Nukleáza

Nukleáza (nukleolytický enzým) je hydrolytický enzým, ktorý štiepi fosfodiesterovú väzbu v nukleových kyselinách. Ribonukleáza štiepi RNA a deoxyribonukleáza štiepi DNA; bežne sa tieto enzýmy označujú ako RNáza a DNáza.

Rozlišujú sa exonukleázy, ktoré degradujú konce nukleových kyselín, a endonukleázy, ktoré štiepia vo vnútri molekúl DNA či RNA. Konce dvojreťazcových (angl. double-stranded) molekúl môžu byť buď zarovnané (tupé) alebo prečnievajúce (kohézne), pričom prečnievať môže buď 5' alebo 3' koniec. Rôzne exonukleázy vykazujú rôznu substrátovú špecifickosť a štiepia rôzne typy koncov. V laboratórnej praxi sa bežne používajú tieto enzýmy:
exonukleáza III izolovaná z baktérie E. coli pôsobí na dvojreťazcové DNA, pričom degraduje 3'-5' vlákno; účinkuje iba vtedy, ak sú konce DNA zarovnané alebo ak prečnievajú 5' konce (prečnievajúce 3' konce nie sú degradované);
exonukleáza Bal31 izolovaná z baktérie Alteromonas espejiana štiepi dvojreťazcovú DNA na oboch koncov za vzniku zarovnaných (tupých) koncov.

Endonukleázy štiepia molekuly DNA či RNA vo vnútri, a to buď náhodne alebo špecificky. Medzi bežné endonukleázy patria:
nukleáza S1 izolovaná z huby Aspergillus rozpoznáva dvojreťazcové DNA, ale štiepi len ich jednoreťazcové úseky;
deoxyribonukleáza I (DNáza I) izolovaná z hovädzieho pankreasu vytvára na DNA jednoreťazcové zlomy, od ktorých degraduje DNA do strán, prípadne degraduje i jednoreťazcové DNA; v prítomnosti horečnatých katiónov vytvára zlomy na rôznych miestach, v prítomnosti manganatých katiónov tvorí zlomy v protiľahlých pozíciách;
ribonukleáza A (RNáza A) izolovaná z hovädzieho pankreasu štiepi jednoreťazcovú RNA od 3' konca.

Osobitým typom endonukleáz sú restrikčné endonukleázy (RE), skrátene reštriktázy. Tie štiepia DNA len po rozpoznaní špecifických sekvencií. Existujú tri triedy reštriktáz: enzýmy tried I a III majú nukleolytické i DNA-modifikačné schopnosti, reštriktázy triedy II majú iba nukleázovú aktivitu. Názvy RE sa zväčša odvodzujú od organizmov, z ktorých boli izolované. Napr. reštriktáza EcoRI bola izolovaná z baktérie E. coli, konkrétne sérotypu RY13. Išlo o prvý enzým tohoto typu izolovaný z tohto organizmu, preto nesie v označení rímsku jednotku (nie je to označenie triedy ani písmeno i). Niektoré reštriktázy štiepia DNA priamo v mieste rozpoznávanej sekvencie (napr. EcoRI rozpoznáva GAATTC), iné môžu štiepiť v miestach vzdialených od rozpoznávanej sekvencie. Rozpoznávané sekvencie sú väčšinou dlhé 4 až 8 bázových párov. Enzýmy s rovnakým rozpoznávacím miestom sa nazývajú izoschizoméry. Niektoré nukleázy môžu za určitých podmienok rozpoznávať i sekvencie blízko príbuzné tej špecifickej, vtedy hovoríme o ich relaxovanej (uvoľnenej) špecificite. Produkty restrikčného štiepenia sa nazývajú restrikčné fragmenty.

Reštrikčné endonukleázy sú dôležitým nástrojom molekulárnej biológie. Objavené boli v 70. rokoch 20. storočia ako súčasť reštrikčno-modifikačného (RM) systému baktérií. Baktérie sa pred vniknutím cudzorodej nukleovej kyseliny (napr. bakteriofágovej DNA) bránia tým, že ju degradujú pomocou špecifických restrikčných endonukleáz. Ich vlastná DNA je pred zničením chránená metyláciou, ktorú vykonávajú modifikačné enzýmy RM systému.

Objav restrikčných endonukleáz umožnil rozvoj génového inžinierstva, teda klonovania a analýzy génov. Pomocou RE je totiž možné vhodne naštiepiť vektorovú i klonovanú DNA a pomocou ďalších enzýmov ich spojiť a preniesť do hostiteľského organizmu, najčastejšie baktérií. To umožňuje vyselektovať z dlhých oblastí DNA iba želané úseky a narábať ďalej iba s nimi. Restrikčné štiepenie je ďalej základom makrorestrikčných analýz a restrikčného mapovania génov, ale využíva sa i v technikách ako polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (angl. restriction fragment length polymorphism, RFLP), ktorá sa využíva aj pre forenzné účely (napr. určenie príbuznosti, identifikáciu tela či identifikáciu páchateľa).

Iné projekty 

Hydrolázy