Севера Ачоа

Севера Ачоа дэ Альборнас (; 25 верасня 1905, Луарка, Іспанія — 1 лістапада 1993, Мадрыд) — іспанскі і амерыканскі біяхімік, лаўрэат Нобелеўскай прэміі па фізіялогіі і медыцыне 1959 года «адкрыццё механізмаў біялагічнага сінтэзу рыбануклеінавай і дэзоксірыбануклеінавай кіслот»Інфармацыя на сайце Нобелеўскага камітэта (разам з Артурам Корнбергам).

 Біяграфія і навуковая дзейнасць 

 Навучанне. Першыя працы 
Севера Ачоа нарадзіўся 25 верасня 1905 года ў Луарцы, невялікім мястэчку ў Астурыі, на ўзбярэжжы Атлантычнага акіянаBiogr. Mems Fell. R. Soc. vol. 43 351—365. (1997). Ён быў малодшым з сямі сыноў, яго бацька быў юрыстам і бізнесменам і памёр, калі Северы было 7 гадоў.

Пасля смерці бацькі сям’я, імкнучыся пажыць у міжземнаморскім клімаце, перабралася ў Малагу, на ўзбярэжжа, жывучы там з сярэдзіны верасня па сярэдзіну чэрвеня. Там Севера пайшоў у прыватную школу, падтрымліваемую езуітамі, а потым у Вышэйшую школу, дзе атрымаў ступень бакалаўра ў 1921 годзе. На працягу апошняга года ў Вышэйшай школе ён зацікавіўся натуральнымі навукамі і ў 1923 годзе паступіў у медыцынскую Школу пры Мадрыдскім Універсітэце. Ён ніколі не імкнуўся быць доктарам, аднак медыцына дазволіла яму вывучаць біялогію. Ён быў зачараваны іспанскім нейрабіёлагам Сант’яга Рамон-і-Кахалем і марыў аб вывучэнні гісталогіі пад яго пачаткам. Але, на вялікі жаль Севера, калі ён паступіў у Медыцынскую Школу, Кахаль, якому было ўжо больш 70 гадоў, адышоў ад навукі. Аднак Севера Ачоа ніколі не стамляўся перачытваць біяграфію Кахаля, а яго кніга пад назвай «Рэкамендацыі да навуковых даследаванняў» (Advice on scientific research) мела на Ачоа велізарны ўплыў. На трэцім курсе медыцынскай школы Ачоа вырашае прысвяціць сваё жыццё вывучэнню біялогіі.

Другім навукоўцам, хто меў моцны ўплыў на Севера Ачоа, быў адзін з яго настаўнікаў, Хуан Негрын, які бываў у Германіі. Ён раіў Ачоа чытаць кнігі не толькі на іспанскай мове. На той момант адзінай замежнай мовай, якой валодаў Ачоа, была французская, і яго наступнае рашэнне ехаць у Германію і Англію для суісканне ступені доктара была выклікана імкненнем вывучаць замежныя мовы. Прафесар Негрын прадаставіў Севера Ачоа і яго сябру Хасэ Вальдекасасу магчымасць праводзіць некаторыя даследаванні ў яго лабараторыі ў вольны час. Ён прапанаваў ім вылучыць крэатынін з мачы. Севера Ачоа зацікавіўся функцыямі і метабалізмам крэаціна і крэатыніна. Ачоа і Вальдекасас прапанавалі просты мікраметад для вызначэння канцэнтрацыі крэаціна ў цягліцахA MICRO METHOD FOR THE ESTIMATION OF TOTAL CREATININE IN MUSCLE. Для прымянення гэтага метаду і авалодання англійскай мовай Ачоа правёў 2 месяцы ў Глазга ў прафесара Ноэля Патона, які працаваў над метабалізмам крэаціна. Вярнуўшыся ў Іспанію з добрым веданнем англійскай (у яго была прыроджаная здольнасць да вывучэння моў), ён прапанаваў Часопісу біялагічнай хіміі (Journal of Biological Chemistry) артыкул з апісаннем свайго метаду колькаснага вызначэння крэаціна і з задавальненнем выявіў, што метад быў прыняты пасля нязначнай праверкі(With J.G. Valdecasas) A micro-method for the estimation of creatinine in muscle J. Biol Chem. 81, 351—357. (1929). Вывучэнне крэаціна пацягнула за сабой цікавасць Ачоа да хіміі скарачэння цягліц і да працы нямецкага вучонага Ота Меергофа над фосфакрэатынам, толькі што адкрытым злучэнні.

