Beta Kappa па кірунку хімія і фізіка ў 1972 годзе, скончыўшы Гарвард summa cum laude (з адзнакай) з прысуджэннем прэміі Дэтур (Detur Prize). Парады згаданых вышэй выкладчыкаў прывялі да таго, што Роджэр паспяхова прайшоў конкурсны адбор на стыпендыю імя Маршала, якая пакрывае PhD-праграму ў Каледжы Чэрчыля пры Кембрыджскім універсітэце, у фізіялагічнай лабараторыі.

Кіраўнік яго Кембрыджскага PhD-праекта, прафесар Рычард Эдрыян цікавіўся клеткавай фізіялогіяй актывацыі шкілетных цягліц; яны з Цьсенам сталі сябрамі. Эдрыян быў больш зацікаўлены ў тым, каб даць студэнтам высокага інтэлектуальнага і навуковага калібра шанец развіць свае арыгінальныя імкненні і незалежнасць, чым у наборы падначаленых, старанна і беспярэчна якія працуюць пад кіраўніцтвам галоўнага даследчыка. Так было ў цэлым заведзеная у фізіялагічнай лабараторыі, заснаванай Хілам у 1965 годзе.

У навуковым падыходзе Цьсен атрымаў у спадчыну ад Эдрыяна прыхільнасць да лабараторнай працы і блізкія ўзаемаадносіны з невялікім лікам калегаў, якія валодалі выключнымі якасцямі, у невялікай даследчай групе. Кіраўнік і студэнт падтрымлівалі адзін аднаго: праз гады пасля заканчэння навучання, Роджэр падтрымліваў кантакт са сваім настаўнікам да канца жыцця апошняга.

Студэнта не прыцягвалі наяўныя электрафізіялагічныя метады (метады рэгістрацыі асаблівасцяў пазаклеткавага адказу ў асобных нейронах ўнутры велізарнай папуляцыі цэнтральнай нервовай сістэмы), якія ўжываюцца ў працы, хоць бы з-за іх водгукаў на простыя сэнсарныя стымулы. Ён вёў доўгія гутаркі з Рычардам Эдрыянам з нагоды прымянення пераўтварэнняў Лапласа і кабельнай тэорыі дендрытаў у аналізе электрычнага току ў клетках, здольных да ўзрушанасці; першае пасля легла ў аснову вызначэння эфектыўнай ёмістасці ў размеркаванай сеткі мембранAdrian R. H., Almers W. Measurement of membrane capacity in skeletal muscle.// Nat. New Biol., 1973, v. 242, p. 62-64., а абмеркаванні кабельнай тэорыі далі нараджэнне новым метадам «voltage clamp» у прымяненні да бясконцых кабелямAdrian, R. H., Marshall, M. W. Sodium currents in mammalian muscle // J. Physiol.,1977, v. 268, p. 223—250..

Роджэр Цьсен блізка меў зносіны з такімі хімікамі, як Геры Сміт, ен Бэкстер і Джэрэмі Сэндэрс пры ўніверсітэцкіх хімічных лабараторыях, а таксама з Ар’е Лью і Джонам Кімурай з калегамі з групы Дзяніса Хайдана пры фізіялагічнай лабараторыі. Такім чынам, хоць Цьсен і не быў экстравертам ад прыроды, ва ўніверсітэце ён завёў шмат сяброўскіх і прафесійных знаёмстваўHuang C. L.-H. Roger Yonchien Tsien. 1 February 1952 — 24 August 2016 // Biogr. Mems Fell. R. Soc., 2018, v. 65, p. 405—428..

 Апошнія гады і смерць 
У 2014 годзе ў Цьсена здарыўся інсульт. Ён пераехаў разам са сваёй жонкай, Вэндзі Глоўб, з Сан-Дыега ў Юджын, штат Арэгон. Праз два гады, у 2016 годзе, ва ўзросце 64 гадоў Цьсен памёр падчас язды на ровары.

 Навуковая спадчына Роджэра Цьсена 
Працы Цьсена былі прысвечаны распрацоўцы розных метадаў вымярэння ключавых іёнаў і малекул у клеткавай фізіялогіі. Гэтыя метады, у сваю чаргу, прывялі да стварэння інструментаў, якія дазволілі здзейсніць важныя з’явы ў фізіялогіі і расшыфраваць іх механізмы ўжо пры жыцці навукоўца. Ён таксама пакінуў пасля сябе кагорту выпускнікоў і навуковых супрацоўнікаўHuang C. L.-H. Roger Yonchien Tsien. 1 February 1952 — 24 August 2016 // Biogr. Mems Fell. R. Soc., 2018, v. 65, p. 405—428..

Цьсен вывучаў шырокі дыяпазон малых флуарэсцэнтных малекул і флуарэсцэнтных бялкоў, якія прывялі да распрацоўкі важных метадаў прамой візуалізацыі розных ключавых біяхімічных працэсаў ўнутры жывой клеткі і нават жывых арганізмаў. Гэтыя рэчывы могуць быць уведзеныя ў клетку альбо з дапамогай іх здольных да пранікнення аналагаў, альбо шляхам іх экспрэсіі наўпрост у клеткі з выкарыстаннем малекулярна-біялагічных тэхнік. Некаторыя з іх могуць выкарыстоўвацца як індывідуальныя флуарэсцэнтныя кампаненты, некаторыя — як ўзаемадзейнічаюць у пары (FRET). Гэта дазволіла ўжываць іх для вывучэння цэлага класа клеткавых фізіялагічных працэсаў, пачынаючы ад пытання, ці ўключаны гены, якія ўдзельнічаюць у гэтым працэсе, пераходзячы да вывучэння экспрэсіі, транслакацыі і ўзаемадзеяння бялкоў-удзельнікаў, і заканчваючы даследаваннем саміх фізіялагічных працэсаў, якія ўзнікаюць пры ўзаемадзеянні бялкоўHuang C. L.-H. Roger Yonchien Tsien. 1 February 1952 — 24 August 2016 // Biogr. Mems Fell. R. Soc., 2018, v. 65, p. 405—428..

 Навуковыя даследаванні 

 Аспірантура і далейшыя даследаванні ў Кембрыджы: біяфізічныя метады сачэння за фізіялагічнай актыўнасцю клеткі 
Дысертацыя Цьсена, завершаная ў 1977 годзе, «дызайн і выкарыстанне хімічных інструментаў у клетачнай фізіялогіі», была адзначана прэстыжнай прэміяй Геджа ў галіне біялогіі ў Кембрыджы, а таксама прапановай ўступлення ў праграму Comyns Berkeley Research Fellowship пры каледжы Gonville and Caius. У гэты перыяд Цьсен пачаў распрацоўкі хімічных, а затым і малекулярна-біялагічных індыкатараў, якія можна ўвесці ў клетку або экспрэсаваць ў ёй для вывучэння яе фізіялагічных працэсаў. Дадзеная задача спачатку зводзілася да вымярэння канцэнтрацыі ўнутрыклеткавага кальцыя, хоць наступныя працы ўключалі ўжо значна больш шырокі дыяпазон іёнаў і малекул. Гэтая цікавасць Цьсена да вымярэння кальцыя выявілася ў найбольш прыдатны момант часу: да канца 1970-х вучонае супольнасць паступова прызнавала ролю кальцыя ў цытазолі як ключавога другаснага пасярэдніка. Высвятленне яго мадыфікацыі, папярэдняй трыгернай актывацыі або рэгулятарнай стадыі, і кантроль гэтага працэсу за кошт абмену паміж свабоднымі і звязанымі цытазольнымі кампартментамі, ўнутрыклеткавых кальцыевымі дэпо і пазаклеткавай прасторай, займалі цэнтральнае месца ў разуменні механізму рэгуляцыі клеткавай актыўнасці.

