التضخيم الدوري للبروتين معيب الطي

التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ (PMCA)، هو تقنية تضخيم (تشبه من الناحية المفاهيمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ولكنها لا تتضمن النيوكليوتيدات) لمضاعفة البريونات المطوية بشكلٍ معيب التي طورت في الأصل من قبل الدكتور كلاوديو سوتو وزملاؤهSaborio, G.P., Permanne, B. and Soto, C. (2001) Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature, 411, 810-813.، والتي تعتبر اختباراً لاعتلال الدماغ الإسفنجي مثل مرض الهزال المزمنPatrice N Klein, CWD Program Manager USDA/APHIS. "Chronic Wasting Disease - APHIS Proposed Rule to Align BSE Import Regulations to OIE" (PDF). WHHCC Meeting – 5–6 February 2013. Archived from the original (PDF) on 26 September 2014. أو اعتلال الدماغ الإسفنجي البقري (المسمى العلمي لمرض جنون البقر).

 التقنية 
تقوم التقنية في البداية باحتضان كمية صغيرة من البريون غير الطبيعي مع فائض من البروتين الطبيعي، بحيث يحدث بعض التحويل. يتم بعد ذلك تفجير السلسلة المتنامية من البروتين المطوي بشكلٍ معيب باستخدام الموجات فوق الصوتية، مما يؤدي إلى تقسيمها إلى سلاسل أصغر وبالتالي زيادة كمية البروتين غير الطبيعي المتاح لإحداث تحويلات.Soto, C., Saborio, G.P. and Anderes, L. (2002) Cyclic amplification of protein misfolding: application to prion- related disorders and beyond. Trends Neurosci., 25, 390-394. من خلال تكرار الدورة، يتم تغيير كتلة البروتين الطبيعي بسرعة إلى البريون الذي يُجرى اختباره.

 التطوير 
تم تطوير التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ في الأصل في المختبر، لتقليد عملية تكرار البريون بكفاءة مماثلة للعملية في الجسم الحي، ولكن مع حركية مسرّعة. يشبه التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ من الناحية المفاهيمية تفاعل البوليميراز المتسلسل، في كلا النظامين ينمو القالب على حساب الركيزة في تفاعل دوري، بحيث يجمع بين النمو والتكاثر لوحدات القالب.

 التكرار 
تم استعمال التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ لتكرار البروتين المطوي بشكلٍ معيب المتواجد في حيوانات مختلفة.Soto, C., Anderes, L., Suardi, S., Cardone, F., Castilla, J., Frossard, M.J., Peano, S., Saá, P., Limido, L., Carbonatto, M., Ironside, J., Torres, J.M., Pocchiari, M. and Tagliavini, F. (2005) Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding. FEBS Lett., 579, 638-642.Jones, M., Peden, A.H., Prowse, C.V., Groner, A., Manson, J.C., Turner, M.L., Ironside, J.W., MacGregor, I.R. and Head, M.W. (2007) In vitro amplification and detection of variant Creutzfeldt–Jakob disease PrPSc. J.Pathol., 213, 21-26.Kurt, T.D., Perrott, M.R., Wilusz, C.J., Wilusz, J., Supattapone, S., Telling, G.C., Zabel, M.D. and Hoover, E.A. (2007) Efficient in vitro amplification of chronic wasting disease PrPRES. J.Virol., 81, 9605-9608. يُظهر البروتين الذي تم إنشاؤه حديثًا نفس الخصائص الكيميائية الحيوية والبيولوجية والهيكلية مثل البروتين البريونيّ الراعوشي المشتق من الدماغ، ومن اللافت للنظر أنه معدي للحيوانات البرية، والذي ينتج مرض له خصائص مماثلة للمرض الناتج عن البريونات المعزولة في الدماغ.Castilla, J., Saá, P., Hetz, C. and Soto, C. (2005) In vitro generation of infectious scrapie prions. Cell, 121, 195-206.

 التشغيل الآلي 
لقد أدى القيام بالتقنية بشكلٍ الي إلى زيادة كبيرة في كفاءة التضخيم، والان، ينتج عن الدورة الواحدة 2500 طية وزيادة حساسية الكشف أكثر من تقنية اللطخة المناعيةSaa, P., Castilla, J. and Soto, C. (2006) Ultra-efficient replication of infectious prions by automated protein misfolding cyclic amplification. J.Biol.Chem., 281, 35245-35252.، بينما ينتج عن دورتين وسبع دورات متتالية ستة ملايين و3 مليارات طية وزيادة حساسية الكشف أكثر من تقنية اللطخة المناعية، وتقنية اللطخة المناعية هي تقنية تستخدم على نطاق واسع في مراقبة مرض اعتلال الدماغ الإسفنجي البقري (المسمى العلمي لمرض جنون البقر) في عدة دول.