 Праца ў Германіі і Англіі 
Ота Меергоф працаваў у Інстытуце Кайзера Вільгельма (Kaiser Wilhelm Institute, K.W.I.), заснаваным у 1910 годзе ў Далеме, фешэнэбельным прыгарадзе Берліна. Прамыслоўцамі і банкірамі, якія разумеюць, што дабрабыт Германіі грунтуецца на хуткім развіцці фундаментальных навук, былі забяспечаны вялікія сродкі. Дзве значных фігуры біяхіміі —Карл Нойберг, дырэктар Інстытута, і Ота Варбург — працавалі ў K.W.I. Меергофа цікавіла праблема: як патэнцыйная энергія ежы становіцца даступнай клетцы? Ён абраў цягліцу як эксперыментальную мадэль, каб паспрабаваць знайсці сувязь паміж хімічнымі ператварэннямі і вытворчасцю цяпла і механічнай працай. Севера Ачоа звярнуўся з просьбай да Меергофа, каб той дазволіў яму прысвяціць у яго лабараторыі некаторы час вывучэнню як скарачэння цягліц, так і Германіі ў цэлым. Да яго задавальнення, ён быў прыняты там і прыбыў у лабараторыю восенню 1929. Севера Ачоа не ведаў нямецкага, аднак Меергоф гаварыў па-англійску, і праз два месяцы Севера Ачоа вывучыў нямецкую ў той ступені, якая была дастатковая для далейшых зносін. У ліку іншых аспірантаў у K.W.I. працавалі таксама Фрыц Ліпман і Дэвід Нахмансон. Адной з выдатных асаблівасцяў K.W.I. з’яўлялася імкненне ліквідаваць бар’ер паміж фізікай, хіміяй і біялогіяй. K.W.I. даў велізарны штуршок маладым біяхімікам, такім, як Севера Ачоа і Фрыц Ліпман. Севера Ачоа вывучаў, як скарачэнне цягліц можа выкарыстоўваць іншую энергію, акрамя той, што паступае ад распаду вугляводаў, і ці ўплывае распад фосфакрэатыніна на скарачэнні. Адказ прыйшоў пазней (пасля адкрыцця АТФ), калі Ламан выявіў, што фосфакрэатын рэгенеруе АТФ шляхам пераносу PO4 да АДФ. У канцы 1929 года Меергоф перайшоў з Далема ў Гейдэльберг, дзе таварыства Кайзера Вільгельма пабудавала прыгожы новы будынак, які ўключаў чатыры даследчых інстытута (фізічны, хімічны, фізіялагічны і эксперыментальнай медыцыны). Меергоф быў прызначаны дырэктарам фізіялагічнага інстытута, і Севера Ачоа пераехаў з ім у Гейдэльберг. Ён вярнуўся ў Мадрыд ў 1930 годзе, абараніўшы дысертацыю аб ролі наднырачнікаў ў скарачэнні цягліц, і ў 1931 ажаніўся з Кармэн Кобіан Гарсія. Неўзабаве ён зноў з’ехаў за мяжу (ужо з жонкай) у лабараторыю Генры Дэйла (Нацыянальны інстытут медыцынскіх даследаванняў у Лондане), дзе працаваў над сваім першым ферментам, гліоксілазай, падтрымліваючы сяброўскія адносіны з Мадрыдскім універсітэтам. Ачоа заставаўся ў Лондане два гады і вярнуўся ад сваіх даследаванняў гліоксілазы да ролі наднырачнікаў ў скарачэнні цягліц.

 Канец 1930-х. Пераезд у ЗША 
У 1935 годзе Ачоа быў вылучаны на месца дырэктара аддзела фізіялогіі ў новым інстытуце ў Мадрыдзе. Але праз некалькі месяцаў пачалася Грамадзянская вайна ў Іспаніі, і ён вырашыў пакінуць Іспанію і вярнуцца да Меергофа. Калі Ачоа прыехаў у Германію, у 1936 годзе, краіна была на піку нацызму, і пазіцыя Меергофа была хісткай. Яго лабараторыя, аднак, працавала прадуктыўна, але ў ёй адбыліся сур’ёзныя змены: з лабараторыі фізіялогіі яна ператварылася ў лабараторыю біяхіміі. Гліколіз і ферментацыя ў цягліцах, вылучэнне дрожджаў, прыватныя рэакцыі, каталізаваныя вычышчанымі ферментамі, былі галоўнымі прадметамі даследавання. Гэты перыяд, аднак, працягнуўся нядоўга, пакуль Меергоф ў жніўні 1939 не пераехаў у Парыж, далучыўшыся да Інстытута біялогіі і фізічнай хіміі. Перад ад’ездам Меергоф уладкаваў Ачоа ў лабараторыю біялогіі мора ў Плімуце на шэсць месяцаў. Нарэшце, Ачоа працаваў з Рудольфам Пітэрсам ў Оксфардскім універсітэце. Праца з Пітэрсам над роляй вітаміна B1 (тыяміну) і кокарбоксілазы (пірафосфарнага складанага эфіру тыяміну) у працэсе акіслення пірувата была вельмі прадуктыўная(With R.A. Peters) Vitamin B1 and carboxylase in animal tissures. Biochem. J. 32, 1501—1515.(1938)(With I. Banga & R.A. Peters) Pyruvate oxidation in brain. VII. Some dialysable components of the pyruvate oxidation system. Biochem. J. 33, 1980—1996. (1939). Яны ўсталявалі, што кокарбаксілаза і звязаны тыямін з’яўляюцца коферментамі ў дадзеным працэсе, які адбываецца ў галубіным мозгу. Яны таксама паказалі неабходнасць у адэнінавых нуклеатыдаў, якая наводзіць на думку аб шчыльным суіснаванні акіслення і фасфаралявання, што павялічыла цікавасць Ачоа да акісляльнага фасфаралявання. Але Оксфардскі перыяд працягнуўся нядоўга з-за Другой сусветнай вайны. Лабараторыя была выкарыстаная для працы на патрэбы вайны, і Ачоа як іншаземец быў звольнены. Ён вырашае адправіцца ў Злучаныя Штаты і піша Карлу і Герце Коры (медыцынскі факультэт Вашынгтонскага універсітэта ў Сэнт-Луісе), і яго туды прымаюць. Коры знаходзіць фінансаванне, і ў жніўні 1940-га года Кармэн і Севера Ачоа адплываюць у ЗША. Лабараторыя Карла і Герты Коры была ўражальным месцам: у цэнтры ўвагі там знаходзіліся ферменты, асабліва глікагенфосфарылаза. Ачоа шмат даведаўся, нягледзячы на тое, што яго ўласная праца над ферментатыўным механізмам канверсіі фруктозы ў глюкозу ў экстракце печані стала, хутчэй, расчараваннем. Аднак ён разумеў важнасць тэхнікі вылучэння і характэрызацыі ферментаў і авалодаў ёю. У 1942 годзе ён заняў пасаду навуковага супрацоўніка на медыцынскім факультэце Нью-Ёркскага ўніверсітэта (N.Y.U.).