 Распрацоўка электрахімічнага метаду выяўлення і колькаснага вызначэння іёнаў кальцыя 
Гэтая навуковая праблема ўзнікла ў працэсе прамых вымярэнняў, праведзеных з дапамогай электродаў, здольных пранікаць унутр клеткі, здольнай да ўзбуджэння; такія вымярэнні першапачаткова ўжываліся для вызначэння мембранных патэнцыялаўAdrian R. H. The effect of internal and external potassium concentration on the membrane potential of frog muscle. // J. Physiol., 1956, v. 133, p. 631—658.. Электроды, селектыўныя да іёнаў натрыю, калія, вадароду і хларыд-іёну, да таго часу былі ўжо даступныя і знайшлі шырокае прымяненнеThomas R. Ion-sensitive intracellular microelectrodes. New York, NY: Academic Press, 1978., аднак выкарыстанне кальцый-селектыўных электродаў было абмежавана шэрагам цяжкасцяў. Да электродаў выстаўлялася патрабаванне высокай селектыўнасці ў адносінах да іёнаў кальцыя на фоне іншых катыёнаў, патэнцыйна якія знаходзяцца ў сістэме, у тым ліку катыёнаў магнію, натрыю і вадароду, а таксама патрабаванне высокай стабільнасці сістэмы з мінімальным гістэрэзісам пры змене канцэнтрацыі кальцыя. Цьсен распрацаваў больш Ca2+- селектыўныя, нейтральныя (у супрацьлегласць да аніёнаў — арганічным фасфатам) ліганды ў якасці сэнсараўTsien R.Y., Rink T.J. Neutral carrier ion-selective microelectrodes for measurement of intracellular free calcium. // Biochim. Biophys. Acta Biomembr., 1980, v. 599, p. 623—638.. Больш за тое, патрабаваліся электроды з досыць малым дыяметрам кончыка (каля 0,4 мікрон)Tsien R.Y. Liquid sensors for ion-selective microelectrodes. // Trends Neurosci., 1980, v. 3, p. 219—221. з тым, каб пазбегнуць пашкоджання клетак, што магло прывесці да артэфакту — павышэнню лакальнай канцэнтрацыі кальцыя. Аднак неабходныя для гэтага высокія супраціўленні, звязаныя з электродам, каля 20-30 і 60-120 ГОм у растворы з р(Ca2+) = 3 і якія патрабуюцца для выкарыстання кончыка з дыяметрамі 1,5 або 0,5 мкм, у сваю чаргу, пацягнулі за сабой стварэнне адаптаваных, зробленых на заказ электрометраў з вельмі высокім уваходным імпедансам і малымі стабільнымі токамі зрушэння (менш 10 фА) каб пазбегнуць ілжывых сігналаў.
міні|540x540пкс|Распрацоўка і выкарыстанне кальцый-адчувальных электродаў. (а) Рознасць патэнцыялаў ECa2+, наяўная на мяжы кальцый-селектыўнай мембраны, у адносінах да патэнцыялу параўнання E0 як вынік рознай актыўнасці кальцыя ў вывучаемай вадкасці, as, і ў прасторы электрода, af. (б) Схема мікраэлектроднага аналізу для вымярэння актыўнасці кальцыя ў здольнай да ўзбуджэння клеткі з мембранных патэнцыялам Em. Актыўнасць вымяраецца шляхам параўнання патэнцыялаў, якія знаходзяцца на двух электродах: тэтрафенілфасфоній-оксанальнам кальцыевым сэнсары (E1) і вымяральным звычайнае напружанне (E2). (в) Тэарэтычна чаканая калібровачная залежнасць па раўнанні Нернста, у якой пры pCa = 3 назіраецца адсутнасць патэнцыялу
Эксперыментальныя дадзеныя, атрыманыя з дапамогай аптымізаваных электродаў, задавальнялі тэарэтычна чаканым суадносінам Нернста паміж выхадной напругай за вылікам адначасова запісаных мембранных патэнцыялаў і канцэнтрацыяй вольнага кальцыя аж да 1 мкМ у 0,1 М хларыдзе калія, з водгукам, які працягваецца да 100 нМ [Ca2+]. Гэтыя вымярэння ўзгадняліся з дадзенымі, атрыманымі шляхам ўжо ўстоянай люмінесцэнтнай спектраскапіі ў гіганцкіх цягліцавых валокнах вусаногіхTsien R.Y., Ashley C., Rink T. J. Changes in free Ca during muscle contraction, measured with an intracellular Ca-selective electrode // J. Physiol., 1978, v. 280, p. 27. і шкілетных цягліцах жабыBlinks J. R., Rüdel R., Taylor S. R. Calcium transients in isolated amphibian skeletal muscle fibres: detection with aequorin // J. Physiol., 1978, v. 277, p. 291—323.. Вымярэнні ў апошніх былі праведзены з дапамогай флуарафора экварына, які змяшчае тры Ca2+- злучаных EF-hand матыву. Экварын быў атрыманы з медузы Aequorea victoria, знойдзенай у размешчанай ля заходняга ўзбярэжжа Паўночнай Амерыкі зоне Ціхага акіяна; рэчыва выпускае флуарэсцэнтны выбліск пры ўзбуджэнніShimomura O., Johnson F., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell Comp. Physiol., 1962 v. 59, p. 223—239.Shimomura O. Luminescence of aequorin is triggered by the binding of two calcium ions // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, v. 211, p. 359—363..

 Аптычныя метады вымярэння Ca2+ з дапамогай распрацаваных арганічных малекул 
Такім чынам, электродные метады адкрылі дарогу колькаснаму вызначэнню кальцыя ў шырокіх інтэрвалах канцэнтрацый, валодалі селектыўнасцю ў адносінах да кальцыю на фоне іёнаў магнію і вадароду і з’яўляліся прыдатнымі ў электрафізіялагічных пошуках. Аднак для ўстанаўлення фізіялагічнай ролі іёнаў кальцыя ў клетцы патрабаваўся метад, здольны таксама да ўжывання ў шырокіх дыяпазонах эксперыментальных умоў і тыпах клетак. У сувязі з гэтым было прапанавана некалькі аптычных падыходаў сярод даступных флуарэсцэнтных тэхнік. Аптычныя метады паказваюць лепшую ўстойлівасць сігналу да іёнаў натрыю і больш хуткі водгук у параўнанні з электроднымі метадамі, што рабіла іх прыдатнымі для маніторынгу клеткавых падзей. У адрозненне ад вымярэнняў ў канкрэтнай кропцы, аптычныя метады таксама дазвалялі ацаніць канцэнтрацыю кальцыя, асераднёную па якой-небудзь цікавіць вобласці, і ахарактарызаваць прасторавае размеркаванне іёнаў кальцыя пры выкарыстанні даступнай канфакальнай мікраскапіі.

Даследаванні Цьсена пры супрацоўніцтве з Цімаці Рынкам і Туліа Пазанам унеслі вялікі ўнесак у развіццё аптычных метадаў вымярэння і зрабілі іх асноўным падыходам, які ўжываецца сёння пры вывучэнні клеткавай фізіялогіі кальцыя. Было неабходна, каб распрацаваныя для гэтай мэты ліганды паказалі здольныя да выяўлення змены ў эмісійных і абсарбцыйных уласцівасцях ва ўмовах ўзбуджэння, сумяшчальных з умовамі запісу сігналу і ўмовамі жыццядзейнасці клеткі. Больш за тое, малекулы павінны валодаць спецыфічнасцю да кальцыю і даваць магчымасць для вымярэння як стацыянарных, так і прамежкавых канцэнтрацый іёна. Люмінесцэнтны сігнал экварына забяспечваў узнаўляльныя водгукі на нераўнаважныя канцэнтрацыі, аднак ліганд меў нізкую афіннасць да іёну, а суадносіны паміж канцэнтрацыяй і сігналам выяўлялася раўнаннем са ступенню 2,5, што моцна ўскладняла колькасную інтэрпрэтацыю эксперыменту, асабліва пры вывучэнні гетэрагенных размеркаванняў іёна ў міяплазмеBlinks J. R., Rüdel R., Taylor S. R. Calcium transients in isolated amphibian skeletal muscle fibres: detection with aequorin // J. Physiol., 1978, v. 277, p. 291—323.. Якія сталі даступнымі пазней флуарафоры забяспечвалі больш высокую афіннасць, больш шырокі дыяпазон лінейнасці і больш хуткую асацыяцыю з іёнамі (антыпірылаза-III, << 1 мс; дзіхлорафосфаназа-III, <2 мс; арсеназа-III, 2-3 мс) — гэта дазволіла адсочваць хуткія скокі кальцыя ў шкілетных цягліцахCsernoch L., Huang C. L.-H., Szucs G., Kovacs L. Differential effects of tetracaine on charge movements and Ca2+ signals in frog skeletal muscle // J. Gen. Physiol., 1988, v. 92, p. 601—612.. Аднак такія рэчывы, як арсеназа-III і антыпірылаза-III паказвалі зменную стэхіяметрыю звязвання кальцыя, утвараючы комплексы 1:2 і 2:1 у залежнасці ад канцэнтрацыі фарбавальніка; яны таксама перажывалі вялікія змены ў сваіх адсарбцыйных уласцівасцях ў адказ на іёны магнію і вадароду ў прысутнасці кальцыяBaylor S. M. Optical studies of excitation-contraction coupling using voltage-sensitive and calcium-sensitive probes // Comp. Physiol., 2011 (оригинальная публикация: Handb. Physiol., Skelet. Muscle Suppl., 1983, v. 27, p. 355—379).. Больш за тое, наяўнасць значных канцэнтрацый індыкатара магло само па сабе паўплываць на вывучаемую сістэму: так, антыпірылаза-III і арсеназа-III паказалі адрозныя часовыя залежнасці паглынання пасля вялікіх працяглых імпульсаў напружання каля −20 мВ. Гэта дае падставу меркаваць, што адзін або абодва індыкатара ўплывалі на пераходы кальцыяPalade P., Vergara J. Arsenazo-III and antipyrylazo-III calcium transients in single skeletal muscle fibers // J. Gen. Physiol., 1982, v. 79, p. 679—707.. Рэчыва таксама патэнцыйна магло звязвацца з цытаплазматычнай кампанентамі або падзяляць іх на нецытазольныя кампартменты — такія магчымыя інтэрпрэтацыі, заснаваныя на in vitro каліброўкі кюветы. Нарэшце, усе гэтыя індыкатары патрабавалі ўвядзення ў клетку, што нагадвала мікраэлектродныя вымярэнні. Гэта магло б абмежаваць прымяненне метаду даследаваннем толькі дастаткова моцных, добра замацаваных асобных вялікіх клетках, такіх як цягліцавыя валокны, гіганцкія аксоны кальмара і рэтынальныя клеткі Limulus.

