Ditiotreitol

1,4-ditiotreitol (DTT) je bežný názov pre nízkomolekulové redukčné činidlo známe i ako Clelandovo činidlo, pomenované podľa W. Wallacea Clelanda. Vzorec DTT je  a vyskytuje sa v podobe dvoch enantiomérov. V oxidovanej podobe tvorí šesťčlenný kruh s disulfidickým mostíkom (pozri nižšie). Toto činidlo sa často používa ako racemát, keďže oba enantioméry sú aktívne. Jeho názov pochádza z názvu príbuzného sacharidu, treózy, a jeho redukovanej formy, treitolu. Epimérom DTT je ditioerytritol (DTE).

Vlastnosti 
DTT je nestabilný za bežných atmosférických podmienok a oxiduje sa pôsobením kyslíka. Preto by mal byť skladovaný a malo by sa s ním narábať v inertnej atmosfére, aby sa predišlo oxidácii. Použiteľnosť pripraveného ditiotreitolu možno predĺžiť uchovaním pri 2–8 °C. Oxidácia predstavuje ďalšie komplikácie, pretože oxidované DTT vykazuje silnú absorpciu pri 280 nm. Keďže tioly sú menej nukleofilné než ich konjugované bázy, tioláty, stáva sa z DTT pri nižšom pH horší nukleofil. Ditiobutylamín (DTBA) je ditiolové redukčné činidlo, ktoré je do istej miery schopné prekonať obmedzenia DTT. Alternatívnym redukčným činidlom je TCEP, ktorý je zároveň stabilnejší a účinnejší pri nižšom pH, ale je objemnejší a len pomaly redukuje cysteínové reziduá v zbalených proteínoch.

Pri pH 6,5 je polčas života DTT asi 40 hodín a pri pH 8,5 a 20 °C je to 1,4 hodiny. Pri vyššej teplote sa jeho polčas života znižuje. Prítomnosť EDTA, ktorá tvorí cheláty s dikatiónmi kovov (Fe2+, Cu2+ a inými) výrazne predlžuje životnosť roztoku DTT.

Redukčné činidlo 
DTT je redukčné činidlo a po oxidácii z neho vzniká stabilný šesťčlenný kruh s vnútromolekulovým disulfidickým mostíkom. Jeho redoxný potenciál pri pH 7 je −0,332 V a pri pH 8,1 je to -0,366 V. Redukcia typického disulfidického mostíka prebieha postupnou dvojkrokovou reakciou, tiol-disulfidovou zámenou, ako je ukázané na obrázku nižšie. Redukcia sa zvyčajne nezastaví na zmiešanom disulfide, pretože druhý tiol DTT je náchylný na tvorbu cyklickej zlúčeniny, čím vzniká oxidovaný DTT a redukovaný disulfidický mostík. Redukčná schopnosť DTT je obmedzená na pH vyššie než 7, pretože len záporne nabitý tiolát, RS-, je reaktívny (protónovaný tiol, RSH, nie je). pKa tiolových skupín DTT je 9,2 a 10,1.

Využitie 
DTT sa používa ako redukčné či „deprotekčné“ činidlo na tiolovanej DNA. Koncové sírové atómy tiolovanej DNA majú v roztoku tendenciu tvoriť diméry, hlavne v prítomnosti kyslíka. Dimerizácia znižuje účinnosť nasledujúcich reakcií, ako sú imobilizácia DNA na zlaté častice v biosenzoroch. DTT sa zvyčajne zmieša s roztokom DNA, ponechá reagovať a následne sa odstraňuje pomocou filtrácie (v prípade pevného katalyzátora) alebo chromatografie (v prípade kvapalín). Všeobecne sa DTT používa ako chrániace činidlo, ktoré pomáha predchádzať oxidácii tiolových skupín.

DTT sa často používa na redukciu disulfidických mostíkov v bielkovinách a všeobecne i na predchádzanie tvorbe intramolekulárnych (vnútri molekuly) a intermolekulárnych (medzi dvoma molekulami) disulfidických mostíkov, ktoré môžu vznikať medzi cysteínovými reziduami. DTT však nedokáže redukovať zanorené disulfidické mostíky (také, ktoré nie sú prístupné rozpúšťadlu, teda nie sú na povrchu bielkoviny), takže ich redukcia sa niekedy robí za denaturujúcich podmienok (napríklad pri vysokých teplotách alebo v prítomnosti silných denaturantov ako sú guanidínium chlorid, močovina alebo dodecylsulfát sodný). DTT sa často používa spolu s dodecylsulfátom sodným v SDS-PAGE, aby sa dosiahla vyššia miera denaturácie porušením disulfidických mostíkov i vnútri bielkovín, čo umožňuje lepšiu separáciu bielkovín pomocou elektroforézy. Rôzne disulfidické mostíky, ktoré sú v kontakte s rozpúšťadlom, možno rozlíšiť podľa rýchlosti redukcie v prítomnosti DTT.

Kvôli jeho schopnosti redukovať disulfidické mostíky redukuje DTT dá použiť na denaturáciu CD38 u červených krviniek. DTT takisto denaturuje antigény krvných skupín Kell, Lutheran, Dombrock, Cromer, Cartwright, LW, Knops a iných. Znalosť denaturácie týchto antigénov je dôležitá pri krvných transfúziách. 

DTT sa takisto dá použiť ako oxidačné činidlo. Jeho hlavnou výhodou je, že nevznikajú prakticky žiadne zmiešané disulfidy, na rozdiel od iných činidiel, napríklad glutatiónu. Vo veľmi vzácnych prípadoch môže vznikať adukt DTT, keď sa obe tiolové skupiny DTT naviažu na rôzne atómy síry. V takých prípadoch nemôže DTT tvoriť cyklus, pretože nemá žiadne voľné tiolové skupiny.

Referencie

Pozri aj 
 Ditiobutylamín (DTBA)
 2-merkaptoetanol (2ME)
 TCEP

Zdroj 

Tioly
Redukčné činidlá
Vicinálne dioly