 Прамежкавы метабалізм 
Два гады Ачоа працаваў на медыцынскім факультэце Нью-Ёркскага ўніверсітэта, пасля чаго перайшоў на факультэт біяхіміі ў стары будынак праз дарогу, дзе заняў пасаду памочніка прафесара біяхіміі. Праз два гады ён стаў фармаколагам. Факультэт фармакалогіі таксама грунтаваўся ў старым будынку і меў новыя лабараторыі, так што Севера Ачоа набыў больш прасторы і пашырыў сваю дзейнасць, прымаючы на працу студэнтаў і работнікаў са ступенню. Яго першае даследаванне ў Нью-Ёркскім універсітэце было звязана з акісляльным фасфараляваннем. Раней, у Оксфардзе, Севера Ачоа паказаў, што акісленне суправаджае фасфараляванне AMP ў ATP, прытрымліваючыся за пераносам фосфару ад ATP да цукруCoupling of phosphorylation with oxidation of pyruvic acid and brain. J. Biol Chem. 138, 751—773.(1941). Абавязковае суіснаванне фасфаралявання і акіслення пірувата, таксама даказанае Белітцэрам ў СССР і Калкарам ў Даніі, з’яўляецца значным адкрыццём. Выкарыстоўваючы сардэчны гомагенат, ён вызначыў атамныя суадносіны эстэрыфікаванага фосфару да выдаткаванага кіслароду (дачыненне P/O). Параўнанне фасфаралявання, прычынай якога з’яўляецца акісленне піравінаграднай кіслаты з тым, прычынай якога з’яўляецца дысмутацыя піравінаграднай кіслаты і фосфагліцэрынавай кіслаты ў сардэчным экстракце дала P/O=3 для першай рэакцыіEfficiency of aerobic phsophorylation in cell free extracts. J. Biol Chem. 151, 493—505.(1943). Раней яно раўнялася 2; прыніжаным значэнне P/O было з прычыны страт, выкліканых гідразізам ATP ATP-азой. Значэнне 3 было ў далейшым пацверджана Альбертам Ленінджэрам з выкарыстаннем мітахондрый. Пасля завяршэння гэтай працы, Севера Ачоа палічыў, што механізм акісляльнага фасфаралявання, не можа быць зразуметы без дадатковых ведаў аб ферментатыўных рэакцыях, якія праходзяць пры акісленні, асабліва пра тыя, якія спадарожнічаюць фасфараляванню. Як было вядома дзякуючы Крэбсу, цыкл трыкарбонавых кіслот з’яўляецца галоўным акісленнем ежы ў клетцы, а Кілін і Варбург ў сваёй працы паказалі, што ў гэты працэс ўцягнутыя пірыдынавыя нуклеатыды, флавапротэіны і цытахромы. Ачоа абраў для вывучэння ізалімонную дэгідрагеназу.
міні|Цыкл цытрынавай кіслаты з аканітатам
Было вядома, што ізацытрат утвараецца з цытрата з дапамогай цыс-аканітата, але рэакцыя, якая вядзе да α-кетаглютарату, не была даказаная, толькі прадказаная, і Ачоа вырашыў прыгатаваць меркаваны інтэрмедыят «оксаласукцынавую кіслату», чаго ён і дасягнуў пасля некалькіх няўдалых спробаў. Пачаўшы з оксаласукцынавай кіслаты, ён назіраў утварэнне α-кетаглютарата і зрабіў заключэнне аб тым, што оксаласукцынавая кіслата сапраўды з’яўляецца інтэрмедыятам дадзенай рэакцыі. Тым часам, біяхімікі былі ўражаны з’явай фіксацыі CO2, якая мае месца ў гетэратрофнай бактэрыі, прадэманстраванай Вудам і Веркманам. Ачоа прыйшла думка, што рэакцыя ізалімоннай дэгідрагеназы зварачальная і абумоўлівае механізм працэсу фіксацыі CO2 у клетках жывёл. Лабараторыя Севера Ачоа не была абсталявана прыборамі, якія выкарыстоўваюць ізатопы; ён вырашыў, што можа вывучыць рэакцыю, якая павінна прывесці да акіслення NADPH спектрафотаметрычным шляхам, калі ізацытрат утвараецца шляхам фіксацыі CO2 на α-кетаглютараце. Аднак, як ён піша ў «Штогадовым аглядзе» (Annual Reviews), ён не верыў, што гэта спрацуе і адцягваў эксперымент да таго часу, пакуль не быў падбадзёраны Эфраімам Ракерам. Апошні працаваў на факультэце мікрабіялогіі паверхам ніжэй, і паміж імі было шмат дыскусій. Калі, нарэшце, Ачоа правёў эксперымент і ўбачыў, як стрэлка спектрафатометра прыйшла ў рух, паказваючы акісленне NADPHBiosynthesis of tricarboxylic acids by carbon dioxide fixation. III. Enzymatic mechanisms. J. Biol Chem. 174, 133—157.(1948), ён настолькі ашалеў ад шчасця, што выбег і закрычаў: «ідзіце і паглядзіце, як рухаецца стрэлка спектрафатометра!». Але, улічваючы, што было ўжо 9 вечара, вакол нікога не аказалася. Спектрафатометр, на якім быў выраблены эксперымент, быў перададзены ў дар амерыканскаму Філасофскаму таварыству і павінен быў быць вернуты праз год, але поспех эксперыментаў і неабходнасць у спектрометры для далейшай працы прымусіла таварыства дазволіць Ачоа захаваць прыбор у сябе. Пасля гэтага ён становіцца віртуозам спектрафотаметрычнага даследавання акісляльных ферментаў; часта доследная рэакцыя магла злучацца з трыма ці чатырма іншымі ферментатыўнымі рэакцыямі да таго часу, пакуль ланцуг не завершыцца, і NAD- або NADP- залежныя рэакцыі, у якіх акісляліся або аднаўляліся пірыдзінавыя нуклеатыды, маглі забяспечыць аснову для бесперапыннага спектраметрычнага даследавання актыўнасці ферментаў. Доўгі час гэты спектрафатометр быў адзіным на ўсім факультэце — паспяховыя Амерыканскія лабараторыі не былі гэтак забяспечаны, як гэта часам здавалася.