Магчымасць забяспечыць спецыфічнае звязванне з кальцыем ў фізіялагічным дыяпазоне канцэнтрацый апошняга паўстала ад ідэі утварэння хелатнага комплексу з чатырма карбаксільнымі групамі ў добра вядомым лігандзе этыленгліколю-біс (бэта-амінаэтылэфір)-N,N,N`,N`-тэтраўксуснай кіслаце (ЭГТА), якая ўтварае стэхіяметрычны комплекс з іёнам складу 1:1Tsien R.Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures // Biochemistry, 1980, v. 19, p. 2396—2404.. Гэта дало пачатак рацыянальнаму дызайну высокаафінных буфераў і аптычных індыкатараў кальцыя; першай прыступкай у распрацоўцы стала замена метыленавых груп, якія злучаюць кісларод і азот, на фенільные рэшткі. У адным з такіх аналагаў, 1,2-біс (2-амінафеноксі) этан-N,N,N`,N’- тэтраўксуснай кіслаце (BAPTA), два бензольных кольцы замяшчаюць метыленавыя групы, якія злучаюць атамы N і O з захаваннем сумарнай геаметрыі, спецыфічнасці і афіннасці малекулы да кальцыю. BAPTA — шырока выкарыстоўваецца і эфектыўны ўнутрыклетачны кальцыевы буфер, чыё звязванне у параўнанні з ЭГТА менш схільна ўплыву кіслотнасці асяроддзя, больш селектыўны ў адносінах да кальцыю ў асяроддзі магнію і мае большыя хуткасці ўтварэння і разбурэння комплексу.

Аднак ЭГТА паглынае святло ў далёкай УФ-вобласці і не флуарэсцыруе. BAPTA характарызуецца УФ-спектрам флуарэсцэнцыі, які змяняецца пры злучэнні кальцыя, з максімумам каля 250 нм, што не вельмі добра для флуарэсцэнтнага аналізу. Было высветлена, што замена аднаго оксабензола на метаксіхіналінавае кальцо прывяло ў новым злучэнні хін-2 да з’яўлення максімумаў паглынання і выпускання пры 340 і 492 нм, адпаведна. Гэтыя даўжыні хваль ўжо не мяняліся, аднак інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі ўзрастала ў шэсць разоў пры злучэнні кальцыя. Вымярэнні былі адкалібраваны пры тыповых канцэнтрацыях кальцыя ў цытазоле ў стане спакою (10−7 М) і ніжэй, аж да 10−8 М. Іншыя даступныя метады таго часу мелі оптымум выяўлення толькі пры канцэнтрацыях у актываваным стане (10−6 М), тады як сігналы ў стане спакою былі ўжо ніжэй мяжы выяўлення.
міні|382x382пкс|Хелатные комплексы з кальцыем рэчыва, якія пасля прывялі да распрацоўкі хін-2. (а) ЭГТА. Чырвоным выдзелена «клетка», утвораная чатырма карбаксільныя групамі. Нягледзячы на замену метыленавых груп (б) у BAPTA, аналагу ЭГТА, геаметрыя комплексу захоўваецца. (в) Ацетаметоксі (АМ)-вытворнае хін-2 падобным чынам звязваецца з кальцыем і лёгка пранікае ў клеткі, пасля чаго эндагенныя эстеразы разразаюць эфірную групу і вызваляюць хін-2 ,(г) чыя флуарэсцэнцыя павялічваецца ў 6 разоў пры павышэнні канцэнтрацыі кальцыя
Нарэшце, інкубацыя клетак у растворах, якія змяшчаюць ацэтаметаксіэфірны фрагмент (АМ), які праходзіць праз мембраны, звязаны з хін-2 (хін-2-АМ), прывяла да атраўматычнаму, пастаяннаму доступу рэчывы ўнутр клеткі без мікраманіпуляцый або парушэнняў мембраны. Пасля траплення малекулы ў клетку эндагеннай эстэразы выразалі эфірны кампанент і вызвалялі актыўны, непраходзячы праз мембрану тэтрааніён (7). Павелічэнне інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі з павышэннем канцэнтрацыі кальцыя магло адсочвацца з ужываннем звычайнага кюветнага спектрафатометра. Такім чынам, хін-2 набыў ключавую ролю ў вымярэннях цытазольнага кальцыя ў шырокім дыяпазоне клетак млекакормячых і іх суспензій, у тым ліку лімфацытаў, трамбацытаў, народкаў, нейтрафілаў і макрафагаў, асабліва пры вывучэнні ролі кальцыя ў працэсе сігнал-адказTsien R.Y., Pozzan T., Rink T. J. T-cell mitogens cause early changes in cytoplasmic free Ca2+ and membrane potential in lymphocytes. Nature, 1982, v. 295, p. 68-71.Tsien R.Y., Pozzan T., Rink T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a intracellularly trapped fluorescent indicator // J. Cell Biol., 1982, v. 94, p. 325—334.. У будучыні гэты метад ўвядзення ў клетку этэрыфікаваных вытворных, якія праходзяць праз мембрану быў пашыраны да вывучэння функцый малекул — кандыдатаў на ролю клеткавых месэнджараў, такіх як фасфатыдыліназітол-3,4,5-трыфасфат, у клеткавай фізіялогііTsien R.Y., Jiang T., Sweeney G., Rudolf M. T., Klip A., Traynor-Kaplan A. Membranepermeant esters of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate // J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 11 017-11 024..

