Proteïen massaspektrometrie

Proteïensmasspektrometrie verwys na die toepassing van massaspektrometrie op die studie van proteïene. Massaspectrometrie is 'n belangrike metode vir die akkurate massa bepaling en karakterisering van proteïene, en 'n verskeidenheid metodes en instrumente is ontwikkel vir sy baie gebruike. Die toepassings sluit in die identifikasie van proteïene en hul post-translasie modifikasies, die opheldering van proteïenkomplekse, hul subeenhede en funksionele interaksies, sowel as die globale meting van proteïene in proteomika. Dit kan ook gebruik word om proteïene aan die verskillende organelle te lokaliseer, en bepaal die interaksies tussen verskillende proteïene sowel as met membraan lipiede.

Die twee primêre metodes wat gebruik word vir die ionisasie van proteïen in massaspektrometrie is elektrospray-ionisasie (ESI) en matriksassistente laser desorpsie / ionisasie (MALDI). Hierdie ionisasie tegnieke word gebruik in kombinasie met massa ontleders soos tandem massaspektrometrie. In die algemeen word die proteïene geanaliseer, óf in 'n "top-down" benadering waarin proteïene ongeskonde geanaliseer word óf 'n "bottom-up" benadering waarin proteïene eers in fragmente verteer word. 'N Intermediêre "middel-af" -benadering waarin groter peptiedfragmente ontleed word, kan ook soms gebruik word.

 Geskiedenis 
Die toepassing van massaspektrometrie om proteïene te bestudeer, het in die 1980's gewild geword na die ontwikkeling van MALDI en ESI. Hierdie ionisasie tegnieke het 'n belangrike rol gespeel in die karakterisering van proteïene. (MALDI) Matrix-bygestaan laser desorption ionisasie is in die laat 80's deur Franz Hillenkamp en Michael Karas geskep. Hillenkamp, Karas en hul mede-navorsers kon die aminosuuralanien ioniseer deur dit met die aminosuurtriptofaan te meng en bestraal met 'n pols 266 nm laser. Alhoewel belangrik, het die deurbraak nie tot 1987 gekom nie. In 1987 gebruik Koichi Tanaka die "ultra fyn metaal plus vloeibare matriks metode" en geïoniseerde biomolekules die grootte van 34,472 Da proteïenkarboxipeptidase-A.

In 1968 het Malcolm Dole die eerste gebruik van elektrospray-ionisasie met massaspektrometrie aangemeld. Ongeveer dieselfde tyd het MALDI gewild geword, John Bennett Fenn is aangehaal vir die ontwikkeling van elektrospray-ionisasie. Koichi Tanaka het die 2002 Nobelprys vir Chemie saam met John Fenn, en Kurt Wüthrich, ontvang vir die ontwikkeling van metodes vir identifikasie en struktuuranalises van biologiese makromolekules. Hierdie ionisasiemetodes het die studie van proteïene deur massaspektrometrie baie gefasiliteer. Gevolglik speel proteïenmassaspektrometrie nou 'n leidende rol in proteïenkarakterisering.

 Metodes en benaderings 

 Tegnieke 
Massaspectrometrie van proteïene vereis dat die proteïene in oplossing of vaste toestand in 'n geïoniseerde vorm in die gasfase verander word voordat hulle in 'n elektriese of magnetiese veld ingespuit en versnel word vir analise. Die twee primêre metodes vir ionisasie van proteïene is elektrospray-ionisasie (ESI) en matriksassistente laser desorpsie / ionisasie (MALDI). In elektrospray word die ione uit proteïene in oplossing geskep, en dit laat breekbare molekules onvoltooid geïoniseerd word, wat soms nie-kovalente interaksies behou. In MALDI word die proteïene in 'n matriks gewoonlik in 'n vaste vorm ingebed, en ione word geskep deur pulse van laserlig. Elektrospray produseer meer vermenigvuldigde ione as MALDI, wat toelaat om met hoë massa proteïen te meet en beter fragmentering vir identifikasie te verkry, terwyl MALDI vinnig en minder geneig is om deur besoedeling, buffers en bymiddels geraak te word.

