קיטוע DNA

קיטוע של DNA הוא הפרדה או שבירה של גדילי DNA לחתיכות, הנוצרים בכוונה על ידי אנשי מעבדה או על ידי תאים, או מתרחשים באופן ספונטני. קיטוע DNA ספונטני או מקרי יוצר מקטעי DNA המצטברים בהדרגה בתא. ניתן למדוד אותו למשל בעזרת אלקטרופורזה של תא יחיד (Comet assey) או על ידי סימון קצה 3 של DNA דו-גדילי שנשבר בעת חלוקת התא (בדיקת TUNEL).

גברים עם ליקויי תנועתיות זרע לעיתים קרובות הם בעלי רמות גבוהות של DNA מקוטע של הזרע.

מידת קיטוע ה- DNA בתאי הזרע יכולה לחזות את רמת ההצלחה להפריה חוץ גופית(IVF) וכן את הצלחת החדרת זרע לציטופלאזמה של תא ביצית (ICSI). מבחן פיזור כרומטין הזרע (SCD) ובדיקת TUNEL יעילים שניהם במציאת פגמים בDNA של הזרע. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, נראה כי בדיקת SCD רגישה יותר מבדיקת ה- TUNEL.

יחידות המדידה העיקריות שלו הן מדד הקיטוע של ה- DNA.
 במדד זה, 20% ומעלה מקטין משמעותית את שיעורי ההצלחה לאחר ICSI.

קיטוע ה- DNA תועד לראשונה על ידי ויליאמסון בשנת 1970, כאשר צפה בשברים אוליגומריים נבדלים המתרחשים במהלך מוות של תאים בתרביות כבד ראשוניות בילודים. הוא תיאר את ה- DNA הציטופלאזמי המבודד מתאי כבד של עכבר לאחר התרבית, כמאופיין בשברי DNA עם משקל מולקולרי המורכב מכפולות של 135 kDa. ממצא זה תואם את ההשערה לפיה שברי DNA אלה היו תוצר ספציפי של הידרדרות ה- DNA הגרעיני.

יצירה מכוונת

קיטוע דנ"א לרוב נחוץ לפני בניית ספרייה או תת-שיבוט לרצפי דנ"א. נעשה שימוש במגוון שיטות הכוללות שבירה מכנית של ה-DNA כאשר ה-DNA נקטע על ידי אנשי מעבדה.

השיטות לביצוע זאת הן בדיקת סוניקציה, גזירת מחט, ערפול (העברה למצב גזי), מעבר דרך תא לחץ צרפתי, העברת DNA בלחץ (Point-sink shearing).
 חיתוך ה-DNA בעזרת אנזימי רסטריקציה הוא שבירת גדילי ה-DNA המכוונת במעבדה. זהו טיפול מבוסס אנזים המשמש בביוטכנולוגיה לחיתוך דנ"א לגדילים קטנים יותר במטרה לחקור הבדלים באורך השברים בקרב אנשים או לצורך שיבוט גנים. שיטה זו מקטעת את ה-DNA על ידי קטיעה בו זמנית של שני הגדילים, או על ידי יצירת חתך בודד (nick) על כל גדיל מה DNA הדו-גדילי כדי לייצר חיתוך לקטעים של ה DNA הדו-גדילי.
 גזירה אקוסטית של העברת גלי אנרגיה אקוסטיים בתדירות גבוהה מועברת לספריית DNA. המתמר מעוצב בצורת קערה כך שהגלים מתכנסים ביעד המטרה.
 נבוליזציה מכריחה את ה-DNA לעבור דרך חור קטן ביחידת הנבוליזציה, מה שמביא ליצירת ערפל דק שנאסף. גודל השבר נקבע על ידי לחץ הגז המשמש לדחיפת ה-DNA דרך הנבוליזר, המהירות שבה תמיסת ה-DNA עוברת דרך החור, צמיגות התמיסה והטמפרטורה.
 סוניקציה, היא סוג של גזירה הידרודינמית, כפופה ל- DNA להיבקעות אקוסטית וגזירה הידרודינמית על ידי חשיפה לרגעים קצרים של סוניקציה, אשר בדרך כלל גורמת לשברים ב- DNA במקטעים בגודל של 700bp. לצורך קיטוע דנ"א, משתמשים בסוניקציה בדרך כלל בצורה של מחזורי חשיפה רגעיים (של ה DNA לסוניקציה) באמצעות סוג סוניקטור המתאים לשיטה.
 העברת הDNA בלחץ (Point-sink shearing), היא סוג של גזירה הידרודינמית, משתמשת במשאבת מזרק כדי ליצור כוחות גזירה הידרודינמיים על ידי דחיפת ספריית DNA דרך כיווץ פתאומי קטן בנפח. כ־90% מאורכי הקטעים נמנים בטווח הכפול.
 גזירת מחט יוצרת כוחות גזירה על ידי העברת ספריות DNA דרך מחט קטנה. ה-DNA עובר דרך המחט כמה פעמים כדי לקרוע את ה-DNA פיזית לחתיכות עדינות.
 תאי לחץ צרפתיים מעבירים DNA דרך שסתום צר בלחץ גבוה כדי ליצור כוחות גזירה גבוהים. באמצעות לחיצה צרפתית, ניתן לווסת את כוח הגזירה בזהירות על ידי התאמת לחץ הבוכנה. הלחיצה מספקת מעבר יחיד בנקודת כוח הגזירה המרבי, ומגביל את הנזק למבנים ביולוגיים עדינים עקב גזירה חוזרת, כפי שקורה בשיטות הפרעה אחרות.
 בקיטוע ה DNA בתיווך טרנספוזום, מכינים טרנספוזומים עם DNA שנחתך לאחר מכן כך שאירועי ההחלפה מביאים לדנ"א מקוטע עם מתאמים (במקום הכנסה אקטיבית). הריכוז היחסי של טרנספוזומים ו- DNA חייב להיות מתאים.