 Каліфарнійскі універсітэт у Берклі: новыя ліганды, якія дазваляюць вымяраць канцэнтрацыю ўнутрыклеткавага кальцыя і маніпуляваць ім і іншымі іёнамі 
Верагодна, у сувязі са складанасцямі ў працаўладкаванні і няяснымі перспектывамі працы, якія ўзнікалі ў навукоўцаў, якія займаліся міждысцыплінарнымі пошукамі ў Вялікабрытаніі, у 1981 годзе Цьсен пасля гэтак значных даследаванняў прыняў запрашэнне ўладкавацца на працу ў аддзяленне фізіялогіі і анатоміі ў Каліфарнійскім універсітэце ў Берклі (у той час аддзяленне узначальваў Тэры Манч) на стаўку дацэнта. Там Цьсен прапрацаваў восем гадоў, адным з кірункаў працы была далейшая распрацоўка і аптымізацыя кальцый-адчувальных лігандаў у супрацоўніцтве са Стывенам Адамам і Робертам Зукерам. Дзякуючы гэтаму праекту ў камерцыйную вытворчасць былі ўведзеныя многія рэагенты, якія сёння вельмі шырока распаўсюджаныя ў клеткавай фізіялогіі. Усе яны траплялі ў клеткі пасля інкубацыі вывучаемай сістэмы з адпаведнымі АМ-вытворнымі. Рэчывы, якія злучалі ў сабе 8-каардынацыйны тэтракарбаксілат-хелатыруючы фрагмент са стыльбенавым храмафорам, давалі палепшаную селектыўнасць ў адносінах да кальцыю на фоне іншых двухзарядных катыёнаў і толькі трохі меншую афіннасць, чым хін-2Tsien R.Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures // Biochemistry, 1980, v. 19, p. 2396—2404.. Афіннасці гэтых рэчываў знаходзіліся ў дыяпазоне ад Kd = 100 нМ (Хін-2) да Kd = 90 мкМ (флуоро-5N), што покрывала тыповыя фізіялагічныя канцэнтрацыі кальцыя ў вялікім дыяпазоне тыпаў узбуджаных і клетак, якія знаходзяцца у спакоі. Больш высокія значэнні даўжынь хваляў ўзбуджэння ў параўнанні з хін-2 (339 нм) дазвалялі пазбягаць апраменьвання клетак ультрафіялетам, які мог прывесці да аўтафлуарэсцэнцыі узбуджанай клеткі і выклікаць яе пашкоджанні. Увядзенне этыленавай групоўкі стыльбена ў гетэрацыклічныя кольцы палепшыла квантавы выхад і фотахімічную стабільнасць — інтэнсіўнасць флуарэсцэнцыі магла павялічыцца да 30 разоў. Гэта паляпшэнне ў каэфіцыенце экстынкцыі і квантавым выхадзе ў параўнанні са значэннем у хін-2 (<5000 і 0,03 у параўнанні з 0,14, адпаведна) таксама паменшыла патрабаваную колькасць дабаўленай пазнакі ў сістэму (так, у выпадку хін-2 гаворка ідзе пра мілімалярныя канцэнтрацыі). Справа ў тым, што вялікія колькасці патэнцыйна маглі ўтварыць буферную сістэму з ўнутрыклеткавым кальцыем і парушыць вывучаецца працэс.

Нарэшце, у дадатак да змены інтэнсіўнасці флуарэсцэнцыі ў рэчываў змяняліся таксама і даўжыні хваль пры злучэнні кальцыя, тады як хін-2 даваў змены толькі ў сіле сігналу (гэта рабіла вымярэнне адчувальным да варыяцый ў інтэнсіўнасці апраменьвання, дэтэктаванні сігналу, канцэнтрацыі ліганда і эфектыўнай таўшчыні клеткі ў аптычным промні). Вымярэнні з выкарыстаннем спектральных зрухаў у галіне паглынання і выпускання дазвалялі абыходзіць гэтыя крыніцы артэфактаўTsien R.Y., Grynkiewicz G., Poenie M. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem., 1985, v. 260, p. 3440-3450.. Так, інда-1 меў двайны пік эмісіі з асноўным зрухам ад 475 да 400 нм пры злучэнні кальцыя. Інда-1 знайшоў шырокае прымяненне ў праточнай цытаметрыі. Фура-2 выпускае толькі пры адной даўжыні хвалі 510 нм, але пік ўзбуджэння зрушваецца ад прыблізна 380 да 350 нм пры злучэнні, а стаўленне інтэнсіўнасцяў напрамую звязана з канцэнтрацыяй іёнаў. Высокі выхад фатонаў у гэтага злучэння зрабіў яго выкарыстанне зручным нават пры відэарэгістрацыі лакальнай канцэнтрацыі ўнутрыклеткавага кальцыя ў рэжыме рэальнага часуCannell M. B., Berlin J. R., Lederer W. J. Intracellular calcium in cardiac myocytes: calcium transients measured using fluorescence imaging // Soc. Gen. Physiol. Ser., 1987, v. 42, p. 201—214..

Гэтыя дасягненні далі пачатак стварэнню шырокага класа новых малекул-дэтэктараў разнастайных іёнаў і малекул, якія ўдзельнічаюць у фізіялагічных працэсахHaugland R. The molecular probes handbook: a guide to fluorescent probes and labeling technologies // . ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA, 2010 pp. 99-121. Режим доступа: https://www. thermofisher.com/uk/en/home/references/molecular-probes-the-handbook.html. Проверено 6 июня 2018.. Па-першае, гэтыя новыя варыянты дазволілі вымяраць канцэнтрацыю кальцыя ў розных умовах і тыпах клетак. Сігнал флуа-3 рэгіструецца ў бачнай вобласці пры ўзбуджэнні аргоновым лазерам пры 488 нм, павялічваючыся пры злучэнні пры максімуме выпускання на 525 нм, што блізка да значэнняў, дэтэктаваным ў вымярэннях з флюарэсцэін ізацыяцыянатам (FITC). Яго больш хуткая дысацыяцыя у параўнанні з фура-2 дазваляе адсочваць хуткую кінэтыку кальцыя ў шкілетных і сардэчных цягліцах. Гэта было асабліва карысна ў рэгістрацыі мікраскапічных падзей вызвалення кальцыя (кальцыевыя ўспышкі) пры дапамозе канфакальнай мікраскапііCheng H., Lederer M. R., Xiao R. P., Gómez A. M., Zhou Y. Y., Ziman B., Spurgeon H., Lakatta E. G., Lederer W. J. Excitation-contraction coupling in heart: new insights from Ca2+ sparks // Cell Calcium, 1996, v. 20, p. 129—140.. Асаблівасць таксама выкарыстоўвалася ў рэгістрацыі выніковых схаваных Ca2+ хваляў, якія адлюстроўваюць павялічаны выкід кальцыя рыанадзінавымі рэцэптарамі ў саркаплазматычным рэтыкулуме, які ўзнікаў з-за адсутнасці спалучэння каналаў з трансмембранным дзігідрапірыдынавым рэцэптарам у шкілетныхChawla S., Skepper J. N., Hockaday A. R., Huang, C. L.-H. Calcium waves induced by hypertonic solutions in intact frog skeletal muscle fibres // J. Physiol., 2001, v. 536, p. 351—359. або праарытмічных абставінаў у сардэчных цягліцахGoddard C. A., Ghais N. S., Zhang Y., Williams A. J., Colledge W. H., Grace A. A., Huang C. L.-H. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts // Acta Physiol., 2008, v. 194, p. 123—140.Cody C. W., Prasher D. C., Westler W. M., Prendergast F. G., Ward W. W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein // Biochemistry, 1993, v. 32, p. 1212—1218..

Па-другое, стала магчыма выяўленне і вымярэнне канцэнтрацыі не толькі для ўнутрыклеткавага кальцыя, але і для іншых удзельнікаў працэсаў. Напрыклад, карбаксільныя групы карбоксіфлуарэсцэінавага вытворнага 2`,7`-біс-(2-карбоксіэтыл)-5-(і-6)-карбоксіфлуарэсцэін (BCECF) падыходзілі хутчэй для вызначэння іёнаў вадароду, чым кальцыя. Даступнасць BCECF была дасягнута за кошт пранікальнага праз клеткі АМ-аналага, а само рэчыва мела адзін пік выпускання (535 нм) і двайны пік ўзбуджэння (каля 490 і 440 нм). Яго pKa (парадку 6.98) і лінейны водгук паміж рН 6.4 і 7.4 забяспечылі яго дастасавальнасць ў клеткавай фізіялогіі ў парыетальных клетках страўнікаTsien R.Y., Paradiso A. M., Machen T. E. Na±H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, p. 7436-7440..
міні|439x439пкс|Рэчывы, распрацаваныя для вымярэння канцэнтрацыі ўнутрыклеткавага кальцыя (а-в). Флуарэсцэнтныя фрагменты, заснаваныя на 8-каардынацыйным тэтракарбаксілатнам хелатыруючым участку, аддзеленыя пункцірнымі лініямі. (а) Інда-1; (б) Фура-2 з падвойным пікам ўзбуджэння; (в) Флуора-3 з адным пікам ўзбуджэння. Дадзеныя заснаваныя на аглядзе Хаугланда, 2010.
міні|432x432пкс|Кальцый-вызваляльныя ўласцівасці на прыкладзе нітр-2. УФ-святло ператварае «клетку» (а) у паўкетальную форму, (б) чый пераход у нітрозабензафенон (в) істотна павялічвае канстанту дысацыяцыі комплексу ў метадзе BAPTA
Па-трэцяе, святло могло зварачальна вызваляць кальцый з Нітр-2 і пазней распрацаваных нітр-5 і DM-нітрафенаZucker R. S. Effects of photolabile calcium chelators on fluorescent calcium indicators // Cell Calcium, 1992, v. 13, p. 29-40.. Нітр-2 складаецца з Кальцый-хелатыруючага BAPTA, злучанага з нітрапіперанільнай групай, якая здольная перажываць фатоліз святлом з блізкага ультрафіялету (300—400 нм). Гэта падзея значна змяняе канстанту дысацыяцыі кальцыя са 160 і 630 нМ да 7 і 18 мкМ пры іённай сіле ў 0,1 і 0,3 М, адпаведна, выпускаючы звязаны кальцый і змяняючы, такім чынам, канцэнтрацыю ўнутрыклеткавага кальцыяTsien R.Y., Zucker R. S. Control of cytoplasmic calcium with photolabile tetracarboxylate 2-nitrobenzhydrol chelators // Biophys. J., 1986, v 50, p. 843—853.. Уласцівасць знайшла скарыстанне ў фотахімічным кіраванні іённымі токамі ў нейронахGurney A. M.,Tsien R.Y., Lester H. A. Activation of a potassium current by rapid photochemically generated step increases of intracellular calcium in rat sympathetic neurons // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1987, v. 84, p. 3496-3500.. Затым Цьсен развіў гэты падыход на іншыя біяактыўныя рэгулятары, а прасторавы дазвол быў дасягнуты факусоўкай лазернай крыніцы ўзбуджэння ў трох каардынатах. Як вынік, злучэнне брамаваных 7-гідраксікумарын-4-ілметылаў з пасярэднікамі-кандыдатамі палепшыла вызваляльны выхад з ужываннем двухфатоннага, інфрачырвонага (у адрозненне ад УФ) ўзбуджэння, і дазволіла ўпершыню атрымаць трохмерную карту адчувальнасці да глутамату ў зрэзах нейронаў картыкальнага мозгу пацукаTsien R.Y., Furuta T., Wang S. S.-H., Dantzker J. L., Dore T. M., Bybee W. J., Callaway E. M., Denk W. Brominated 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: photolabile protecting groups with biologically useful cross-sections for two-photon photolysis // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999, v. 96, p. 1193—1200..