Die hele proteïenmassa-analise word hoofsaaklik uitgevoer deur gebruik te maak van die TOF-MS, of Fourier-transform-ioon-siklotronresonansie (FT-ICR). Hierdie twee tipes instrumente is verkieslik hier as gevolg van hul wye massa reeks, en in die geval van FT-ICR, is die hoë massa akkuraatheid. Elektrospray-ionisasie van 'n proteïen lei dikwels tot die opwekking van meervoudige gelaaide spesies van 800

Massa-analise van proteolitiese peptiede is 'n gewilde metode van proteïenkarakterisering, aangesien goedkoper instrumentontwerpe vir karakterisering gebruik kan word. Daarbenewens is monstervoorbereiding makliker sodra heel proteïene verteer is in kleiner peptiedfragmente. Die mees gebruikte instrument vir peptiedmassa-analise is die MALDI-TOF-instrumente aangesien hulle die verkryging van peptiedmassa-vingerafdrukke (PMF's) teen 'n hoë tempo toelaat (1 PMF kan in ongeveer 10 sekondes ontleed word). Veelvuldige stadium vierhoekige tyd-van-vlug en die vierhoekige ioonval kan ook in hierdie aansoek gebruik word.
regs|duimnael|300x300px|Chromatografie spoor en MS/MS spektra van 'n peptied.
Tandem-massaspektrometrie (MS / MS) word gebruik om fragmenteringsspektra te meet en proteïene teen hoë spoed en akkuraatheid te identifiseer. Botsings-geïnduseerde dissosiasie word in hoofstroomtoepassings gebruik om 'n stel fragmente van 'n spesifieke peptiedioon te genereer. Die fragmenteringsproses gee hoofsaaklik splytingsprodukte wat breek langs peptiedbindings. As gevolg van hierdie eenvoud in fragmentering, is dit moontlik om die waargenome fragmentmassa's te gebruik om ooreen te kom met 'n databasis van voorspelde massas vir een van baie gegewe peptiedvolgorde. Tandem MS van hele proteïenione is onlangs ondersoek met behulp van elektronavangassendissosiasie en het in die algemeen uitgebreide volgorde-inligting getoon, maar is nie in die algemene praktyk nie.

 Benaderinge 
In ooreenstemming met die prestasie en massa reeks beskikbare massaspektrometers word twee benaderings gebruik om proteïene te karakteriseer. In die eerste word ongeskonde proteïene geïoniseerd deur een van die twee tegnieke wat hierbo beskryf word, en dan na 'n massa-analiseerder ingevoer. Hierdie benadering word verwys na as 'top-down' strategie van proteïenanalise, aangesien dit behels dat die hele massa begin en dan uitmekaar getrek word. Die top-down-benadering is egter meestal beperk tot enkel-proteïenstudies met lae deurvoer weens probleme wat verband hou met die hantering van hele proteïene, hul heterogeniteit en die kompleksiteit van hul ontledings.

In die tweede benadering, waarna verwys word as die "bottom-up" MS, word proteïene enzymaties verteer in kleiner peptiede deur 'n protease soos trypsien te gebruik. Vervolgens word hierdie peptiede in die massaspektrometer ingevoer en geïdentifiseer deur peptiedmassa-vingerafdrukke of tandem-massaspektrometrie. Daarom gebruik hierdie benadering identifikasie op die peptiedvlak om die bestaan van proteïene af te lei tesame met de novo herhaaldeteksie. Die kleiner en meer eenvormige fragmente is makliker om te analiseer as ongeskonde proteïene en kan ook met hoë akkuraatheid bepaal word. Hierdie "bottom-up" benadering is dus die voorkeurmetode van studie in proteomika. 'N Verdere benadering wat nuttig is, is die intermediêre "middel-af" -benadering waarin proteolitiese peptiede groter as die tipiese tryptiese peptiede ontleed word.

 Proteïen en peptied fraksionering 
regs|duimnael|Massa spektrometrie protokol
Proteïene van belang is gewoonlik deel van 'n komplekse mengsel van veelvoudige proteïene en molekules, wat bestaan in die biologiese medium. Dit bied twee belangrike probleme. Eerstens, die twee ionisasie tegnieke wat vir groot molekules gebruik word, werk net goed wanneer die mengsel omtrent gelyke hoeveelhede bestanddele bevat. In biologiese monsters is verskillende proteïene geneig om teenwoordig te wees in wyd verskillende hoeveelhede. As so 'n mengsel geïoniseerd word met behulp van elektrospray of MALDI, het die meer oorvloedige spesies 'n neiging om te "verdrink" of onderdruk seine van minder oorvloedige mense. Tweedens, massa spektrum uit 'n komplekse mengsel is baie moeilik om te interpreteer as gevolg van die oorweldigende aantal mengsel komponente. Dit word vererger deur die feit dat ensimatiese vertering van 'n proteïen aanleiding gee tot 'n groot aantal peptiedprodukte.