У гэты час у Севера Ачоа быў яго першы дыпломнік, Алан Мелер, а таксама два аспіранта: Сант’яга Грысаліа і Артур Корнберг. Аднойчы, Алан, назіраючы за ўтварэннем пірувата з малата, заўважыў хуткае акісленне малата пры даданні NADP да экстракта галубінай печані. Гэта прывяло да адкрыцця «яблычнага» фермента — малатдэгідрагеназы(With A.H. Mehler & A. Kornberg) Biosynthesis of dicarboxylic acids by carbon dioxide fixation. I. Isolation and properties of an enzyme from pigeon liver cayalyzing the reversible oxidative decarboxylation of I-malic acid. J. Biol Chem. 174, 979—1000.. Фермент каталізуе зварачальную рэакцыю:малат + NADP ↔ піруват + CO2 + NADPH + H."Яблычны" фермент таксама каталізуе утварэнне пірувата з оксалаацетата, якое працякае з вылучэннем CO2 і аднаўленнем малата NADPH. Гэта працуе ў акісленні тлушчавых кіслот, абумоўленым коэнзімам А і NADPH. Яны заключылі, што гэта — адзін фермент з двума актыўнымі цэнтрамі. Гэта нагадала ім пра рэакцыю ізалімоннай дэгідрагеназы і прывяло да высновы, што ізалімонная дэгідрагеназа, якая, як адзначалася раней, каталізуе дзве рэакцыі, таксама мае два актыўных цэнтра: адзін для ізацытрата, іншы для акіслення оксаласукцынавай кіслаты, і, што гэта не сумесь двух ферментаў — ізалімоннай дэгідрагеназы і оксаласукцынавай дэгідрагеназы — як лічылася раней.

«Яблычны» фермент быў выкарыстаны Вольфам Вішняком і Ачоа для рэакцыі аднаўленчага карбоксіліравання пірувата ў малат ў прысутнасці гран шпінату і NADPH(With W. Vishniac) Photochemical reduction of pyridine nucleotides by spinach grana
and coupled carbon dioxide fixation. Nature 167, 768—769 (1951). Гэта была першая дэманстрацыя фотахімічнага аднаўлення пірыдынавых нуклеатыдаў хларапластавымі прэпаратамі. У 1948 Джо Штэрн, былы дыпломнік Ганса Крэбса, у рангу доктара навук пераходзіць у лабараторыю Севера Ачоа. Ачоа вырашае, што надышоў момант для працы над самым цікавым ферментам цыклу Крэбса, над тым, які ўтварае цытрат з оксалаацэтата і актыўнага ацэтата. Ён быў вядомы, як фермент, што «кандэнсуецца». Экстракт тканін жывёл быў, аднак, неактыўны ў цытратным сінтэзе, але яны не падалі духам і верылі, што такое адбываецца з-за нерастваральнасці фермента. Яны змянілі бактэрыю, спадзяючыся, што фермент растворыцца. Выкарыстоўваць арганізмы, найбольш прыдатныя для вырашэння праблемы было характэрнай рысай Севера Ачоа. Нарэшце, сумясціўшы экстракты кішачнай палачкі і свінога сэрца яны дамагліся добрага сінтэзу цытрата з ацэтылфасфата і оксалаацэтата ў прысутнасці каталітычных колькасцяў коэнзіма А. Як было ўстаноўлена ў далейшым Эрлам Стадманам, экстракт кішачнай палачкі «засцерагае» фермент трансацэтылазу. Гэты фермент каталізуе перанос ацэтыльнай групы ад ацэтылфасфата да коэнзіму а, утвараючы ацэтыл CoA + PO4. Экстракт свінога сэрца засцерагае фермент, што кандэнсуецца. Яны ачысцілі фермент, што кандэнсуецца, да гамагеннага стану і Ачоа, дадаючы некалькі кропель сульфату амонія, крышталізаваў яго(With J.R. Stern & M.C. Schneider) Enzymatic synthesis of citric acid. II. Crystalline
condensing enzyme. J. Biol. Chem. 193, 691—702. Ён быў вельмі ганарлівы і сфатаграфаваў крышталі. Пазней, у сумесным з Феадорам Ліненам даследаванні, ён паказаў, што фермент, які кандэнсуецца, каталізуе зварачальную рэакцыю пераходу ацэтыл CoA і оксалпацетата ў CoA + цытрат(With J.R. Stern & E Lynen,) Enzymatic synthesis of citric acid. V. Reaction of acetyl
coenzyme A. J. Biol. Chem. 198, 313—321 (1952). Ачоа быў, сапраўды, вельмі зацікаўлены ў першых стадыях акіслення пірувата. У той жа час, Ірвін Гансалус праводзіць некаторы час, працуючы па гранту, і, сумесна з Сеймурам Коркесам і Эліс дэль Кампільё, вывучае акісленне пірувата ў кішачнай палачцы(With S. Korke & A. del Campillo) Biosynthesis of dicarboxylie acids by carbon dioxide
fixation IV. Isolation and properties of an adaptative malic enzyme from Lactobacillus arabinosus. J. Biol Chem. 187, 891—905. (1950). Усведамляючы важнасць ацэтылу CoA як інтэрмедыяту ў метабалізме, лабараторыя Ачоа занялася даследаваннем важнага пытання аб метабалізме тлушчавых кіслот. CoA-трансфераза была адкрыта Джо Штэрнам і Мінорам КунамStern, J.R., Coon, M.J., del Campillo, A. & Schneider, M.C. 1956 Enzymes of fatty ecid metabolism. IV. Preparation and properties of coenzyme a transferase. J. Biol. Chem. 221, 15-31. Джо Штэрн таксама ідэнтыфікаваў фермент кротаназу, які крышталізавала Эліс дэль Кампільё. Кротаназа каталізуе дэгідратацыі β-гідроксібутырыл CoA з утварэннем кротаніла CoA. Кротаніл CoA ў далейшым ператвараецца ў бутырыл CoA. Гэты фермент цесна звязаны з злучэннем, якія атрымліваюцца акісленнем няцотных тлушчавых кіслот і некаторых амінакіслот.