 Распрацоўка флуарэсцэнтных бялковых маркераў 
міні|394x394пкс|Прымяненне метаду FRET для аналізу ўзаемадзеяння фосфакіназы А (ФКА) з цАМФ. Флуарэсцэінавы фрагмент, размешчаны на каталітычным дамене, і родамінавы фрагмент, змешчаны на рэгуляторную субадзінку ФКА, утвараюць FRET-пару перад дысацыяцыяй ФКА з-за звязвання цАМФ, якое радыкальна змяняе даўжыню хвалі выпускання.
Яшчэ да пераезду Цьсена ў Сан-Дыега ў 1989, праца Аляксандра Глейзера па флуарэсцэнтным фікабілібялкам абудзіла ў ім цікавасць да флуарэсцэнтнага адсочвання цАМФ. У якасці базы для флуарэсцэнтнай пазнакі ён разглядаў прыродныя цАМФ-злучальныя бялкі: гэта магло б адразу забяспечыць патрабаваныя афіннасці і селектыўнасці. У адсутнасць цАМФ фосфакіназа А (ФКА) неактыўна, а яе рэгуляторная і каталітычная субадзінкі цвёрда звязаныя. Звязванне цАМФ з рэгулятарнымі субадзінкамі прыводзіць да дысацыяцыі і актывацыі каталітычнай, што дае магчымасць пераносу фасфату з АТФ на некаторыя пэўныя бялкі. Наданне ферменту аптычнага сігналу ў выпадку такіх падзей звязвання вярнула Роджэра да яго ўніверсітэцкіх інтарэсаў у галіне флуарэсцэнтнага рэзананснага пераносу энергіі (FRET) паміж двума святлоадчувальнымі храмафорамі, якія знаходзяцца стэрычна блізка адзін да аднаго. Узбуджаны донарны храмафор можа перанесці энергію да акцэптары за кошт безвыпраменьвальнага дыполь-дыпольныга ўзаемадзеяння. Гэтая сістэма была сканструяваная за кошт прымацавання флуарафора першага тыпу да рэгулятарнай і другога тыпу да каталітычнай субадзінкам. FRET мог паўстаць у інтактнай ФКА пры блізкім кантакце субадзінак двух тыпаў, але павінен быў знікнуць пры дысацыяцыі пасля звязвання цАМФ: тады сігналы ў двух гэтых сітуацыях назіраліся б пры розных даўжынях хваль. Гэтыя эксперыменты, праведзеныя сумесна з групай Сюзаны Тэйлар, характарызаваліся цяжкай працай, якая патрабуе вялікай настойлівасці: патрэбныя былі вялікія колькасці рэкамбінантныя субадзінак ФКА. Нягледзячы на цяжкасці, праект скончыўся поспехам і даў пачатак метаду, у якім пазначаныя флуарэсцэінам каталітычныя субадзінкі звязваліся з пазначанымі родамінам рэгулятарнымі субадзінкамі з утварэннем FRET-сэнсараў на цАМФTsien R.Y., Adams S. R., Harootunian A. T., Buechler Y. J., Taylor S. S. Fluorescence ratio imaging of cyclic AMP in single cells // Nature, 1991, v. 349, p. 694—697.. Гэты метад знайшоў скарыстанне ў вывучэнні остэабластаўTsien R.Y., Civitelli R., Bacskai B. J., Mahaut-Smith M. P., Adams S. R., Avioli L. V. Single-cell analysis of cyclic AMP response to parathyroid hormone in osteoblastic cells // J. Bone Min. Res., 1994, v. 9, p. 1407—1417., меланацытаўTsien R.Y., Sammak P. J., Adams S. R., Harootunian A. T., Schliwa M. Intracellular cyclic AMP, not calcium, determines the direction of vesicle movement in melanophores: direct measurement by fluorescence ratio imaging // J. Cell Biol., 1992, v. 117, p. 57-72. і нейронаў AplysiaTsien R.Y., Bacskai B. J., Hochner B., Mahaut-Smith M., Adams S. R., Kaang B. K., Kandel E. R. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons // Science, 1993, v. 260, p. 222—226..

 Ва Універсітэце Каліфорніі ў Сан-Дыега: распрацоўка генетычна закадаваных макрамалекулярных індыкатараў 
Выкарыстанне флуарэсцэнтных бялкоў, такім чынам, элегантна дапоўніла клас нізкамалекулярных лігандаў. Аднак неабходныя бялкі трэба было ў велізарных колькасцях экспрэсіраваць і чысціць для селектыўнага прымацавання двух розных метак in vitro да розных бялковых даменаў або субадзінак з адначасовым захаваннем функцый бялкоў. Да таго ж, у больш ранніх работах бялкі таксама трэба было ўвесці ў клетку. Гэтыя цяжкасці вымусілі даследчыкаў распрацоўваць індыкатары, закадаваныя наўпрост у геноме — у гэтым выпадку неабходна было толькі ўвесці гены, якія кадуюць два флуарэсцэнтныя бялкі прыдатнага колеру, у якія вывучаюцца клеткі. Такі падыход прад’яўляў значна больш нізкія патрабаванні і даўнімаў выкарыстанне устояных працэдур для трансфекцыі клетак з малой колькасцю ДНК (у параўнанні з увядзеннем бялку) з наступным селектыўным адборам клетак, у якіх прайшла трансфекцыя. Гэтая задача звярнула ўвагу Цьсена на медузу Aequorea victoria (ужо другі раз), крыніца экварынаShimomura O., Johnson F., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell Comp. Physiol., 1962 v. 59, p. 223—239., гэтак карыснага ў класічных фізіялагічных эксперыментах. Сімамура выявіў, вылучыў і ачысьціў зялёны флуарэсцэнтны бялок (GFP) з прыблізна 10000 асобін, з наступнай характарызацыяй яго фізіка-хімічных уласцівасцяў, якія ўключаюць спектральныя, пры розных умовах. Ён паказаў, што GFP з’яўляецца FRET-акцэптарам ўзбуджэння ад донара-экварына і вырабляе in vivo флуарэсцэнцыі ў зялёнай вобласці спектру, адрозную ад сіняга сігналу вычышчанага прэпарата экварына пры ўзбуджэнні ў УФ-вобласціMorise H., Shimomura O., Johnson F. H., Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea // Biochemistry, 1974, v. 13, p. 2656—2662.. Сімамура таксама вызначыў храмафорную п-гідроксібензілідзенімідазалінавую групоўку ў ланцугі бялкуShimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea green-fluorescent protein // FEBS Lett., 1979, v. 104, p. 220—222..

