Hromatogrāfija

Hromatogrāfija (no , chroma — 'krāsa' un , graphein — 'rakstīt') ir laboratorijas tehnoloģiju kopums vielu maisījumu sadalīšanai. Maisījums tiek izšķīdināts šķidrumā, ko sauc par kustīgo fāzi, kas pārvieto to cauri citu materiālu saturošai struktūrai, sauktai par stacionāro fāzi. Dažādie maisījuma komponenti ceļo ar atšķirīgu ātrumu, kas liek tiem sadalīties. Tas balstās uz sadalīšanos, kas notiek starp kustīgo un stacionāro fāzi.

Hromatogrāfiju var izmantot preparatīviem vai analītiskiem mērķiem. Preparatīvās hromatogrāfijas mērķis ir atdalīt vielas no vielu maisījuma tālākai vielu izmantošanai (to var uzskatīt arī par attīrīšanu). Analītiskā hromatogrāfijā tiek ņemti mazāki vielu daudzumi un tā domāta vielu relatīvo proporciju mērīšanai maisījumā.

Vēsture 

Hromatogrāfiju pirmo reizi izmantoja Krievijā 1900. gadā, Itālijā dzimis zinātnieks Mihails Cvets. Viņš turpināja strādāt ar hromatogrāfijas metodi 20. gadsimta pirmajā dekādē, galvenokārt augu pigmentu atdalīšanai tādu kā hlorofils, karotīns un ksantofils. Tā kā šiem savienojumiem ir atšķirīgas krāsas (respektīvi, zaļa, oranža un dzeltena), tie deva šai metodei nosaukumu. Jaunas hromatogrāfijas metodes, kuras attīstījās 20. gadsimta 30.-40. gados, deva iespēju šo metodi izmantot daudziem atdalīšanas procesiem.

Izstrādātā hromatogrāfijas tehnika būtībā ir Ārčera Džona Portera Martina un Ričarda Laurenca Milingtona Singes darba rezultāts 20. gadsimta 40.-50. gados. Viņi izstrādāja atdalīšanās hromatogrāfijas principus un pamattehniku un viņu darbs ir iedrošinājis strauju attīstību dažās hromatogrāfijas metodēs: papīra hromatogrāfija, gāzu hromatogrāfija. Kopš tiem laikiem, tehnoloģijas ir attīstījušās strauji. Pētnieki ir atklājuši, ka Cveta hromatogrāfijas galvenie principi var tikt piemēroti daudzos dažādos veidos, tādā veidā radot dažādus hromatogrāfijas veidus. Hromatogrāfijas process vēl joprojām tiek uzlabots, ļaujot atdalīt aizvien līdzīgākas molekulas.

Hromatogrāfijas termini 
 Analīts ir vielu maisījums, kuru nepieciešams atdalīt hromatogrāfijas procesā. Tas parasti arī ir tā substance, kuru vajag no šī vielu maisījuma.
 Analītiskā hromatogrāfija tiek lietota, lai noteiktu analītu un iespējams arī tā koncentrāciju paraugā.
 Saistošā fāze ir stacionāra fāze, kura ir kovalenti saistījusies ar atbalsta daļiņām vai kolonnas iekšējo sienu kolonnā.
 Hromatogramma ir hromatogrāfa vizuāls rezultāts. Optimālas atdalīšanas rezultātā dažādas virsotnes un secība hromatogrammā sakrīt ar dažādiem savienojumiem atdalītajā maisījumā.
  
