Kinetika enzim

Kinetika enzim adalah studi laju reaksi kimia terkatalisis enzim. Pada kinetika enzim, laju suatu reaksi diukur, serta pengaruh dari berbagai variasi kondisi terhadap reaksi tersebut diamati. Kajian kinetika suatu enzim dapat menjelaskan mekanisme katalitik enzim tersebut, perannya dalam metabolisme, bagaimana aktivitasnya dikontrol, dan bagaimana suatu obat atau suatu ligan pengubah (inhibitor atau aktivator) dapat memengaruhi lajunya.

Enzim (E) biasanya adalah sebuah molekul protein yang mendorong suatu reaksi dari molekul lain, substratnya (S). Substrat akan terikat pada sisi aktif enzim untuk menghasilkan kompleks enzim-substrat ES, yang kemudian berubah menjadi kompleks enzim-produk EP dan akhirnya menghasilkan produk P, melalui suatu keadaan transisi ES*. Rentetan tahapan ini dikenal sebagai mekanisme enzimatik:

 E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

Contoh ini mengasumsikan kasus paling sederhana dari suatu reaksi dengan satu substrat dan satu produk. Contoh kasus tersebut adalah mutase, seperti fosfoglukomutase mengkatalisis perpindahan gugus fosfat dari satu posisi ke posisi lain, dan isomerase, yang mana adalah nama umum bagi enzim yang mengkatalisis reaksi apapun yang melibatkan satu substrat satu produk (contohnya triosfosfat isomerase. Tetapi, enzim-enzim tersebut tidaklah umum, dan sangat kalah jumlah jika dibandingkan dengan enzim yang mengkatalisis reaksi dua substrat dua produk: di antaranya, sebagai contoh, NAD-dependen dehidrogenase seperti alkohol dehidrogenase, yang mengkatalisis oksidasi etanol oleh NAD+. Reaksi dengan tiga atau empat substrat atau produk lebih tidak umum, tetapi ada. Tidak ada keharusan jumlah produk yang dihasilkan sama dengan jumlah substrat yang digunakan; sebagai contoh, gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenase menggunakan 3 substrat dan menghasilkan 2 produk.

Ketika enzim mengikat banyak substrat, seperti dihidrofolat reduktase (ditampilkan di sebelah kanan), kinetika enzim juga dapat menunjukkan urutan pengikatan substrat dan urutan pelepasan produk.  Contoh enzim yang mengikat substrat tunggal dan melepaskan banyak produk adalah protease, ia memecah satu substrat protein menjadi dua produk polipeptida. Sementara itu, enzim lain mengikat dua substrat menjadi satu, seperti DNA polimerase yang mengikat nukleotida pada DNA. Meskipun mekanisme-mekanisme ini sering kali adalah tahapan rentetan yang rutin, terdapat satu “tahapan penentu laju” yang khas yang menentukan kinetika keseluruhan reaksi.  Tahapan penentu laju ini bisa berupa reaksi kimia atau perubahan konformasi dari enzim atau substrat, yang mana terlibat dalam proses pelepasan produk dari enzim.

Pengetahuan mengenai struktur enzim sangat membantu dalam menafsirkan data kinetika.  Sebagai contoh, struktur enzim dapat memberikan kemungkinan-kemungkinan bagaimana substrat dan produk terikat selama katalisis; perubahan apa yang terjadi selama reaksi; dan bahkan peran residu asam amino tertentu dalam mekanismenya.  Beberapa enzim berubah bentuk secara signifikan selama mekanisme berlangsung; untuk kasus ini, penentuan struktur enzim dengan dan tanpa analog substrat terikat yang tidak mengalami reaksi enzimatik akan sangat membantu.

Tidak semua katalis biologis adalah enzim protein: Katalis RNA seperti ribozim dan ribosom sangat penting untuk banyak fungsi seluler, seperti penjalinan RNA dan translasi. Perbedaan utama antara ribozim dan enzim adalah katalis RNA terdiri dari nukleotida-nukleotida, sedangkan enzim terderi dari asam-asam amino.  Ribozim juga mengkatalisis sejumlah reaksi yang terbatas, walaupun mekanisme reaksi  dan kinetikanya dapat dianalisis dan diklasifikasikan dengan metode yang sama.

Sejarah 

Pada tahun 1902 Victor Henri mengusulkan suatu teori kuantitatif mengenai kinetika enzim, namun signifikansi eksperimental dari konsentrasi ion hidrogen belum dikenal pada saat itu. Setelah Peter Lauritz Sørensen mendefinisikan skala-pH logaritmik dan memperkenalkan konsep pendaparan pada tahun 1909 kimiawan Jerman Leonor Michaelis dan Maud Leonora Menten mengulangi eksperimen Henri dan mengkonfirmasi persamaannya, yang saat ini dikenal secara umum sebagai kinetika Michaelis-Menten (atau terkadang kinetika Henri-Michaelis-Menten). Karya mereka kemudian dikembangkan lebih jauh oleh G. E. Briggs dan J. B. S. Haldane, yang menurunkan persamaan kinetik yang saat ini masih banyak dianggap sebagai titik awal pemodelan aktivitas enzimatik.