Характэрызацыя часткі гена GFP Дугласам ПрэшэрамPrasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W., Prendergast F. G., Cormier M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene, 1992, v. 111, p. 229—233. ініцыявала сумесную працу ў розных лабараторыях. Роджэр працаваў над вытворчасцю і флуарэсцэнтнымі ўласцівасцямі GFP, выкарыстоўваючы Saccharomyces cerevisiae у супрацоўніцтве з Роджэрам Хеймам і Скотам Эмр. Марцін Чалфі (замежны член Лонданскага каралеўскага таварыства, 2018) з штата Калумбія, які першы прадэманстраваў УФ-індукаваны флуарэсцэнцыі GFP, уведзенага ў клеткі бесхрыбтовага, і прапанаваў патэнцыйнае прымяненне бялку ў якасці біямаркераў, працаваў на яго экспрэсіі ў Escherichia coli і Caenorhabditis elegan. Даследаванні Цьсена прывялі да выяўлення мутанта Y66H (BFP) з палепшанай стабільнай флуарэсцэнцыяй ў сіняй вобласці спектру ў адносінах да зыходных GFP дзікага тыпу. Далейшыя мадыфікацыі бялку, стэрэахімічна размясцілі трыптафан, прывялі да з’яўлення мутанта Y66W, кадавальныя цыановы флуарэсцентны бялок (CFP)Heim T. R., Prasher D. C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green-fluorescent protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, p. 12501-12504.Tsien R.Y., Heim R. Engineering green-fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer // Curr. Biol., 1996, v. 6, p. 178—182.. У пары FRET канфармацыённыя змены структуры УФ-узбуджанай BFP прыводзілі да пераносу энергіі да GFP. Гэта даўнімала здольнасць GFP ўзбуджацца хвалямі сіняга дыяпазону спектру, якія выпускаў донар BFP. Аднак у спектры ўзбуджэння GFP быў вялікі пік у УФ- і маленькі пік у сіняй вобласці. Праблема была вырашана стварэннем мутантавага варыянту GFP: непажаданы пік у УФ-вобласці знік, а сіні ўзрос прыблізна ў 5-6 разоў з наступным зрухам +10 нм пасля мутацыі S65T. У спробе праверыць гіпотэзу даследчыкі ўвялі пептыдную сувязь паміж BFP і мутантам GFP-S65T, а таксама з іншымі мутантамі, якія маюць падобны з GFP-S65T профіль ўзбуджэння. Селектыўнае УФ-узбуджэнне BFP, на самай справе, прыводзіла да розных тыпаў выпускання ў зялёнай і сіняй вобласці ў прысутнасці або адсутнасці FRET-пераносу да і пасля трыпсіноліза бялку. Далейшыя выпрабаванні пацвердзілі, што S65T з’яўляецца аптымальным флуарафорам пры ўмове увядзенні мутацыі F64L, якая забяспечвае захаванне структуры і фолдынг пры больш высокіх тэмпературахCormack B. P., Valdivia R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green-fluorescent protein (GFP) // Gene, 1996, v. 173, p. 33-38.. Гэты двайны мутант, названы «палепшаны (S65T-F64L) GFP», у вялікіх аб’ёмах вырабляецца кампаніяй Clontech.

Структурныя даследаванні GFP-S65T выявілі цыліндрычную структуру з дыяметрам 2,4 нм і даўжынёй 4,0 нм, якая ўключае 11 β-цяжоў, атачальных выцягнутую па восі спіраль, у цэнтры якой быў устаўлены храмафорTsien R.Y., Brejc K., Sixma T.K. ,Kitts P.A., KainS.R., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 2306—2311.. Такім чынам, групоўка была абаронена ад уздзеянняў растваральніка і старонніх ферментаў, але ў межах паражніны была прастора для патэнцыйнага ўвядзення араматычнага кальца, якое звязвалася б за кошт стэкінга з храмафорам; пазней гэта было праверана з дапамогай увядзення шэрагу мутацый, у тым ліку і T203Y, спектр гэтага варыянту меў зрухі ўзбуджэння і выпускання на прыблізна 20 нм. Атрыманы жоўты флуарэсцэнтны бялок (YFP) і яго далейшыя мутантныя разнавіднасці зарэкамендавалі сябе як добрыя акцэптары сігналу ад CFP, утвараючы альтэрнатыўныя пары CFP/YFP.
міні|436x436пкс|(а) Параўнанне абсарбцыйных і эмісійных уласцівасцяў варыянтаў GFP і (б) іх зборка ў FRET-пары.
міні|306x306пкс|Візуалізацыя структуры GFP дзікага тыпу. Чырвоным колерам вылучаныя альфа-спіралі, зялёным — бэта-лісты. Храмафор прадстаўлены шарастрыжневай мадэллю.
Роджэр таксама пацвердзіў ўтварэнне храмафорнай  п-гідроксібензілідзенімідазалінавай групоўкі з рэшткаў S65, Y66, і G67 ў ланцугу GFPCody C. W., Prasher D. C., Westler W. M., Prendergast F. G., Ward W. W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein // Biochemistry, 1993, v. 32, p. 1212—1218.. Механізм ўзнікнення храмафору уключаў дзіўнае de novo утварэнне гетэрацыкла з дэгідраваннем α-β С-С сувязі з утварэннем двайной сувязі. Для гэтага быў неабходны акцэптар вадароду — Цьсен меркаваў, што гэта быў атмасферны кісларод. Культываванне GFP-вырабляюць бактэрый у анаэробных умовах прыводзіла да таго, што сінтэзаваны бялок не валодаў флуарэсцэнцыяй, аднак яна выяўлялася праз некалькі гадзін пасля вытрымкі бялку на паветрыHeim T. R., Prasher D. C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green-fluorescent protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, p. 12501-12504. — уласцівасць, якая затым знайшло сваё прымяненне ў вывучэнні фізіялогіі.

 Стварэнне бялкоў-дэтэктараў шляхам утварэння пар «донар FRET»-«акцэптарны GFP-бялок» 
Прымяненне FRET-візуалізацыі спецыфічных ўнутрыклеткавых сігналаў патрабавала злучэння кампанентаў FRET з малекулай, якая спецыфічна звязвала б вывучаны клеткавы кампанент. У супрацоўніцтве з Ацусі Міявакі Роджэр спрабаваў прымацаваць донарны і акцэптарныя бялкі да процілеглым канцам цытазольнага дамена нядаўна кланаванага іназітол-1,4,5-трыфасфатнага (InsP3) рэцэптара. Хутчэй за ўсё, гэтая праца з’яўлялася адлюстраваннем яго цікавасці ў хімічным сігналінгу паміж клеткавымі мембранамі. Праект прывёў да разумення таго, як гэты важны пасярэднік працуе ў шкілетных цягліцах у звязку ўзбуджэнне-скарачэннеTsien R.Y., Vergara J., Delay M. Inositol 1,4,5-trisphosphate: a possible chemical link in excitationcontraction coupling in muscle // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1985, v. 82, p. 6352-6356. і як працуе фактар інфлюкса Ca2+Randriamampita C., Tsien R.Y. Degradation of a calcium influx factor (CIF) can be blocked by phosphatase inhibitors or chelation of Ca2+ // J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 29-32., які забяспечвае трансдукцыю з ўнутрыклеткавых дэпо Ca2+ да паверхні мембраны дэпо, якія аперуюцца Ca2+ варотPutney J. W. Forms and functions of store-operated calcium entry mediators STIM and Orai // Adv. Biol. Regul., 2017, v. 68, p. 88-96.. У выпадку сігналінга, пасля было даказана, што працэс працякае пад дзеяннем прамога, а ня хімічнага, спалучэння паміж павярхоўнымі кальцыевымі каналамі L-тыпу і ўнутрыклеткавых саркаплазматычнымі ратыкулярнай рыанадзінавымі рэцэптарамі выкіду кальцыяHuang C. L.-H., Pedersen T. H., Fraser J. A. Reciprocal dihydropyridine and ryanodine receptor interactions in skeletal muscle activation // J. Muscle Res. Cell Motil., 2011, v. 32, p. 171—202.. Аднак складанасці, якія ўзніклі з-за няпоўнага разумення механізму звязвання InsP3 з рэцэптарамі, прымусілі Цьсена звярнуць увагу на распрацоўку іншых дэтэктараў ўнутрыклеткавага кальцыя сумесна з Міцусіка Ікура. Гэтая праца даўнімала прымацаванне BFP і затым CFP да N-канца кальмадуліна (CaM). S65T і затым YFP, наадварот, прымацоўваліся да С-канца мэтавага пептыда М13. Канчатковая структура атрымлівалася злучэннем фрагментаў СаМ і М13Tsien R.Y., Miyawaki A., Llopis J., Heim R., Michael McCaffery J., Adams J. A., Ikura M. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green-fluorescent proteins and calmodulin // Nature, 1997, v. 388, p. 882—887.Tsien R.Y., Miyawaki A., Griesbeck O.,Heim R. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999, v. 96, p. 2135—2140..

