Tandem massespektrometri

Tandem massespektrometri, også kjent som MS/MS eller MS2, er en teknikk i instrumental analyse der to eller flere masseanalysatorer er koblet sammen ved hjelp av et ekstra reaksjonstrinn for å øke deres evner til å analysere kjemiske prøver. Vanlig bruk av tandem-MS er analysen av biomolekyler, som proteiner og peptider.

Molekylene i en gitt prøve er ionisert, og det første spektrometeret (betegnet MS1) skiller disse ionene ved deres masse-til-ladningsforhold (ofte gitt som m/z eller m/Q). Ioner med et bestemt m/z-forhold som kommer fra MS1 blir valgt og deretter laget for å splitte i mindre fragmentioner, f.eks. ved kollisjonsindusert dissosiasjon, ion-molekylreaksjon eller fotodissosiasjon. Disse fragmentene blir deretter introdusert i det andre massespektrometeret (MS2), som igjen skiller fragmentene med deres m/z-forhold og oppdager dem. Fragmenteringstrinnet gjør det mulig å identifisere og skille ioner som har veldig like m/z-forhold i vanlige massespektrometre.

Struktur 
Tandem massespektrometri inkluderer trippel kvadrupol massespektrometer (qqq), kvad-flytid (Q-tof) og hybrid massespektrometer.

Trippel kvadrupol massespektrometer (qqq) 
Trippel kvadrupolmassespektrometre bruker den første og tredje kvadrupolen som massefilter. Når analytter passerer den andre kvadrupolen, fortsetter fragmenteringen gjennom kollisjon med gass. Vanligvis brukt i farmasøytisk industri.

Kvadrupol-flyvetidsmassespektrometer (Q-tof) 
Q-tof massespektrometer kombinerer flyvetidsmassespektrometer og kvadrupol instrumenter, som forårsaker høy massenøyaktighet for produktioner, nøyaktig kvantifiseringsevne og fragmenteringseksperiment anvendbarhet. Dette er en metode for massespektrometri som forholdet mellom ionefragmenterings (m/z) forholdet bestemmes gjennom en flyvetidsmåling.

Hybridmassespektrometer 
Hybridmassespektrometer består av mer en to masseanalysatorer

Instrumentelt 

Flere trinn med masseanalyseseparasjon kan oppnås med individuelle massespektrometerelementer atskilt i rommet eller ved bruk av et enkelt massespektrometer med MS-trinn atskilt i tid. For tandem massespektrometri i rommet blir de forskjellige elementene ofte notert i en kort beskrivelse, og gir den typen massevalg som brukes.

Tandem i rom 

I tandem massespektrometri i rommet er separasjonselementene fysisk atskilt og tydelige, selv om det er en fysisk forbindelse mellom elementene for å opprettholde høyt vakuum. Disse elementene kan være sektor, kvadrupole eller flyvetid. Når du bruker flere kvadrupoler, kan de fungere som både masseanalysatorer og kollisjonskamre.

Vanlig betegnelse for masseanalysatorer er Q - kvadrupol masseanalysator; q - radiofrekvens kollisjon kvadrupole; TOF - flyvetidsmasseanalysator; B - magnetisk sektor, og E - elektrisk sektor. Notasjonen kan kombineres for å indikere forskjellige hybridinstrumenter, for eksempel QqQ '- trippel kvadrupol massespektrometer; QTOF - kvadrupol flyvetids massespektrometer (også QqTOF); og BEBE - firesektor (omvendt geometri) massespektrometer.

Tandem i tid 

Ved å gjøre tandem massespektrometri i tid, oppnås separasjonen med ioner fanget på samme sted, med flere separasjonstrinn som finner sted over tid. En kvadrupol ionefelle eller Fourier-transform ion syklotron resonans (FTICR) instrument kan brukes til en slik analyse. Felleinstrumenter kan utføre flere analysetrinn, som noen ganger blir referert til som MSn (MS til n). Ofte er antall trinn, n, ikke angitt, men noen ganger blir verdien spesifisert; for eksempel indikerer MS3, tre trinn for separasjon. Tandem i tid MS-instrumenter bruker ikke modusene som er beskrevet nedenfor, men samler vanligvis all informasjon fra en forløper-ion-skanning og en foreldre-ion-skanning av hele spektret. Hver instrumentkonfigurasjon benytter en unik modus for masseidentifikasjon.