 Uz x-ass ir atlikts aiztures laiks, bet uz y-ass atlikts signāls, kurš iegūts, piemēram, ar spektrofotometru, masspektrometru vai ar kādu citu detektoru un korespondē ar atbildi, ko dod analīts izejot cauri sistēmai. Optimālas sistēmas gadījumā signāls ir proporcionāls noteiktam atdalītam analītam.
 Hromatogrāfs ir aprīkojums, kurš ļauj veikt rūpīgāku un sarežģītāku atdalīšanu, piemēram, gāzu hromatogrāfisku vai šķidruma hromatogrāfisku atdalīšanu.
 Hromatogrāfija ir fizikāla atdalīšanas metode, kura atdala savienojumus starp divām fāzēm, viena ir stacionārā jeb nekustīgā fāze, otra ir mobilā jeb kustīgā fāze noteiktā virzienā.
 Eluāts ir kustīgā fāze, kas pamet kolonnu.
 Eluents ir šķīdinātājs, kas nes analītu.
 Eluotropiskās sērijas ir saraksts ar šķīdinātājiem, kur tie sakārtoti atbilstoši to eluēšanas spējām.
 Nekustīgā fāze ir stacionārā fāze, kura atrodas uz atbalsta daļiņām vai kolonnas iekšējās sienas.
 Kustīgā fāze ir fāze, kas kustas noteiktā virzienā. Tā var būt šķidrums (šķidrumu hromatogrāfija un kapilārā elektrohromatogrāfija), gāze (gāzes hromatogrāfija) vai arī superkritisks šķīdums (superkritiskā-šķīduma hromatogrāfija). Kustīgā fāze sastāv no parauga, kurš tiek atdalīts un analizēts un šķīdinātāja, kurš pārvieto paraugu cauri kolonnai. Augsti efektīvā šķidrumu hromatogrāfijas gadījumā mobilā fāze sastāv no nepolāra šķīdinātāja, tāda kā heksāns normālajā fāzē vai polārs šķīdinātājs atgriezeniskās fāzes hromatogrāfijā, un parauga, kuru atdala un analizē. Kustīgā fāze kustas cauri hromatogrāfijas kolonnai (stacionārajai fāzei), kur paraugs mijiedarbojas ar stacionāro fāzi un tiek sadalīts.
 Preparatīvā hromatogrāfija tiek lietota vielu attīrīšanai, to tālākai izmantošanai.
 Aiztures laiks raksturo cik ilgs laiks nepieciešams, lai noteikts analīts izietu cauri sistēmai pie noteikti apstākļiem (no kolonnas sākuma līdz detektoram).
 Paraugs ir substance, kas tiek analizēta hromatogrāfijā. Tā var sastāvēt no viena komponenta vai tas var būt maisījums ar dažādām vielām. Kad paraugs tiek lietots analīzē, fāze vai fāzes, kuras satur interesējošo analītu tiek uzskatītas par paraugu, pārējās atdalītās fāzes tiek uzskatītas kā piemaisījumi.
 Izšķīdušās vielas atbilst parauga sastāvdaļām atdalīšanas hromatogrāfijā.
 Šķīdinātājs ir viela, kas spēj izšķīdināt otru vielu.
 Stacionārā fāze ir nofiksēta substance hromatogrāfijas procesam. Piemēram, silika gēla slānis plānslāņa hromatogrāfijā.
 Detektors ir instruments, kuru izmanto kvalitatīvai un kvantitatīvai analītu noteikšanai pēc atdalīšanas.

Hromatogrāfija ir balstīta uz sadalīšanas koeficienta jēdzienu. Kad vienu no šķīdinātājiem padara nekustīgu (adsorbējot to uz cietas atbalsta pamatnes) un otru padara kustīgu, tas veido biežāko hromatogrāfijas pielietojumu. Ja pamatnes substance ir polāra (piemēram, silikagels) priekšējās fāzes hromatogrāfijas, bet ja substance ir nepolāra, tad tā ir atgriezeniskās fāzes hromatogrāfija.

Kolonnu hromatogrāfija 

Kolonnu hromatogrāfija ķīmijā ir metode atsevišķu vielu attīrīšanai no vielu maisījuma. To bieži izmanto attīrīšanai sākot no mikrogramiem līdz pat kilogramiem. Galvenā kolonnu hromatogrāfijas priekšrocība ir zemās izmaksas un stacionārās fāzes vienreizējā izmantošana, kas nodrošina to, ka nenotiek sajaukšanās un stacionārās fāzes degradācija pārstrādes rezultātā.

Klasiskā preparatīvā hromatogrāfijas kolonna ir stikla caurule ar diametru no 5 mm līdz 50 mm un augstumu no 5 cm līdz 1 m ar krānu un piemērotu filtru kolonnas apakšā (stikla vates korķis, lai nodrošinātu stacionārās fāzes nezūdamību). Kolonnas sagatavošanai pārsvarā tiek izmantotas divas metodes: sausā metode un slapjā metode

 Sausajā metodē kolonna vispirms tiek uzpildīta ar sausu stacionāro fāzi, tālāk pievieno mobilo fāzi, kuru laiž cauri kolonnai, lai tā visa samirkst un kopš tā brīža neļauj tai izžūt.
 Slapjajā metodē no eluenta un stacionārās fāzes pulvera tiek pagatavots maisījums un tad tas tiek uzmanīgi ieliets kolonnā. Jāizvairās no burbuļu iekļūšanas kolonnā. Organiska materiāla šķīdums tiek uzpilināts virs stacionārās fāzes. Šis slānis parasti ir pārklāts ar mazu slāni smilšu vai kokvilnas vai stikla vati tādējādi pasargājot organiskā slāņa formu no krītoša atkārtoti pielikta eluenta. Eluents lēnām virzās cauri kolonnai, lai sasniegtu organisko materiālu. Bieži kolonnas augšējā galā ir uzlikts sfērisks eluenta rezervuārs vai aizbīdāma piltuve ar eluentu.

Atsevišķi komponenti dažādi saglabājas stacionārajā fāzē un tiek atdalīti viens no otra brīdī kad tie pārvietojas ar dažādiem ātrumiem cauri kolonnai ar eluentu. Kolonnas beigās tie eluējas pa vienam katrs savā laikā. Visa hromatogrāfijas procesa laikā eluents tiek savākts dažādas frakcijās. Frakcijas var tikt savāktas automātiski ar frakciju savācēju. Hromatogrāfijas produktivitāti var uzlabot, izmantojot vairākas kolonnas vienlaicīgi. Šajā gadījumā ir nepieciešami daudzstraumju savācēji. Eluenta plūsmas salikums var tikt novērots un katrā frakcijā analizēti izšķīdušie komponenti, piemēram, analītiskajā hromatogrāfijā, UV absorbcija vai fluorescence. Krāsainie savienojumi (vai fluorescējošie, kurus var saskatīt UV gaismā) kolonnā redzamas kā krāsainas līnijas.