Было таксама некалькі паведамленняў аб тым, што акісленне прапіаната ўключае ў сябе фіксацыю CO2 і вядзе да ўтварэння сукціната. Севера Ачоа просіць Марціна Флавіна, які далучыўся да групы, даследаваць гэты працэс. Флавін, выкарыстоўваючы экстракт свінога сэрца, выявіў, што дадзены экстракт пераводзіць прапіанат ў дыкарбонавую кіслату, але кіслата гэтая не сукцынавая, а мецылмаланат(With M. Flavin) Metabolism of propionic acid in animal tissues. I. Enzymatic conversion of propionate to succinate. J. Biol. Chem. 229, 965—979 (1957)(With M. Flavin & H. Castro-Mendoza) Metabolism of propionic acid in animal tissues.
II. Propionyl coenzyme A carboxylation system. J. Biol. Chem. 229, 981—996. Праца М. Флавіна, Ё. Казіра, Э. Леонэ, П. Лянгіэла, Р. Мацундэра і іншых паказвае, што прапіанат спярша пераходзіць у прапіаніл CoA карбоксілазу — фермент, які змяшчае біяцін; затым мецілмаланіл CoA ізамерызуецца да A і B-формаў. B-форма дае сукцыніл CoA з мецілмаланілмутазы(With Y. Kaziro & E. Leone) Biotin and propionyl carboxylase. Proc. Natn. Acad. Sci.
U.S.A. 46, 1319—1327. (1960); мутаза — фермент В12. Прапіаніл CoA карбоксілаза, выкрышталізаваная Казіра, карбаксілуецца і пераносіць карбаксільную групу прапіанілу CoA.

Цікавы фермент цыкла трыкарбонавых кіслот, адкрыты Каўфманам ў шпінаце, каталізуе сінтэз ATF з ADF, Pi і сукцыніла CoA. Сукцыніл CoA быў затым дэацэтыляваны ў сукцынат і CoA(With S. Kaufman, C. Gilvarg & O. Cori) Enzymatic oxidation of a-ketoglutarate and
couple phosphorylation. J. Biol. Chem. 203, 869—888. (1953)Kaufman, S. Studies on the mechanism of the reaction catalyzed by the phosphorylating enzyme. J. Biol. Chem. 216, 153—164. (1955). Фермент быў пазначаны як фермент, які фасфаралюе, або P-фермент, а затым сукцыніктыакеназа. P-фермент удзельнічае ў субстранам фасфараляванні, наступным за дэкарбаксіліраваннем кетаглютарата ў цыкле Крэбса. Гэты фермент пераканаў Ачоа вярнуцца да вывучэння акісляльнага фасфаралявання.