Tandem i rom MS/MS-modus 
Når tandem MS utføres med en i romdesign, må instrumentet operere i en av en rekke forskjellige moduser. Det finnes en rekke forskjellige tandem MS/MS instrumentoppsett, og hver modus har sine egne applikasjoner og gir forskjellig informasjon. Tandem MS i rommet bruker koblingen av to instrumentkomponenter som måler det samme massespektrumområdet, men med en kontrollert fraksjonering mellom dem i rommet, mens tandem MS i tid innebærer bruk av en ionefelle.

Det er fire hovedskanningseksperimenter mulig ved bruk av MS/MS: forløperionskanning, skanning av produktion, skanning av nøytralt tap og valgt reaksjonsovervåking.

For en forløperionskanning velges produktionen i den andre masseanalysatoren, og forløpermassene skannes i den første masseanalysatoren. Merk at forløperion er synonymt med foreldreion og produktion med datterion, men bruken av disse menneskelignende begrepene frarådes.

I en produktionskanning velges et forløperion i det første trinnet, blir fragmentert, og deretter skannes alle resulterende masser i den andre masseanalysatoren og oppdages i detektoren som er posisjonert etter den andre masseanalysatoren. Dette eksperimentet blir ofte utført for å identifisere overganger som brukes til kvantifisering av tandem MS.

I en nøytral tapskanning skanner den første masseanalysatoren alle massene. Den andre masseanalysatoren skanner også, men ved en forskyvning fra den første masseanalysatoren. Denne forskyvningen tilsvarer et nøytralt tap som ofte observeres for denne klassen med forbindelser. I en konstant-nøytral-tap-skanning blir alle forløpere som gjennomgår tapet av en spesifisert felles nøytral overvåket. For å få denne informasjonen blir begge masseanalysatorene skannet samtidig, men med en masseforskyvning som korrelerer med massen til den spesifiserte nøytralen. I likhet med forløper-ion-skanning, er denne teknikken også nyttig i den selektive identifikasjonen av nær beslektet klasse av forbindelser i en blanding.

I valgt reaksjonsovervåking er begge masseanalysatorene satt til en valgt masse. Denne modusen er analog med valgt ionovervåking for MS-eksperimenter. En selektiv analysemodus, som kan øke følsomheten.

Fragmentering 
Fragmentering av ioner i gassfase er viktig for tandem massespektrometri og forekommer mellom forskjellige stadier av masseanalyse. Det er mange metoder som brukes til å fragmentere ionene, og disse kan resultere i forskjellige typer fragmentering og dermed ulik informasjon om strukturen og sammensetningen av molekylet.

Kildefragmentering 
Ofte er ioniseringsprosessen tilstrekkelig voldsom til å etterlate de resulterende ionene med tilstrekkelig indre energi til å fragmenteres i massespektrometeret. Hvis produktionene vedvarer i sin ikke-likevektstilstand i moderat tid før auto-dissosiasjon, kalles denne prosessen metastabil fragmentering. Fragmentering av dyse-skimmer refererer til målrettet induksjon av kildefragmentering ved å øke dyseskimmer-potensialet på vanligvis elektrospraybaserte instrumenter. Selv om fragmentering i kilden tillater fragmenteringsanalyse, er det ikke teknisk tandem-massespektrometri med mindre metastabile ioner masseanalyseres eller velges før auto-dissosiasjon og et andre analysetrinn utføres på de resulterende fragmentene. Kildefragmentering kan brukes i stedet for tandem massespektrometri gjennom bruk av forbedret kildefragmenteringannotonering (ofte forkortet EISA fra engelsk Enhanced in-Source Fragmentation Annotation) teknologi som genererer fragmentering som direkte samsvarer med tandem massespektrometri data. Fragmenter observert av EISA har høyere signalintensitet enn tradisjonelle fragmenter som lider tap i kollisjonscellene til tandem massespektrometre. EISA muliggjør oppsamling av fragmenteringsdata på MS1-masseanalysatorer som flytid og enkelt kvadrupolinstrumenter. Kildefragmentering brukes ofte i tillegg til tandem massespektrometri (med etterkildefragmentering) for å tillate to trinn med fragmentering i en pseudo MS3-type eksperimenter.