 الحساسية 
لقد ثبت أن التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ قادر على اكتشاف أقل من مركب واحد من البروتين البريونيّ الراعوشي المعدي قليل الوحدات. يمتلك التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ القدرة على توليد ملايين الوحدات المعدية، بدءاً مما يعادل واحداً من البروتين البريونيّ الراعوشي قليل الوحدات؛ أقل بكثير من عتبة العدوى. توضح هذه البيانات أن التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ لديه قوة تضخيم مماثلة لتقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة لتضخيم الحمض النووي. وتفتح هذه التقنية الأبواب لتطوير جهاز كاشف حساس للغاية لبروتين البريونيّ الراعوشي، وفهم الأساس الجزيئي لتكرار البريون. حيث بالفعل قد تم استخدام التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ من قبل مجموعات مختلفة لكشف البروتين البريونيّ الراعوشي في دم الحيوانات المصابة تجريبياً بالبريونات أثناء كل من مرحلتي الأعراضCastilla, J., Saa, P. and Soto, C. (2005) Detection of prions in blood. Nat.Med., 11, 982-985. وقبل الأعراضSaa, P., Castilla, J. and Soto, C. (2006) Presymptomatic detection of prions in blood. Science, 313, 92-94. وكذلك وجدت في بولGonzalez-Romero, D., Barria, M.A., Leon, P., Morales, R. and Soto, C. (2008) Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett., 582, 3161-3166. هذه الحيوانات أيضاً.