 Полінуклеатыдфосфарылаза 
У 1955 годзе ён разам з аспіранткай Мар’янай Грунберг-Манага (ураджэнкай Расіі, пасля вядомы біяхімік, якая працавала ў Францыі) вылучыў з мікраарганізма Azotobacter vinelandi новы фермент, які каталізаваў сінтэз in vitro падобнай з РНК малекулы, якая складаецца з 4, 3, 2 і нават аднаго азоцістай асновы. Ферменту была дадзена назва «полінуклеатыдфосфарылаза». Дбайныя эксперыменты паказалі, што сінтэтычны полірыбануклеатыд нагадвае сабой натуральную РНК па памеры. Яго малекулярная маса вар’іравала ад 30000 да 1-2 х 106 Да. Былі падобныя і канстанты седыментацыі. Для правядзення надзейнай рэакцыі сінтэзу РНК патрабаваўся высокаачышчаны фермент, для чаго выкарыстоўвалі храматаграфію. Акрамя таго, для ініцыяцыі сінтэзу неабходна было даданне ў раствор невялікай колькасці олігамера — тады адбываецца нарошчванне палімернага ланцужка. Пры апрацоўцы сінтэзаванага РНК-падобнага палімера панкрэатычнай рыбануклеазай атрымліваецца сумесь олігануклеатыдаў такая ж, як і пры расшчапленні натуральнай РНК у падобных умовах. У вопытах з гідролізам сінтэзаванага палімера з дапамогай фосфадыэстэразы, выдзеленай з змяінага яду і тканіны селязёнкі, было паказана, што атрыманая эксперыментальна РНК уяўляе сабой лінейны ланцужок, нуклеазідныя адзінкі якой звязаны 3,5’-фосфадыэфірнымі масткамі. Праз два гады Артур Корнберг вылучыў з кішачнай палачкі фермент ДНК-полімеразу і з яго дапамогай ажыццявіў сінтэз ДНК. У 1959 годзе абодвум навукоўцам была ўручана Нобелеўская прэмія(With I.A. Rose, M. Grunberg-Manago & S.R. Korey) Enzymatic phosphorylation of
acetate. J. Biol. Chem. 211, 737—756. (1954)(With M. Grunberg-Manago) Enzymatic synthesis and breakdown of polynucleotides;
polynucleotide phosphorylase. J. Am. Chem. Soc. 77, 3165-3166. (1955)(With M. Grunberg-Manago & P.J. Ortiz) Enzymatic synthesis of polynucleotides. I.
Polynucleotide phosphorylase of Azotobacter vinalandii. Biochim. Biophys. Acta 20, 269—285. (1956)Nobel Lectures 1959. Stockholm, pp. 146—164..

 Генетычны код 
Пасля адкрыцця полінуклеатыдфосфарылазы, у лабараторыі Севера Ачоа займаліся, галоўным чынам, двума рэчамі: акісленнем прапіаната, якое вывучалася дактарамі, якія прыйшлі пасля сыходу Марціна Флавіна, і, уласна, самой полінуклеатыдфосфарылазой. Ачоа працаваў з новым навукоўцам з Японіі — Санаі Мі — над рэакцыяй сінтэзу, спадзяючыся, што з далейшым ачышчэннем фермента высвятляцца праймер або матрычныя абмежаванні. На самай справе, гэта быў адзіны выпадак, калі фермент, які протэалізуецца, меў патрэбу ў праймер для сінтэзу палімера. Нягледзячы на тое, што ў далейшым гэтыя даследаванні не апынуліся карыснымі ў вызначэнні ролі фермента in vivo, яны прынеслі надзвычай вялікую карысць у сінтэзе многіх палімераў. Такім чынам, лабараторыя Ачоа была гатовая да эксперыментаў in vitro над генетычным кодам.

Агульнае ўяўленне аб мРНК было сфармулявана ў 1960-я, і ў 1961 годзе Нірэнбергам і Матаі, на Міжнародным кангрэсе па біяхіміі ў Маскве, паведамілі, што экстракт кішачнай палачкі пераносіць поліурыдзілат (poly U) у поліфенілаланін. Гэта была самая бунтоўная навіна на кангрэсе, пасля якой стала ясна, што адкрываецца вялікае поле для эксперыментаў у вывучэнні генетычнага кода. Паміж лабараторыямі Ачоа і Нірэнберга ў наступныя месяцы пачалася гонка па вывучэнні эфекту, які аказваецца рознымі супалімерамі на злучэнне амінакіслот. Вылічаючы статыстычную пабудова трыплетаў у гетэрапалімерах, было магчыма вызначыў іх суадносіны для большасці амінакіслот(With P. Lengyel & J.F. Speyer) Synthetic polynucleotides and the amino-acid code.Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 47, 1936—1942.Lengyel, P. 1962 The use of synthetic polynucleotides in the deciphering of the genetic code. Ph.D thesis. New York University. J. Biol Chem. 216, 153—164.. У працу былі ўцягнутыя Пітэр Ленгіэл, Джо Спэер, Вэндзі Стэнлі і Альберт Вабха, але Ачоа асабіста праводзіў гэты праект, і тэхнічныя рэсурсы факультэта былі цалкам кінутыя на сінтэз як мага большай колькасці злучэнняў, у якіх мела патрэбу праца па дэкадаванні.