Атрыманыя такім чынам генетычна закадаваныя пазнакі («хамелеоны»), здольныя да доўгатэрміновага выкарыстання і дастасавальныя да любой клеткі або арганізму, у якія магчыма ўвядзенне такіх ДНК, прывялі да з’яўлення аднаго з самых папулярных спосабаў адсочвання актыўнасці ў ідэнтыфікаваных нейронах і пашырылі дыяпазон аб’ектаў, якія вывучаюцца, да інтактных нервовых сістэм. Больш за тое, яны рассунулі межы выкарыстоўваных біялагічна важных малекул. Значныя намаганні даследчыкаў прывялі да адкрыцця лінкераў, якія забяспечваюць зліццё флуарэсцэнтных бялкоў з ФКА з адначасовым захаваннем здольнасці субадзінак да адказу на прысутнасць цАМФ. Такія бялкм маглі візуалізаваць субклеткавае размеркаванне цАМФ у кардыяміяцытах пасля стымуляцыі катэхаламінаўZaccolo M., Pozzan T. Discrete microdomains with high concentration of cAMP in stimulated rat neonatal cardiac myocytes // Science, 2002, v. 295, p. 1711—1715. . Нарэшце, мадыфікаваны хамелеон, у якім М13 быў заменены на пептыд-субстрат кіназы, а СаМ на бялковы дамен, які змяшчае фосфаамінакіслотны злучны дамен, які можа звязваць фасфараляваны серын, трэанін або тыразін, быў здольны візуалізаваць спецын, адпаведна. Фасфараляванне кіназай названых астаткаў прыводзіць да ўтварэння комплексу, у якім зменена адлегласць або арыентацыя паміж донарным і акцэптарным бялкаміZhang J., Allen M. D. FRET-based biosensors for protein kinases: illuminating the kinome // Mol. Biosyst., 2007, v. 3, p. 759—765. . Неўзабаве гэты метад стаў незаменным у даследчай практыцы.

 Завяршэнне палітры колераў флуарэсцэнтных бялкоў; пашырэнне вобласці ўжывання FRET для вымярэння мембранавага патэнцыялу 
Далейшыя распрацоўкі прывялі да папаўнення арсенала флуарэсцэнтных бялкоў, пакрыўшы шырокі дыяпазон спектра і прадаставіўшы магчымасці да фотапераключэння Shaner N. C., Patterson G. H., Davidson M. W. Advances in fluorescent protein technology // J. Cell Sci., 2007, v. 120, p. 4247-4260.Tsien R.Y., Shaner N. C., Campbell R. E., Steinbach P. A., Giepmans B. N. G., Palmer A. E. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein // Nat. Biotechnol., 2004, v. 22, p. 1567—1572.Tsien R.Y., Rodriguez E., Campbell R., Lin J., Lin M., Miyawaki A., Palmer A., Shu X., Zhang J. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins // Trends Biochem. Sci., 2016, v. 42, p. 111—129.. Адкрыццё і даступнасць гена, які кадуе чырвоны флуарэсцэнтны бялок з каралаў (DsRed)Matz M. V., Fradkov A. F., Labas Y. A., Savitsky A. P., Zaraisky A. G., Markelov M. L., Lukyanov S. A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species // Nat. Biotechnol., 1999, v. 17, p. 969—973. прымусілі Роджэра не абмяжоўвацца GFP ў сваіх даследаваннях. DsRed з’яўляецца тэтрамерам, чый храмафорны складнік пачынаецца гэтак жа, як і ў GFP. Аднак далейшае дэгідрыраванне прыводзіць да ўтварэння ацыліміна, стабільнага толькі ў асяроддзі інтактнага бялку і які паказвае доўгахвалевы зрух у спектрах паглынання і выпусканняWall M. A., Socolich M., Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed // Nat. Struct. Biol., 2000, v. 7, p. 1133—1138.Yarbrough D., Wachter R. M., Kallio K., Matz M. V., Remington S. J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-Å resolution // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2001, v. 98, p. 462—467.. Шляхам накіраванай эвалюцыі быў створаны монамерны чырвоны флуарэсцэнтны бялок (RFP), менш пераборлівы да зліцьця з іншымі бялкамі у параўнанні з тэтрамерам і які стаў асновай для цэлага набору монамерных бялкоў, чые максімумы выпускання пакрылі астатнюю частку бачнага спектру аж да 648 нмCampbell R., Tsien R.Y., Tour. O., Palmer A., Steinbach P., Baird G. S., Zacharias D. A monomeric red fluorescent protein // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2002, v. 99, p. 7877-7882..
міні|472x472пкс| Ужыванне метаду FRET для выяўлення мембраннага патэнцыялу. У дадзеным прыкладзе няздольны да пранікнення праз мембрану донарны флуарафор размешчаны на вонкавым боку клеткавай мембраны, прымацаваны да фасфаліпіда. Зараджаны трансмембранный аксанальны акцэптар пераважна звязваецца з таго ж вонкавага боку ў выпадку цалкам палярызаванай клеткі, якая знаходзіцца ў спакоі — тады з-за блізкага размяшчэння флуарафораў утворыцца FRET-пара. Пры дэпалярызацыі адбываецца транслакацыя аксанолу да ўнутранага боку, што суправаджаецца павелічэннем выпускання групы донара ў параўнанні з акцэптарнай групоўкай
Роджэр таксама прыклаў руку да маніпуляцый з самой тэхнікай FRET, рэалізаваўшы свае раннія навуковыя інтарэсы ў аптычных вымярэннях мембраннага патэнцыялу. Гэта змагло палепшыць устояныя, але часта адносна павольныя ці нізкаадчувальныя метады, заснаваныя на адным індыкатарным флуарафоры. Двухкампанентны, заснаваны на FRET падыход выкарыстоўваў у якасці донара флуарэсцэнтныя лектыны, а пазней пазначаны кумарынам фасфатыдылэтаналамін, звязаны з вонкавага боку мембраны. Донары пераносілі энергію зараджанаму трансмембраннаму біс(1,3-дзігексіл-2-тыабарбітурат)тры (або пента)метынаксанольнаму акцэптару, калі ён за кошт зарада праходзіў з вонкавага боку мембраны ва ўнутраную пры змене мембраннага патэнцыялу. Гэты падыход дазваляў дасягнуць беспрэцэдэнтнай адчувальнасці (на кожныя 100 мВ сігнал флуарэсцэнцыі вырастаў больш чым на 50 %) і кароткіх часовых пастаянных (менш 0,4 мс) у параўнанні з іншымі аптычнымі індыкатараміTsien R.Y., Gonzalez J. E. Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer // Chem. Biol., 1997, v. 4, p. 269—277..