In die lig van hierdie probleme word die metodes van een- en tweedimensionele gelelektroforese en hoëprestasie-vloeistofchromatografie wyd gebruik vir die skeiding van proteïene. Die eerste metode fraseer hele proteïene via tweedimensionele gelelektroforese. Die eerste dimensie van 2D gel is isoektriese fokus (IEF). In hierdie dimensie word die proteïen geskei deur sy isoelektriese punt (pI) en die tweede dimensie is SDS-polyakrylamied-gelelektroforese (SDS-PAGE). Hierdie dimensie skei die proteïen volgens sy molekulêre gewig. Sodra hierdie stap voltooi is, word vertering plaasvind. In sommige situasies kan dit nodig wees om albei hierdie tegnieke te kombineer. Gel kolle wat op 'n 2D Gel geïdentifiseer word, word gewoonlik aan een proteïen toegeskryf. As die identiteit van die proteïen verlang word, word gewoonlik die metode van in-gel vertering toegepas, waar die proteïenpunt van belang uitgesny word, en proteolities verteer. Die peptiedmassa's wat uit die vertering voortspruit, kan bepaal word deur massaspektrometrie deur die gebruik van peptiedmassa-vingerafdrukke. As hierdie inligting nie ondubbelsinnige identifikasie van die proteïen toelaat nie, kan die peptiede onderhewig wees aan tandem-massaspektrometrie vir de novo-volgordebepaling. Klein veranderinge in massa en lading kan opgespoor word met 2D-PAGE. Die nadele van hierdie tegniek is sy klein dinamiese omvang in vergelyking met ander metodes. Sommige proteïene is steeds moeilik om te skei weens hul suurheid, basisiteit, hydrofobiciteit en grootte (te groot of te klein).

Die tweede metode, hoëprestasie vloeistofchromatografie word gebruik om peptiede af te breek na ensiematiese vertering. Karakterisering van proteïenmengsels met behulp van HPLC / MS word ook genoem haelgeweer proteomics en MuDPIT (Multi-Dimensional Protein Identification Technology). 'N Peptiedmengsel wat voortspruit uit die vertering van 'n proteïenmengsel word gefractioneer deur een of twee stappe vloeibare chromatografie. Die eluens uit die chromatografie stadium kan óf direk by die massaspektrometer ingedien word deur elektrospray-ionisasie, of op 'n reeks klein kolle vir latere massa-analise gebruik word met MALDI.

 Aansoeke 

 Proteïen identifikasie 
Daar is twee hoof maniere. MS word gebruik om proteïene te identifiseer. Peptiedmassa-vingerafdrukke gebruik die massas proteolitiese peptiede as insette vir 'n soektog van 'n databasis van voorspelde massas wat voortspruit uit vertering van 'n lys bekende proteïene. As 'n proteïenvolgorde in die verwysingslys aanleiding gee tot 'n beduidende aantal voorspelde massas wat ooreenstem met die eksperimentele waardes, is daar bewyse dat hierdie proteïen teenwoordig was in die oorspronklike monster. Suiweringstappe beperk dus die deurvoer van die peptiedmassa-vingerafdrukbenadering. Peptiedmassa-vingerafdrukke kan met MS / MS bereik word.

MS is ook die voorkeurmetode vir die identifisering van post-translasie-veranderinge in proteïene, aangesien dit meer voordelig is as ander benaderings soos die teenliggaampies gebaseerde metodes.

 De novo (peptied) volgordebepaling 
De novo-peptiedvolgorde vir massaspektrometrie word tipies uitgevoer sonder voorafgaande kennis van die aminosuurvolgorde. Dit is die proses om aminosure van peptiedfragmentmassa's van 'n proteïen toe te ken. De novo sequencing het bewys suksesvol vir die bevestiging en uitbreiding van die resultate van databasis soektogte.

Soos de novo-volgordebepaling gebaseer is op massa en sommige aminosure het identiese massas (bv. Leucien en isoleusien), kan akkurate manuele volgordebepaling moeilik wees. Daarom kan dit nodig wees om 'n sekwensie-homologie-soektogtoepassing te gebruik om in tandem te werk tussen 'n databasis soek en de novo sequencing om hierdie inherente beperking aan te spreek.

Databasis soek het die voordeel om vinnig sekwense te identifiseer, mits hulle reeds in 'n databasis gedokumenteer is. Ander inherente beperkings van databasis soek sluit in volgorde veranderinge / mutasies (sommige databasis soektogte gee nie voldoende rekening vir veranderinge aan die 'gedokumenteerde' volgorde, dus kan waardevolle inligting misloop), die onbekende (as 'n ry nie gedokumenteer word nie, sal dit nie gevind word nie ), Vals positiewe, en onvolledige en beskadigde data.