Такім чынам, каб ідэнтыфікаваць трыплет, які кадуе кожную з 20 амінакіслот, не спатрэбілася шмат часу, як і на тое, каб паказаць, што код быў звернутым ў шматлікіх выпадках, некаторыя трыплеты кадуюць аднолькавыя амінакіслоты. Паслядоўнасць трыплетаў, якая вызначае амінакіслоты, была вызначана Філіпам Ледэрам і Маршалам Нірэнбергам пасля адкрыцця таго факту, што паслядоўнасці трыплетаў спецыфічных асноў спрыялі звязанню асаблівых амінааціл-тРНК з рыбасомай. Пра гэта было абвешчана на Міжнародным кангрэсе па біяхіміі ў Нью-Ёрку ў 1964 годзе. Хімічным вылучэннем адпаведнай мРНК код для амінакіслот прыгожа пацвердзіў Гобін Хорана, выкарыстоўваючы сінтэз олігаксірыбануклеатыдаў і транскрыпцыю з выкарыстаннем РНК-полімеразы. Канцавыя трыплеты былі знойдзены ў ходзе арыгінальных генетычных эксперыментаў Сідні Брэнера ў Кембрыджы і Гарэна ў Елі. Маркер з Кэмбрыджа адкрыў, што AUG-кадон, распачынае ланцуг. Выкарыстоўваючы полінуклеатыды, пачынаючы з AUG або дргого кадона, прыгатаваныя з дапамогай полінуклеатыдфосфарылазы, лабараторыя Севера Ачоа вызначыла, што кірунак чытання — ад 5’да 3’(With M. Salas, M.A Smith, W.M. Stanley Jr & A.J. Wahba) Direction of reading of the
genetic message. J. Biol Chem. 240, 3988-3995. (1965)(With M.A. Smith, M. Salas, W.M. Stanley Jr & A.J. Whaba) Direction of reading of the genetic message. Proc. Natn. Acad.Sci. U.S.A. 55, 141—147. Ён таксама in vitro вызначыў, што UAA — адзін з канцавых кадонаў(With J.A. Last, W.M. Stanley Jr., M. Salas, M.B. Hille & A.J. Wahba) Translation of
the genetic message, IV UAA as a chain termination codon. Proc. Natn. Acad. Sci U.S.A. 57, 1062—1067.

 Ініцыявальныя гены сінтэзу бялку 
Адразу тры групы — Маргарыта Салас і Стэнлі ў Ачоа, Айзенштад і Браверман і Рэвель з Гросам выявілі, што прыродная мРНК, як MS2 і QB бактэрыяфагаў пераносіцца неабчышчанымі рыбасомамі кішачнай палачкі, а рыбасомы, прамытымі з 0,5 або 1 м сульфатам амонія, не пераносіцца. Аднак адмытыя рыбасомы лёгка пераносяць polyA або polyU, але не палімеры, якія пачынаюцца з AUG, якія паводзяць сябе як прыродныя мРНК. Было адкрыта, што сульфат амонія вымывае змешчаны там бялковы ген, названы «геном ініцыяцыі», патрэбны для пераносу прыроднай мРНК або полінуклеатыдаў, якія пачынаюцца з AUG(With W.M. Stanley Jr, M. Salas & A.J. Wahba) Tranlation of the generic message :
Factors involved in the initiation of protein synthesis. Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 56, 290—295. (1966)(With M. Salas, M.B. Hille, J.A. Last & A.J. Wahba) Translation of the genetic code
message. II. Effect fo initiation factors on the binding of formyl-methionyl-tRNA to ribosomes.Proc. Natn. Acad.Sci U.S.A. 57, 387—394. (1967). Першыя два гена, а пазней і трэці, былі вылучаныя і цяпер называюцца IF1, IF2 і IF3(With K. Iawasaki, S. Sabo & A.J. Wahba) Translation of the genetic message. VII. Role
of initiation factors in formation of the chain initiations complex with Escherichia coli ribosomes. Archs Biochem. Biophys. 125, 542—547. (1968). У той жа час Кларкам і Маркерам было паказана, што поліпептыдныя ланцугі бактэрый пачынаюцца са спецыфічнага метыл-тРНКfMet, які эстэрыфікуе метыанін, які, у сваю чаргу, выпрацоўваецца і выяўляецца ў поліпептыдным ланцугу ў канцавой аміннай пазіцыі. Метыл-тРНКfMet кадуецца AUG, і пралангатар метыл-тРНКfMet не можа быць выпрацаваны спецыфічнай фармілазай. З нагоды разумення ролі IF1 і IF3 і паслядоўнасці падзей, якія вядуць да ініцыяцыі ўтварэння комплексу ў кішачнай палачцы, вяліся спрэчкі і дэбаты, нават у групе Ачоа. Цяпер гэта ясна дзякуючы даследаванням шматлікіх вучоных.

У пачатку 1970-га года Ачоа пераключаецца на вывучэнне ініцыяцыі трансляцыі ў эукарыётах(With M. Zasloff) Polypeptide chain initiation in Eukaryotes. IV. Purification and
properties of supernatant initiation factor from Artemia salina embryos. J. Mol. Biol. 73, 65-76. (1973). Рычард Світ ў 1968 годзе першым выявіў гены ініцыяцыі ў эукарыётах. Аналагі IF2 былі затым вылучаныя ў некалькіх лабараторыях (Даніэль Левін, Тэа Стаэлін, Наба Гупта). eIF2, як цяпер яго называюць, складаецца з ланцуга з трох поліпептыдаў, і яго функцыі-утвараць трохкампанентны комплекс з GTP і ініцыятара тРНК метыл-тРНК, у якім не выпрацоўваецца метыанін. Але гэтая тРНК, аднак, асобная ад пралангатара метыл-тРНК. У прысутнасці 40S-субадзінак рыбасом патройны комплекс дае пачатак 40S-комплексу. У адзін час з некаторымі іншымі групамі (Лондан, Вурма), Ачоа і дэ Харо выдзелілі бялковы ген, які яны назвалі ESP(With C. de Haro) Further studies on the mode of action of the heme-contolled
translational inhibitor. Proc. Natn. Acad. Sci U.S.A. 76,1741-1745. (1979); у гэтага бялку было мноства назваў, якія залежаць ад групы, якая яго адкрыла, цяпер жа ён называецца EiF2B. Яго спосаб дзеяння быў растлумачаны значна пазней. Ён каталізуе рэакцыю абмену паміж GTP і GDP, вылучаючы GDP і замяняючы яго на GTP. eIF2B быў вылучаны на працягу работ па вывучэнні ролі гема ў глабінаў сінтэзе рэтыкулацытлізатам. Гем перашкаджае фасфараляванню невялікіх субадзінак eIF2α спецыфічнай кіназай(With A. Datta, C. de Haro & J.M. Sierra) Mechanism of translational control by hemin
in reticulotcyte lysates. Proc. Natn. Acad. Sci .U.S.A. 74, 3326-3329. (1977). Калі eif2α фасфараляваны, ён устойліва звязваецца ў патройны комплекс і прадухіляе вылучэнне eIF2B з каталізаванай рэакцыі абмену. Механізм у тым, што eIF2B больш, чым eIF2, таму, каб прадухіліць дзеянне eIF2B, ізалюючы яго, дастаткова толькі частковага фасфаралявання eIF2.