Kollisjonsindusert dissosiasjon 
Fragmentering etter kilden er oftest det som blir brukt i et tandem massespektrometrieksperimenter. Energi kan også tilsettes ionene, som vanligvis allerede er vibrasjonelt begeistret, gjennom kollisjon etter kilden med nøytrale atomer eller molekyler, absorpsjon av stråling, eller overføring eller innfanging av et elektron med et mangfoldig ladet ion. Kollisjonsindusert dissosiasjon (CID), også kalt kollisjonsaktivert dissosiasjon (CAD), innebærer kollisjon av et ion med et nøytralt atom eller molekyl i gassfasen og påfølgende dissosiasjon av ionet. For eksempel:

 AB+ + M -> A + B+ +M

der ionet AB+ kolliderer med det nøytrale speciet M og deretter bryter fra hverandre. Detaljene i denne prosessen er beskrevet av kollisjonsteori. På grunn av ulik instrumental konfigurasjon er to hovedtyper av CID mulig: (i) stråle-type (hvor forløperioner er fragmentert underveis) og (ii) ionefeller (der forløperioner blir først fanget, og deretter fragmentert).

En tredje og nyere type CID-fragmentering er høyenergi kollisjonell dissosiasjon (HCD). HCD er en CID-teknikk som er spesifikk for orbitrap massespektrometre der fragmentering foregår utenfor ionefellen, det skjer i HCD-cellen (i noen instrumenter kalt "ion routing multipole"). HCD er en fragmentering av felle-typen som har vist seg å ha egenskaper av bjelketypen. Fritt tilgjengelige storskala høyoppløselige tandem massespektrometri databaser eksisterer (f.eks. METLIN med 850 000 molekylære standarder hver med eksperimentelle CID MS/MS data), og brukes vanligvis for å lette identifikasjon av små molekyler.

Elektronfangst og overføringsmetoder 
Energien som frigjøres når et elektron overføres til eller fanges opp av et multipladdet ion, kan indusere fragmentering.

Elektronfangstdissosiasjon 
Hvis et elektron tilsettes et multiladdet positivt ion, frigjøres Coulomb-energien. Å legge til et fritt elektron kalles elektronfangsdissosiasjon (ECD), og er representert med:

 

for et multiplisert protonert molekyl M.

Elektronoverføring dissosiasjon 
Tilsetning av et elektron gjennom en ion-ion-reaksjon kalles elektronoverføring dissosiasjon (ETD). I likhet med elektronfangst-dissosiasjon, induserer ETD fragmentering av kationer (f.eks. Peptider eller proteiner) ved å overføre elektroner til dem. Den ble oppfunnet av Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka og Jarrod Marto ved University of Virginia.

ETD bruker ikke frie elektroner, men benytter radikale anioner (f.eks. Antracen eller azobenzen) til dette formålet:

 

hvor A er anionet.
 
ETD spaltes tilfeldig langs peptidrygraden (c- og z-ioner) mens sidekjeder og modifikasjoner som fosforylering blir liggende intakte. Teknikken fungerer bare bra for ioner med høyere ladningstilstand (z> 2), men i forhold til kollisjonsindusert dissosiasjon (CID) er ETD fordelaktig for fragmentering av lengre peptider eller til og med hele proteiner. Dette gjør teknikken viktig for ovenfra og ned proteomikk. I likhet med ECD er ETD effektiv for peptider med modifikasjoner som fosforylering.