'N Geannoteerde peptied spektrale biblioteek kan ook gebruik word as 'n verwysing vir proteïen / peptied identifikasie. Dit bied die unieke krag van verminderde soekruimte en verhoogde spesifisiteit. Die beperkings sluit in dat spektra wat nie in die biblioteek ingesluit is nie, nie geïdentifiseer kan word nie. Spektra wat uit verskillende soorte massaspectrometers ingesamel word, kan redelik verskillende eienskappe hê, en verwysingspektra in die biblioteek kan geraaspieke bevat wat tot vals positiewe identifikasies kan lei. 'N Aantal verskillende algoritmiese benaderings is beskryf om peptiede en proteïene uit tandemmasspektrometrie (MS / MS), peptied de novo-volgordebepaling en volgorde-taggebaseerde soek te identifiseer.

 Proteïen kwantitasie 
regs|duimnael|317x317px|Kwantitatiewe Massa Spektrometrie.
Verskeie onlangse metodes maak voorsiening vir die kwantitasie van proteïene deur massaspektrometrie (kwantitatiewe proteomika). Tipies word stabiele (bv. Nie-radioaktiewe) swaarder isotope van koolstof (13C) of stikstof (15N) in een monster geïnkorporeer, terwyl die ander een met die ooreenstemmende ligisotope (bv. 12C en 14N) gemerk is. Die twee monsters word voor die ontleding gemeng. Peptiede wat uit die verskillende monsters verkry word, kan onderskei word as gevolg van hul massaverskil. Die verhouding van hul piekintensiteite stem ooreen met die relatiewe oorvloed verhouding van die peptiede (en proteïene). Die gewildste metodes vir isotoop-etikettering is SILAC (stabiele isotoop-etikettering deur aminosure in selkultuur), trypsine-gekataliseerde 18O-etikettering, ICAT (isotoop-gekodeerde affiniteits-tagging), iTRAQ (isobariese etikette vir relatiewe en absolute kwantitasie). "Semi-kwantitatiewe" massaspektrometrie kan sonder monsterneming van monsters uitgevoer word. Tipies, dit word gedoen met MALDI analise (in lineêre modus). Die piekintensiteit, of die piekarea, van individuele molekules (tipies proteïene) word hier gekorreleer met die hoeveelheid proteïene in die monster. Die individuele sein hang egter af van die primêre struktuur van die proteïen, op die kompleksiteit van die monster en op die instellings van die instrument. Ander tipes "etiketvrye" kwantitatiewe massaspektrometrie gebruik die spektrale tellings (of peptiedgetalle) van verteerde proteïene as 'n middel om relatiewe proteïen hoeveelhede te bepaal.

 Proteïen-struktuur bepaling 
Kenmerke wat die 3-dimensionele struktuur van proteïene aandui, kan op verskeie maniere met massaspektrometrie ondersoek word. Deur chemiese kruisbinding te gebruik om dele van die proteïen wat in die ruimte naby is, maar ver uitmekaar in volgorde te koppel, kan inligting oor die algehele struktuur afgelei word. Deur die uitruil van amide protone met deuterium uit die oplosmiddel te volg, is dit moontlik om die oplosmiddel toeganklikheid van verskillende dele van die proteïen te ondersoek. Waterstof-deuterium-uitruilmasspektrometrie is al meer as 20 jaar gebruik om proteïene en hul konformasies te bestudeer. Hierdie tipe proteïen strukturele analise kan geskik wees vir proteïene wat uitdagend is vir ander strukturele metodes. Nog 'n interessante laan in proteïenstruktuurstudies is laser-geïnduseerde kovalente etikettering. In hierdie tegniek word oplosmiddel-blootgestelde terreine van die proteïen gewysig deur hidroksielradikale. Die kombinasie met vinnige vermenging is gebruik in proteïenvoustudies

 Biomerkers 
Die FDA definieer 'n biomerker soos: 'n Eienskap wat objektief gemeet en geëvalueer word as 'n aanduiding van normale biologiese prosesse, patogene prosesse, of farmakologiese reaksies op 'n terapeutiese intervensie'. Daar word vermoed dat massaspektrometrie die ontdekking van kandidate vir biomarkers moontlik maak.

 Proteogenomics 
In wat nou algemeen bekend staan as proteogenomika, word peptiede wat met massaspektrometrie geïdentifiseer word, gebruik om geenannotasies te verbeter (byvoorbeeld geen begin sites) en proteïen annotasies. Parallelle analise van die genoom en die proteoom fasiliteer die ontdekking van post-translasie modifikasies en proteolitiese gebeure, veral wanneer veelvuldige spesies vergelyk word.

 Verwysings 

Kategorie:Proteïene