Papīra hromatogrāfija 

Papīra hromatogrāfija ir analītiska metode, kuru bieži lieto, lai atdalītu krāsainus savienojumus. Šī metode lielākoties ir aizstāta ar plānslāņa hromatogrāfiju. Kopumā papīra hromatogrāfija ir laba metode, lai pārbaudītu savienojuma tīrību un identificētu vielas. Tā ir noderīga metode, jo tā ir relatīvi ātra un tai nepieciešami mazi vielu daudzumi. Atdalīšana papīra hromatogrāfijā norisinās līdzīgi kā plānslāņa hromatogrāfijā. Papīra hromatogrāfijā viela ir sadalīta starp stacionāro un kustīgo fāzi. Stacionārā fāze parasti ir augstas kvalitātes filtrpapīrs. Kustīgā fāze ir šķīdums, kurš ceļo pa stacionāro fāzi, nesot līdzi paraugus. Parauga komponenti atdalīsies atkarībā no tā, cik stipri tie absorbējas uz stacionārās fāzes attiecībā pret to, cik labprātīgi tie šķīst kustīgajā fāzē.

Kad krāsaina savienojuma paraugs ir uznests uz filtrpapīra, krāsainos savienojumus no parauga atdala, vienu filtrpapīra galu ieliekot šķīdinātājā. Šķīdinātājs ceļo augšup pa papīru, šķīdinot dažādas molekulas paraugā atkarībā no molekulu polaritātēm un šķīdinātāja dabas. Ja paraugs satur vairākas krāsas, tad tajā ir jābūt vairāk kā viena veida molekulām. Tā kā šīm molekulām ir katrai ir citādāka ķīmiskā struktūra, ir liela iespēja, ka šīm molekulām būs vismaz nelielas atšķirības polaritātē, dod citādāku šķīdību dotajā šķīdinātājā. Nevienādās šķīdības izraisa to, ka molekulas pamet šķīdumu dažādās vietās, kad šķīdinātājs kustas augšup pa papīru. Jo molekula šķīstošāka, jo augstāk tā virzīsies pa papīru. Ja viela ir ļoti nepolāra, tad tā polārā šķīdinātājā var nešķīst vispār. Tāpat arī ar polārām vielām un nepolāru šķīdinātāju.

Ļoti svarīgi ņemt vērā, ka ūdens kā šķīdinātājs ir polārs, līdz ar to, jo polārāka krāsviela, jo augstāk tā kustēsies pa papīru.

Plānslāņa hromatogrāfija 

Tā ir hromatogrāfijas tehnika, kuru lieto negaistošu vielu maisījumu atdalīšanai. Plānslāņa hromatogrāfija tiek veikta uz stikla vai plastmasas plāksnītes vai alumīnija folijas, kura pārklāta ar plānu adsorbenta slāni, parasti tas ir silikagels, alumīnija oksīds vai celuloze. Šis adsorbenta slānis ir stacionārā fāze.

Pēc tam, kad paraugs ir uznests uz plates, šķīdinātājs vai šķīdinātāju sajaukums (kustīgā fāze) pievelkas augšup pa plati, pateicoties kapilārajiem spēkiem. Pateicoties tam, ka dažādi analīti pārvietojas augšup dažādos ātrumos, var panākt atdalīšanu.

Plānslāņa hromatogrāfiju var lietot, lai uzraudzītu reakcijas procesu, identificētu savienojumus dotajā maisījumā un noteiktu vielu un tās tīrību. Specifiski piemēri šim pielietojumam iekļauj keramīdu un piesātināto taukskābju analīzi, pesticīdu un insekticīdu noteikšanu pārtikā un ūdeni, krāsu salikuma analīze šķiedrās vai medicīnisko augu un to sastāvdaļu analīze.

Plānslāņa hromatogrāfijā var ieviest dažādus papildinājumus, lai automatizētu dažādus hromatogrāfijas soļus un uzlabotu izšķirtspēju un iegūtu precīzākus kvantitatīvos datus. Šī metode ir augsti efektīvā plānslāņa hromatogrāfija.

Atsauces

Ārējās saites 

 IUPAC Nomenclature for Chromatography
 Chromedia On line database and community for chromatography practitioners (paid subscription required)
 Library 4 Science: Chrom-Ed Series
 Hydrophobic Interaction & Reversed Phase Chromatography Handbook
 Overlapping Peaks Program — Learning by Simulations
 Chromatography Videos — MIT OCW — Digital Lab Techniques Manual 
 Chromatography Equations Calculators — MicroSolv Technology Corporation 

Hromatogrāfija