Elektronoverføring og høyere energi kollisjon dissosiasjon (EThcD) er en kombinasjon ETD og HCD der peptidforløperen først blir utsatt for en ion/ion-reaksjon med fluorantenanioner i en lineær ionefelle, som genererer c- og z-ioner. I det andre trinnet påføres HCD allionfragmentering på alle ETD-avledede ioner for å generere b- og y-ioner før den endelige analysen i orbitrap-analysatoren. Denne metoden benytter dobbelt fragmentering for å generere ion- og dermed datarike MS/MS-spektre for peptidsekvensering og PTM-lokalisering.

Negativ elektronoverføringsdissosiasjon 
Fragmentering kan også forekomme med et deprotonert specie, der et elektron overføres fra speciet til et kationisk reagens i en negativ elektronoverføringsdissosiasjon (forkortet til NETD fra engelsk  negative electron transfer dissociation): 

[M-nH]^{n-} {+} A+ -> [[M-nH]^{(n{+}1)-}]^{'} {+}A -> fragmenter

Etter denne overføringshendelsen gjennomgår det elektronmanglende anionet en intern omorganisering og fragmenterer. NETD er ion/ion-analog for elektron-løsrivelsesdissosiasjon (EDD). 

NETD er kompatibel med fragmentering av peptider og proteiner langs ryggraden ved Cα-C-bindingen. De resulterende fragmentene er vanligvis en a•- og x-type produktioner.

Elektron-løsrivelse dissosiasjon 
Elektron-løsrivelse dissosiasjon  (forkortet til EDD fra engelsk electron-detachment dissociation) er en metode for fragmentering av anioniske specier i massespektrometri. Den fungerer som en negativ motmodus for dissosiasjon med elektronfangst. Negativt ladede ioner aktiveres ved bestråling med elektroner med moderat kinetisk energi. Resultatet er utstøting av elektroner fra det ioniske modermolekylet, som forårsaker dissosiasjon via rekombinasjon.

Ladningsoverføringsdissosiasjon 
Reaksjon mellom positivt ladede peptider og kationiske reagenser, også kjent som ladningsoverføringsdissosiasjon (forkortet til CTD fra engelsk charge-transfer dissociation), har nylig blitt demonstrert som en alternativ høyenergifragmenteringsvei for lavladningstilstand (1+ eller 2+) peptider . Den foreslåtte mekanismen for CTD ved bruk av heliumkationer som reagens er: 

Innledende rapporter er at CTD forårsaker ryggrad Cα-C  binding spalting av peptider og gir en a•- og x-type produktioner.

Fotodissosiasjon 
Energien som kreves for dissosiasjon kan komme fra foton absorpsjon, noe som resulterer i ion-fotodissosiasjon og kan bli representert med ligningen:

AB+ {+} \mathit{h\nu} -> A {+} B+
hvor \mathit{h\nu}representerer fotonet som er absorbert av ionet. Ultrafiolette lasere kan brukes, men kan føre til overdreven fragmentering av biomolekyler.

Infrarød multifotondissosiasjon 
Infrarøde fotoner vil varme opp ionene og forårsake dissosiasjon hvis nok av dem absorberes. Denne prosessen kalles infrarød multifotondissosiasjon (forkortes til IRMPD fra engelsk infrared multiphoton dissociation) og oppnås ofte med en karbondioksidlaser og et ionefangstmassespektrometer som et FTMS.

Blackbody infrarød strålingsdissosiasjon 
Varmestråling kan brukes til fotodissosiasjon i en teknikk kjent som blackbody infrarød strålingsdissosiasjon (forkortet til BIRD fra engelsk blackbody infrared radiative dissociation). I BIRD-metoden blir hele vakuumkammeret for massespektrometer oppvarmet for å skape infrarødt lys. BIRD bruker denne strålingen for å stimulere stadig mer energiske vibrasjoner av ionene, til en binding bryter, og skaper fragmenter. Dette ligner på infrarød multifotondissosiasjon som også bruker infrarødt lys, men fra en annen kilde. BIRD brukes oftest med Fourier-transform ion syklotron resonans massespektrometri.