היווצרות ספונטנית

קטיעת ה- DNA במצב אפופטוטי הוא טבעי בתאים הבצעים אפופטוזה (מוות מתוכנן של תאים). קיטוע DNA הוא סימן היכר ביוכימי לאפופטוזה. בתאים גוססים, DNA נחתך על ידי אנדונוקלאז המפרק את הכרומטין ליחידות נוקלאוזומליות, שהן מכפלות של אוליגומרים של 180 זוגות בסיסים (bp) ונראות כסולם DNA בעת הפעלה על ג'ל אגרוז. . האנזים האחראי על קטיעת ה- DNA במצב אפופטוטי הוא ה- DNase המופעל על ידי קספאז. ה- CAD) Caspase-activated DNase), מעוכב בדרך כלל על ידי חלבון אחר, המעכב את ה- DNase המופעל על ידי ICAD) Caspase). במהלך אפופטוזה, גורם האפופטוזה caspase 3, caspase, חותך את ה- ICAD ובכך גורם להפעלת CAD. 

ה- CAD חותך את ה- DNA באתרים המקשרים בין גרעינים בין הגרעינים, מבנים המכילים חלבון המתרחשים בכרומטין במרווחים של ~ 180 bp. הסיבה לכך היא מכיוון שה- DNA בדרך כלל עטוף בצורה הדוקה סביב ההיסטונים, חלבוני הליבה של הנוקלאוזומים. אתרי הקישור הם החללים היחידים בגדיל ה- DNA שהם חשופים ובכך נגישים ל- CAD.

שימושים

קיטוע דנ"א לחתיכות ממלא חלק חשוב בזיהוי פלילי, במיוחד בהקשר של יצירת פרופיל דנ"א.
 פולימורפיזם של אורך מקטעי רסטריקציה (RFLP) היא טכניקה לניתוח אורכים משתנים של שברי DNA הנובעים מחיתוך דגימת DNA בעזרת רסטריקציה של אנדונוקלאז. האנדונוקלאז מבצע רסטריקציה החותכת את ה- DNA בתבנית רצף ספציפית המכונה אתר זיהוי לאנדונוקלאז. נוכחותם או היעדרם של אתרי זיהוי מסוימים בדגימת DNA מייצרים אורכים משתנים של חתיכות DNA, המופרדים באמצעות שיטת אלקטרופורזה בג'ל. לאחר מכן הם עוברים הכלאה עם מקטעים קטנים של בסיסים המשלימים לגדיל ה- probes) DNA) הנקשרות לרצף DNA משלים במדגם.
 באנליזת תגובת שרשרת של פולימראז (PCR) נוצרים מיליוני עותקים מדויקים של DNA מדגימה ביולוגית. משתמשים בזה כדי להגביר אזור ספציפי של גדיל DNA (יעד ה- DNA). רוב שיטות ה- PCR מגבירות בדרך כלל שברי DNA שגודלן בין 0.1 ל־10 קילו זוגות בסיסים (kb), אף על פי שטכניקות מסוימות מאפשרות הגברה של שברים בגודל של עד 40 קילו-בייט. PCR גם משתמש בחום כדי להפריד בין גדילי ה- DNA.
 דנ"א שנקטע במהלך אפופטוזה, שהוא בגודל של 1 עד 20 נוקלאוזומים, ניתן לבודד באופן סלקטיבי מהתאים הקבועים באתנול מקבע בדנטורציה.

הערות שוליים

DNA