Kontribusi utama dari pendekatan Henri-Michaelis-Menten adalah pemikiran dua tahapan dalam reaksi enzimatik. Pada tahap pertama, substrat berikatan secara reversibel pada enzim, membentuk kompleks enzim-substrat. Kompleks ini kadang disebut sebagai kompleks Michaelis. Enzim kemudian mengkatalisis tahapan kimia dalam reaksi dan melepaskan produk. Kinetika banyak enzim cukup dijelaskan oleh model sederhana Michaelis-Menten, tetapi semua enzim memiliki gerakan internal yang tidak diperhitungkan dalam model dan dapat memberikan kontribusi signifikan terhadap keseluruhan kinetika reaksi. Hal ini dapat dimodelkan dengan memperkenalkan beberapa jalur Michaelis-Menten yang terhubung dengan tingkat fluktuasi, yang merupakan suatu perpanjangan matematika dari mekanisme dasar Michaelis Menten.

Prinsip umum 

Reaksi terkatalisis enzim menggunakan reaktan serta menghasilkan produk yang sama persis dengan reaksi tak terkatalisis. Layaknya katalis lain, enzim tidak mengubah posisi kesetimbangan antara substrat dan produk. Namun, tidak seperti reaksi tak terkatalisis, reaksi terkatalisis enzim menunjukkan fenomena kinetika penjenuhan. Untuk sejumlah konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat yang relatif rendah, laju reaksi meningkat secara linear seiring dengan penambahan konsentrasi substrat; molekul-molekul enzim sebagian besar bebas mengkatalisis reaksi, dan peningkatan konsentrasi substrat mengakibatkan peningkatan laju pula akibat pertemuan antara enzim dan molekul-molekul substrat.  Tetapi, pada konsentrasi substrat yang relatif tinggi, laju reaksi mendekati batas maksimum teoritis secara asimtot; sisi aktif enzim hampir semuanya terisi oleh substrat menyebabkan penjenuhan, dan laju reaksi menjadi ditentukan oleh laju pembalikan intrinsik enzim. Konsentrasi substrat di tengah-tengah dua kejadian pembatas ini disebut KM. Sehingga, KM dapat didefinisikan sebagai konsentrasi substrat di mana laju reaksi sama dengan setengah laju maksimum.

Dua ciri penting dari kinetika enzim adalah seberapa mudah suatu enzim dijenuhkan oleh substrat, dan laju maksimum yang dapat enzim tersebut capai. Dengan mengetahui ciri-ciri tersebut dapat diperkirakan apa peran suatu enzim dalam sistem seluler dan bagaimana enzim tersebut merespon perubahan-perubahan pada kondisi kerjanya.

Uji aktivitas enzim 

Uji aktivitas enzim adalah suatu prosedur di laboratorium yang mengukur laju reaksi enzimatik. Karena enzim tidak dikonsumsi dalam reaksi yang ia katalisis, uji aktivitas enzim biasanya melihat perubahan konsentrasi substrat atau produk untuk mengukur laju reaksinya. Ada berbagai metode pengukuran yang dapat dilakukan. Uji Spektrometri mengamati perubahan absorbansi cahaya antara produk dan reaktan; uji radiometri melibatkan inkorporasi atau pelepasan radioaktivitas untuk mengukur jumlah produk dihasilkan sepanjang waktu. Uji spektrometri dipandang paling memudahkan karena ia dapat mengukur laju reaksi secara kontinyu. Meskipun uji radiometri membutuhkan pemindahan dan penghitungan sampel (dengan kata lain ia adalah uji diskontinyu), uji ini sangat sensitif dan dapat mengukur tingkat aktivitas enzim yang sangat rendah. Pendekatan analog dari metode ini adalah menggunakan spektrometri massa untuk memonitor penggabungan atau pelepasan isotop stabil akibat perubahan substrat menjadi produk. Terkadang, pengujian yang dilakukan gagal dan pendekatan-pendekatan perlu dilakukan untuk menyelamatkan kembali pengujian tersebut.

Uji aktivitas enzim yang paling sensitif menggunakan laser yang difokuskan melalu suatu mikroskop untuk mengamati perubahan molekul enzim tunggal selama ia mengkatalisis suatu reaksi. Pengukuran ini menggunakan perubahan fluoresensi dari kofaktor pada mekanisme reaksi enzim, atau zat warna fluoresen yang ditambahkan pada posisi tertentu di protein tersebut untuk menunjukkan pergerakan yang terjadi selama katalisis. Kajian ini memberikan pandangan baru pada kinetika dan dinamika enzim tunggal, yang mana berlawanan dengan kinetika enzim tradisional yang mengamati perilaku rerata dari jutaan populasi molekul enzim.