 الاستعمالات 
تم استخدام تقنية التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ من قبل عدة مجموعات لفهم الآلية الجزيئية لتكاثر البريون، وطبيعة العامل المعدي، وظاهرة سلالات البريون والأمراض حيوانية المصدر، وتأثير المكونات الخلوية، لاكتشاف البروتين البريونيّ الراعوشي في الأنسجة والسوائل البيولوجية وفحص للمثبطات ضد تكرار البريون.Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De, C.J. and Soto, C. (2008) Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell, 134, 757-768.Barria, M.A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R. and Soto, C. (2009) De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS.Pathog., 5, e1000421.Deleault, N.R., Lucassen, R.W. and Supattapone, S. (2003) RNA molecules stimulate prion protein conversion. Nature, 425, 717-720.Bieschke, J., Weber, P., Sarafoff, N., Beekes, M., Giese, A. and Kretzschmar, H. (2004) Autocatalytic self-propagation of misfolded prion protein. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101, 12207-12211.Piening, N., Weber, P., Giese, A. and Kretzschmar, H. (2005) Breakage of PrP aggregates is essential for efficient autocatalytic propagation of misfolded prion protein. Biochem.Biophys.Res.Commun., 326, 339-343.Kim, N.H., Choi, J.K., Jeong, B.H., Kim, J.I., Kwon, M.S., Carp, R.I. and Kim, Y.S. (2005) Effect of transition metals (Mn, Cu, Fe) and deoxycholic acid (DA) on the conversion of PrPC to PrPres. FASEB J. 19, 783-785.17. Haley, N.J., Seelig, D.M., Zabel, M.D., Telling, G.C. and Hoover, E.A. (2009) Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS.ONE., 4, e4848.Shi, S., Dong, C.F., Wang, G.R., Wang, X., An, R., Chen, J.M., Shan, B., Zhang, B.Y., Xu, K., Shi, Q., Tian, C., Gao, C., Han, J. and Dong, X.P. (2009) PrP(Sc) of scrapie 263K propagates efficiently in spleen and muscle tissues with protein misfolding cyclic amplification. Virus Res., 141, 26-33.Atarashi, R., Moore, R.A., Sim, V.L., Hughson, A.G., Dorward, D.W., Onwubiko, H.A., Priola, S.A. and Caughey, B. (2007) Ultrasensitive detection of scrapie prion protein using seeded conversion of recombinant prion protein. Nat.Methods, 4, 645-650.Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P. and Soto, C. (2008) Cell-free propagation of prion strains. EMBO J., 27, 2557-2566.Green, K.M., Castilla, J., Seward, T.S., Napier, D.L., Jewell, J.E., Soto, C. and Telling, G.C. (2008) Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS.Pathog., 4, e1000139.Morales, R., Buytaert-Hoefen, K.A., Gonzalez-Romero, D., Castilla, J., Hansen, E.T., Hlavinka, D., Goodrich, R.P. and Soto, C. (2008) Reduction of prion infectivity in packed red blood cells. Biochem.Biophys.Res.Commun., 377, 373-378.Orem, N.R., Geoghegan, J.C., Deleault, N.R., Kascsak, R. and Supattapone, S. (2006) Copper (II) ions potently inhibit purified PrPres amplification. J Neurochem 96, 1409-1415.Barret, A., Tagliavini, F., Forloni, G., Bate, C., Salmona, M., Colombo, L., et al. (2003) Evaluation of quinacrine treatment for prion diseases. J Virol 77, 8462-8469.Haley, N.J., Mathiason, C.K., Zabel, M.D., Telling, G.C. and Hoover, E.A. (2009) Detection of sub-clinical CWD infection in conventional test-negative deer long after oral exposure to urine and feces from CWD+ deer. PLoS ONE 4, e7990.Jones, M., Peden, A.H., Yull, H., Wight, D., Bishop, M.T., Prowse, C.V., et al. (2009) Human platelets as a substrate source for the in vitro amplification of the abnormal prion protein (PrP) associated with variant Creutzfeldt–Jakob disease. Transfusion 49, 376-384.Kim, J.I., Surewicz, K., Gambetti, P. and Surewicz, W.K. (2009) The role of glycophosphatidylinositol anchor in the amplification of the scrapie isoform of prion protein in vitro. FEBS Lett 583, 3671-3675.Kurt, T.D., Telling, G.C., Zabel, M.D. and Hoover, E.A. (2009) Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology 387, 235-243Murayama, Y., Yoshioka, M., Horii, H., Takata, M., Yokoyama, T., Sudo, T., et al. (2006) Protein misfolding cyclic amplification as a rapid test for assessment of prion inactivation. Biochem Biophys Res Commun 348, 758-762.Shikiya, R.A., Ayers, J.I., Schutt, C.R., Kincaid, A.E. and Bartz, J.C. (2010) Coinfecting prion strains compete for a limiting cellular resource. J Virol 84, 5706-5714.Tattum, M.H., Jones, S., Pal, S., Collinge, J. and Jackson, G.S. (2010) Discrimination between prion-infected and normal blood samples by protein misfolding cyclic amplification. Transfusion 50, 996-1002.Thorne, L. and Terry, L.A. (2008) In vitro amplification of PrPSc derived from the brain and blood of sheep infected with scrapie. J Gen Virol 89, 3177-3184.Meyerett, C., Michel, B., Pulford, B., Spraker, T.R., Nichols, T.A., Johnson, T., et al. (2008) In vitro strain adaptation of CWD prions by serial protein misfolding cyclic amplification. Virology 382, 267-276.Chen, B., Morales, R., Barria, M.A. and Soto, C. (2010) Estimating prion concentration in fluids and tissues by quantitative PMCA. Nat Methods 7, 519-520.
كانت الدراسات الحديثة التي أجرتها مجموعة الدكتور سوراتشي سوباتون ومجموعة الدكتورة جيان ما قادرة على إنتاج تكاثر البريون في المختبر بواسطة التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ باستخدام بروتين البريون الخلوي المنقى وبروتين البريون الخلوي المأشوب مع الإضافة الوحيدة لأنيون متعدد الشحنات السالبة الصناعي والدهون.Deleault, N.R., Harris, B.T., Rees, J.R. and Supattapone, S. (2007) Formation of native prions from minimal components in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 9741-9746.Wang, F., Wang, X., Yuan, C.-G. and Ma, J. (2010) Generating a Prion with Bacterially Expressed Recombinant Prion Protein. Science 327, 1132-1135. أظهرت هذه الدراسات أنه يمكن إنتاج البريونات المعدية في غياب أي مكون خلوي آخر وتشكل بعضًا من أقوى الأدلة لصالح فرضية البريون.
استنتجت الأبحاث في عام 2020 إلى أنه يمكن استخدام التضخيم الدوري للبروتين معيب الطيّ للتمييز بين مرضين من أمراض التنكس العصبي التدريجي، وهما مرض باركنسون والضمور الجهازي المتعدد، كونه أول تقنية توفر تشخيص موضوعي لمرض الضمور الجهازي المتعدد بدلاً من مجرد تشخيص تفريقي."Method Can Distinguish Parkinson's Disease From multiple system atrophy". Diagnostics from Technology Networks. Retrieved 23 February 2020.Shahnawaz, Mohammad; Mukherjee, Abhisek; Pritzkow, Sandra; Mendez, Nicolas; Rabadia, Prakruti; Liu, Xiangan; Hu, Bo; Schmeichel, Ann; Singer, Wolfgang; Wu, Gang; Tsai, Ah-Lim; Shirani, Hamid; Nilsson, K. Peter R.; Low, Phillip A.; Soto, Claudio (5 February 2020). "Discriminating α-synuclein strains in Parkinson's disease and multiple system atrophy". Nature. 578 (7794): 273–277. Bibcode:2020Natur.578..273S. doi:10.1038/s41586-020-1984-7. PMC 7066875. PMID 32025029.

 انظر أيضًا 
 علم الأمراض العصبية
 طب النفس والأعصاب

 المراجع 

تصنيف:بروتينات
تصنيف:بريونات
تصنيف:علم الوظائف العصبية للأعضاء
تصنيف:تقنيات مخبرية
تصنيف:علم الأحياء الجزيئي