 Рэплікацыя РНК віруса 
Севера Ачоа быў зацікаўлены ў ферменце, адказным за сінтэз РНК ў вірусным геноме РНК, і, калі ў 1961 годзе да яго на факультэт прыйшоў Чарлз Вайсман, ён прапанаваў яму заняцца рэплікацыяй РНК. Спачатку, разам з Джо Кракавым, Вайсман пачаў вывучаць рэплікацыю РНК віруса тытунёвай мазаікі ў лісцях шпінату, але неўзабаве пераключыўся на кішачныя палачкі з заражанымі f2- або MS2-РНКWeismann, C. 1976 In Reflections on biochemistry (ed. A. Kornberg, B.L. Horecker, L. Cornudella & J. Oro), pp. 283—292. New York: Pergamon.. Ачоа заўсёды цікавіўся працай, але сам у ёй удзелу не прымаў. Да Вайсмана ў розны час далучаліся многія навукоўцы, такія, як Марцін Білетэр, Рой Бердан і Пітэр Борст. Паміж групамі Вайсмана, Шпігельмана і Аўгуста праходзіла спаборніцтва. Тлумачэнне механізму сінтэзу віруснай РНК было складанай задачай, бо фермент не быў растваральным. У канчатковым рахунку, выбар віруса Qβ апынуўся найлепшым. Qβ-РНК-полімеразу ачысцілі да гамагеннага стану і даказалі спецыфічныя абмежаванні для матрыцы Qβ-РНК. У 1968 годзе ўсе тры групы сустрэліся і прыйшлі да агульнага заключэння па механізме рэплікацыі РНК. На першай стадыі на плюс-ланцузе матрыцы утворыцца мінус-ланцуг, прамежкавае рэчыва мае адкрытую структуру. Матрыца і прадукт не ўтвараюць падвойную спіраль, але трымаюцца разам пры рэплікацыі. Структура руйнуецца ўнутры двуланцужной структуры толькі пры выманні бялкоў. На другой стадыі рэплікацыі мінус-ланцуг выкарыстоўваецца ў якасці матрыцы для сінтэзу плюс-ланцуга. Гэты комплекс аналагічны першаму, толькі матрыца па ўсёй даўжыні — мінус-ланцуг.

 Апошнія гады 
Улетку 1974 года 69-гадовы Ачоа сышоў на адпачынак з дэканскага крэсла біяхімічнага факультэта. У яго была прапанова далучыцца да Інстытуту малекулярнай біялогіі Рашэ ў Натлі. Ён прыняў яго і да 1985 года працягнуў сваю працу над абменным генам GTP/GDP у эукарыётах і над роляй фасфаралявання ў працэсе ініцыявання ў эукарыётах з Дж. Сікерка. У 1985 годзе яны з Кармэн вярнуліся ў Іспанію, дзе ён працягнуў працаваць ганаровым дырэктарам Цэнтра малекулярнай біялогіі пры мадрыдскім універсітэце. Цэнтр быў заснаваны пад яго кіраваннем і цяпер з’яўляецца адным з вядучых цэнтраў малекулярнай біялогіі. Смерць Кармэн ў 1986 годзе спустошыла яго, і ён так і не аправіўся ад гэтага ўзрушэння, страціўшы сэнс жыцця. Ён памёр праз сем гадоў пасля гэтага, у лістападзе 1993 года ў Мадрыдзе. Пахавалі яго ў Луарку, мястэчку, дзе ён нарадзіўся.

 Узнагароды 

 Нобелеўская прэмія па фізіалогіі і медыцыне (1959)
 Залаты медаль Пола Карэра (1963)
 Нацыянальны навуковы медаль ЗША (1979)

 Спасылкі 

 Інфармацыя на сайце Нобелеўскага камітэта

Катэгорыя:Замежныя члены РАН
Катэгорыя:Замежныя члены АН СССР
Катэгорыя:Замежныя члены Лонданскага каралеўскага таварыства
Катэгорыя:Члены і члены-карэспандэнты Нацыянальнай акадэміі навук ЗША
Катэгорыя:Узнагароджаныя Нацыянальным медалём навукі ЗША
Катэгорыя:Лаўрэаты Нобелеўскай прэміі з Іспаніі
Катэгорыя:Лаўрэаты Нобелеўскай прэміі па медыцыне
Катэгорыя:Біяхімікі ЗША
Катэгорыя:Біёлагі XX стагоддзя
Катэгорыя:Лаўрэаты Нобелеўскай прэміі паводле алфавіта
Катэгорыя:Старонкі з недагледжанымі перакладамі