Contoh kurva pergerakan dari uji aktivitas enzim ditunjukkan di atas. Enzim menghasilkan produk pada laju awal yang kurang lebih linear untuk sesaat setelah reaksi dimulai.  Seiring berjalannya reaksi dan substrat digunakan, laju reaksi berangsur melambat (selama substrat tidak berada pada tingkat penjenuhan). Untuk mengukur laju awal (dan maksimum), uji aktivitas enzim biasanya dilakukan ketika reaksi baru berjalan beberapa persen menuju penyelesaian total.  Panjang rentang laju awal bergantung pada kondisi pengujian dan dapat terentang dari beberapa milisekon hingga berjam-jam.  Biarpun begitu, alat untuk mencampur larutan dengan cepat dapat membantu pengukuran kinetika pada laju awal kurang dari satu detik. Pengujian yang luar biasa cepat ini sangat penting untuk mengukur kinetika pra-keadaan-tunak, yang akan dibahas di bawah.

Kebanyakan studi kinetika enzim berkonsentrasi pada bagian awal ini, kurang lebih pada bagian linear dari reaksi enzimatik. Tetapi, pengukuran kurva reaksi lengkap dan penyesuaian data-data tersebut pada persamaan laju non-linear juga dimungkinkan. Cara pengukurang reaksi enzimatik ini disebut analisis kurva-progres. Pendekatan ini berguna sebagai alternatif dari kinetika sesaat ketika laju awal terlalu cepat untuk diukur secara akurat.

Reaksi substrat tunggal

Mekanisme katalisis 

Model yang lebih disukai pada interaksi enzim–substrat adalah model ketepatan induksi. Model ini mengusulkan bahwa interaksi awal antara enzim dan substrat relatif lemah, tetapi interaksi lemah ini secara cepat menginduksi perubahan konformasi di dalam enzim yang memperkuat pengikatan. Perubahan konformasi ini juga membawa residu katalitik ke dalam sisi aktif yang dekat dengan ikatan kimia pada substrat yang akan diubah dalam reaksi ini. Perubahan konformasi dapat diukur menggunakan dikroisme sirkular atau interferometri polarisasi ganda. Setelah pengikatan berlangsung, satu atau lebih mekanisme katalisis menurunkan energi dari keadaan transisi reaksi dengan memberikan jalur kimia alternatif untuk reaksi tersebut. Mekanisme katalisis meliputi katalisis dengan regangan ikatan; dengan kedekatan dan orientasi; oleh donor atau akseptor proton aktif; kovalen katalisis dan terowongan kuantum.

Kinetika enzim tidak dapat membuktikan mode katalisis yang digunakan oleh enzim. Namun, beberapa data kinetik dapat menyarankan kemungkinan untuk diperiksa dengan teknik lain. Sebagai contoh, mekanisme ping-pong dengan kinetika fase pra-keadaan-tunak akan menyarankan katalisis kovalen mungkin penting dalam mekanisme enzim ini. Sebagai alternatif, pengamatan efek pH yang kuat pada Vmaks namun bukan Km mungkin menunjukkan bahwa residu di tempat yang aktif perlu berada dalam keadaan ionisasi tertentu agar terjadi katalisis.

Perangkat lunak

ENZO 
ENZO (Kinetika Enzim) adalah perangkat antarmuka grafis yang digunakan untuk membangun model kinetika reaksi yang dikatalisis enzim. ENZO secara otomatis menghasilkan persamaan diferensial yang sesuai dari skema reaksi enzim yang ditetapkan. Persamaan diferensial ini diproses oleh pemecah bilangan dan algoritme regresi yang sesuai dengan koefisien persamaan diferensial dengan kurva waktu pengamatan yang diamati secara eksperimental. ENZO memungkinkan evaluasi yang cepat terhadap skema reaksi saingan dan dapat digunakan untuk tes rutin pada kinetika enzim.

Lihat pula 
 Dinamika protein
 Difusi terbatas enzim
 Model adsorpsi Langmuir

Referensi 
Daftar pustaka

Catatan kaki

α. Tautan: Tutorial interaktif kinetika Michaelis–Menten (Java diperlukan) 

β. Tautan: Mekanisme dihidrofolat reduktase (Gif)

γ. Tautan: Mekanisme DNA polimerase (Gif)

δ. Tautan: Mekanisme kimotripsin (Flash diperlukan)

Bacaan lebih lanjut 
Pendahuluan
 
 
 

Terapan

Pranala luar 

 Animasi dari suatu uji enzim — Menunjukkan efek memanipulasi kondisi uji
 MACiE  — Basis data mekanisme reaksi enzim
 ENZYME — Basis data tata nama enzim Expasy
 ENZO — Aplikasi web untuk memudahkan konstruksi dan pengujian cepat model kinetik reaksi yang dikatalisis enzim
 ExCatDB — Basis data mekanisme katalitik enzim
 BRENDA — Basis data enzim komperhensif, pada substrat, inhibitor dan diagram reaksi yang diberikan
 SABIO-RK — Basis data kinetika reaksi
 Joseph Kraut's Research Group, University of California San Diego — Animasi berbagai mekanisme reaksi enzim
 Simbolisme dan Terminologi dalam Kinetika Enzim — Penjelasan komprehensif mengenai konsep dan terminologi dalam kinetika enzim
 Pendahuluan kinetika enzim — Kumpulan tutorial daring mengenai kinetika enzim yang mudah diakses
 Tutorial animasi kinetika enzim — Suatu tutorial animasi dengan audio

 
Katalisis