Overflateindusert dissosiasjon 
Ved overflateindusert dissosiasjon (forkortet til SID fra engelsk surface-induced dissociation) er fragmenteringen et resultat av kollisjonen mellom et ion og en overflate under høyt vakuum. I dag brukes SID til å fragmentere et bredt spekter av ioner. For mange år siden var det bare vanlig å bruke SID på specier med lavere masse, enkeltladede specier fordi ioniseringsmetoder og masseanalyserteknologier ikke var avanserte nok til å danne, overføre eller karakterisere ioner med høy m/z. Over tid har selvmonterte monolagoverflater (SAM) bestående av CF3(CF2)10CH2CH2S på gull vært de mest fremtredende brukte kollisjonsflatene for SID i et tandemspektrometer. SAM har fungert som de mest ønskelige kollisjonsmålene på grunn av deres karakteristiske store effektive masser for kollisjon av innkommende ioner. I tillegg er disse overflatene sammensatt av stive fluorkarbonkjeder, som ikke demper energien til prosjektilionene betydelig. Fluorkarbonkjedene er også gunstige på grunn av deres evne til å motstå lett elektronoverføring fra metalloverflaten til de innkommende ionene. SIDs evne til å produsere subkomplekser som forblir stabile og gir verdifull informasjon om tilkobling, er uten sidestykke av noen annen dissosiasjonsteknikk. Siden kompleksene produsert fra SID er stabile og beholder fordelingen av ladningen på fragmentet, produserer dette et unik spektra som komplekset sentrerer rundt en smalere m/z-fordeling. SID-produktene og energien fra da de ble dannet, reflekterer kompleksets styrker og topologi. De unike dissosieringsmønstrene hjelper forskere med å oppdage kompleksets kvartære struktur. Den symmetriske ladningsfordelingen og avhenger av dissosiasjon er unike for SID og gjør de produserte spektrene særegne fra enhver annen dissosiasjonsteknikk.

SID-teknikken er også anvendelig for ion-mobilitets massespektrometri (IM-MS). Tre forskjellige metoder for denne teknikken inkluderer analyse av karakterisering av topologi, tilkobling mellom enheter og graden av utfolding for proteinstruktur. Analyse av proteinstruktur utfolder seg er den mest brukte anvendelsen av SID-teknikken. For ion-mobilitets massespektrometri (IM-MS) brukes SID for dissosiasjon av kildeaktiverte forløpere til tre forskjellige typer proteinkomplekser: C-reaktivt protein (CRP), transthyretin (TTR) og concanavalin A (Con A) . Denne metoden brukes til å observere utfoldingsgraden for hvert av disse kompleksene. For denne observasjonen viste SID forløperionenes strukturer som eksisterer før kollisjonen med overflaten. IM-MS bruker SID som et direkte mål på konformasjonen for hvert proteines underenhet. 

Fourier-transform ion syklotron resonans (FTICR) er i stand til å gi ultrahøy oppløsning og høy massenøyaktighet til instrumenter som tar massemålinger. Disse funksjonene gjør FTICR-massespektrometre til et nyttig verktøy for et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel flere dissosiasjonseksperimenter, som kollisjonsindusert dissosiasjon (CID, elektronoverføringsdissosiasjon (ETD), og andre. indusert dissosiasjon har blitt implementert med dette instrumentet for studiet av grunnleggende peptidfragmentering. Spesielt har SID blitt brukt til studiet av energetikk og kinetikken til gassfasefragmentering innenfor et ICR-instrument. Denne tilnærmingen har blitt brukt for å forstå gassfasefragmenteringen av protonerte peptider, odderelektronpeptidioner, ikke-kovalente ligand-peptidkomplekser og ligerte metallklynger.

Begrensninger 
Tandem massespektrometri kan ikke brukes til encelleanalyser, da det er ufølsomt å analysere så små mengder av en celle. Disse begrensningene skyldes primært en kombinasjon av ineffektiv ioneproduksjon og ionetap i instrumentene på grunn av kjemiske støykilder til løsningsmidler.

Veien videre 
Tandem massespektrometri vil være et nyttig verktøy for proteinkarakterisering, nukleoproteinkomplekser og andre biologiske strukturer. Imidlertid var det noen utfordringer igjen som å analysere karakteriseringen av proteomet kvantitativt og kvalitativt.

Referanser 

Tandem massespektrometri