 Ад клетачнай фізіялогіі к сістэмнай фізіялогіі, трансляцыйнай медыцыне і распаўсюджванню новых індыкатараў 
Бліжэй да канца сваёй навуковай кар’еры Цьсен здолеў распрацаваць такія прылады аптычнага аналізу, якія з асаблівым поспехам знайшлі сваё ўжыванне пры даследаванні цэлых органаў ці нават жывёл. Гэтыя інструменты патэнцыйна маглі выкарыстоўвацца ў абласцях клінічнай, нейрахірургічнай, сардэчна-сасудзістай або анкалагічнай медыцыны. Некаторыя з іх былі распрацаваны ў супрацоўніцтве з Нгуен Тхао Куен (). Новая флуарэсцэнтна-мечаная лёгка ўводзімая ў клетку і якая злучаецца з нервам малекула F-NP41, накіраваная на ўзаемадзеянне з бялком базальнай мембраны ламінін, можа палепшыць аператыўную візуалізацыю хранічна ўсечаных нерваўHussain T., Tsien R.Y. et al. Fluorescently labeled peptide increases identification of degenerated facial nerve branches during surgery and improves functional outcome // PLoS ONE, 2015, v. 10, e0119600.Tsien R.Y. et al. Laminin targeting of a peripheral nerve-highlighting peptide enables degenerated nerve visualization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2016, v. 113, p. 12 774-12 779, што патэнцыйна дазваляе спрасціць распрацоўку і хірургічнае выкананне «рамонту» нерваўGlasby M. A., Gschmeissner S. G., Hitchcock R. J. I., Huang C. L.-H. The dependence of nerve regeneration through muscle grafts in the rat on the availability and orientation of basement membrane // J. eurocytol., 1986, v. 15, p. 497—510.Gattuso J. M., Davies A. H., Glasby M. A., Gschmeissner S. E., Huang C. L.-H. Peripheral nerve repair using muscle autografts: recovery of transmission in primates // J. Bone Jt Surg. Ser. B, 1988 v. 70, p. 524—529.. Тэхніка мечання для пазітронна-эмісійнай тамаграфіі, якая выкарыстоўвае ін’ектаваныя эрытрацыты, мечаныя пазітрон-выпускалай, мультымадальны флуарэсцэнтнай пазнакай, можа патэнцыйна выкарыстоўвацца для выяўлення нутрачарапнога кровазліцця як альтэрнатыва 99mTc-пазначаныя рэчывамTsien R.Y. et al. 18F-positron-emitting/fluorescent labeled erythrocytes allow imaging of internal hemorrhage in a murine intracranial hemorrhage model // J. Cereb. Blood Flow Metab., 2017, v. 37, p. 776—786. і можа быць карысная ў эксперыментальных ЯМР-даследаваннях цэрэбральных патафізіалагічных працэсаўSmith J. M., Bradley D. P., James M. F., Huang C. L.-H. Physiological studies of cortical spreading depression // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc., 2006, v. 81, p. 457—481.. Увядзенне ў практыку пранікальных праз мембрану пептыдаў, якія паказваюць значныя змены ў флуарэсцэнцыі пасля разразання асацыяванымі з пухлінамі пратэазамі ўнутры клеткі можа патэнцыйна дапамагчы ў ранняй дыягностыцы злаякасных пашкоджанняўTsien R.Y. et al. Early detection of squamous cell carcinoma in carcinogen induced oral cancer rodent model by ratiometric activatable cell penetrating peptides // Oral Oncol., 2017, v. 71, p. 156—162.. Было высветлена, што як гэтыя здольныя да актывацыі пептыды, так і іх звязаныя з гадалініем дендрымерныя формы селектыўна назапашваюцца ў пухлінных клетках, што паляпшае дэтэкцыю апошніх і прапануе сродкі для іх дыягнаставання метадам ЯМР у будучыніTsien R.Y., Malone C. D., Olson E. S. et al. Tumor detection at 3 tesla with an activatable cell-penetrating peptide dendrimer (ACPPD-Gd), a T1 magnetic resonance (MR) molecular imaging agent // PLoS ONE. (http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0137104). Здольныя да актывацыі пептыды падобным чынам выкарыстоўваліся для дастаўкі анты-тубулінавага радыёсенсібілізатара монаметылаурыстаціна Е селектыўна да пухлінных клетак, што адчыняе новы гарызонт ужывання гэтых агентаў у тэрапеўтычных мэтахTsien R.Y. et al. Tumor radiosensitization by monomethyl auristatin E: mechanism of action and targeted delivery // Cancer Res., 2015, v. 75, p. 1376—1387..

На працягу сваёй кар’еры Цьсен спрабаваў зрабіць распрацаваныя ім ліганды даступнымі для калег. Пры ранніх распрацоўках хін-2 Роджэру не ўдалося пераканаць Нацыянальную карпарацыю даследаванняў і распрацовак Злучанага каралеўства ў камерцыйнай значнасці абагульненай структуры, адчувальнай да кальцыя з беспрэцэдэнтнай дакладнасцю і селектыўнасцю. Пазней кампанія Lancaster Synthesis (цяпер частка Johnson Matthey Company Alfa Aesar) заявіла аб цікавасці да хін-2 і яго АМ-вытворнаму. Адзін з вынікаў навуковай актыўнасці Роджэра — каля 160 патэнтаў у ЗША. Цьсен таксама заснаваў некалькі кампаній: так, з Чарльзам Зукерам ён стварыў Aurora Biosciences Corporation, якая вырабляе прылады для пошуку лекаў з дапамогай флуарэсцэнтных маркераў, і Senomyx, якая займаецца пошукам мадулятараў смакавых рэцэптараў. Дзякуючы яго патэнтам іншыя людзі таксама змаглі ўтвараць кампаніі, напрыклад, Molecular Probes.

 Пашаны і ўзнагароды 

 Нобелеўская прэмія 
Роджэр падзяліў у 2008 годзе Нобелеўскую прэмію па хіміі з Асаму Сімамурай (Марская біялагічная лабараторыя Вудс Хоўл) і Марцінам Чалфі (Калумбійскі ўніверсітэт, ЗША). Фармулёўка камітэта асабліва падкрэсліла ўклад Цьсена ў разуменне флуарэсцэнтных уласцівасцяў GFP і блізкіх да яго бялкоў, які прывёў да іх прымянення ў даследаванні дынамічных працэсаў у жывых сістэмах. У даніну гонару і павагі да Дугласа Прэшэра, які першым пачаў задачу вывучэння GFP, ён запрасіў Цьсена на цырымонію.

 Іншыя ўзнагароды 

 1986 — Прэмія Лампарта Нью-Ёркскай Акадэміі Навук;
 1989 — Узнагарода Э. Явіца для даследчыкаў у галіне нейранавук (NINCDS, 1989—1996);
 1991 — Узнагарода W. Alden Spencer
 1995 — Міжнародная прэмія Гайрднера;
 1995 — Прэмія Artois-Baillet-Latour за дасягненні ў галіне аховы здароўя (Бельгія);
 2002 — Узнагарода Амерыканскага Хімічнага Таварыства за крэатыўныя распрацоўкі;
 2002 — Узнагарода HP Heineken у галіне біяхіміі і біяфізікі, Каралеўская Нідэрландская Акадэмія Навук;
 2002 — Медаль Макса Дэльбрука за дасягненні ў малекулярнай медыцыне, Інстытут Макса Дэльбрука, Берлін;
 2004 — Прэмія Вольфа па медыцыне, Ізраіль;
 2004 — Прэмія Кеё ў галіне медыцынскіх навук, Універсітэт Кеё, Японія;
 2006 — Узнагарода імя Люіса С. Розэнсціла за выдатную працу ў фундаментальнай біямедыцынскай навуцы;
 2006 — Медаль Уілсана;
 2012 — Узнагарода Golden Goose.

 Сяброўства ў арганізацыях і таварыствах 

 1995 — Абраны член Інстытута медыцыны ЗША;
 1998 — Член Амерыканскай акадэміі мастацтваў і навук;
 1998 — Член Нацыянальнай акадэміі навук ЗША;
 2006 — Замежны член Лонданскага каралеўскага таварыства;
 2014 — Ганаровы член Кембрыджскага філасофскага таварыства.

 Сям’я 
Цьсен быў жанаты на Вэндзі Глоўб. Родных дзяцей у Роджэра не было; з жонкай выхоўваў пасерба Макса Рынка.

 Асабістыя якасці 
Па словах яго сябра Крыстафера Хуаня, Цьсен і яго навуковы кіраўнік у аспірантуры Рычард Эдрыян «падзялялі падобныя навуковыя і асобасныя каштоўнасці, мадэлі паводзін, добрыя, шчодрыя, паважлівыя адносіны да свету і ў вышэйшай ступені сумленныя і чалавечыя адносіны да іншых».

 Захапленні і хобі 
Займаўся аматарскай фатаграфіяй. Любіў актыўны адпачынак на прыродзе.

 Спасылкі 

 Фатаграфіі Роджера на партале Wikimedia Commons (англ.)
 Веб-сайт лабараторыі Цьсен ва ўніверсітэце Сан-Дыега
 Веб-старонка Роджера на партале Кембрыджскага ўніверсітэта

Катэгорыя:Замежныя члены Лонданскага каралеўскага таварыства
Катэгорыя:Члены і члены-карэспандэнты Нацыянальнай акадэміі навук ЗША
Катэгорыя:Лаўрэаты Нобелеўскай прэміі з ЗША
Катэгорыя:Лаўрэаты Нобелеўскай прэміі па хіміі
Катэгорыя:Біяхімікі ЗША
Катэгорыя:Лаўрэаты Нобелеўскай прэміі паводле алфавіта
Катэгорыя:Старонкі з недагледжанымі перакладамі